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Funktionelle Charakterisierung des Ferredoxin Redoxsystems von Toxoplasma gondiiFrohnecke, Nora 05 April 2018 (has links)
Toxoplasmose ist weltweit eine der am häufigsten auftretenden parasitären Zoonosen mit einer geschätzten Infektionsrate von über 30%. Toxoplasma gondii (Phylum: Apicomplexa) besitzt ein Plastid ähnliches Organell, den Apicoplasten. In diesem befindet sich das einzig bekannte Redoxsystem, welches aus der Ferredoxin-NADP+-Reduktase und Ferredoxin (Fd) besteht. Fd als Elektonendonator liefert Elektronen an verschiedene essentielle Stoffwechselwege, wie der Isoprenoidvorstufen- und Liponsäuresynthese. Um die bei einem Elektronentransfer benötigte direkte Protein-Protein-Interaktion eingehend zu analysieren, wurde ein bakterielles Reverse Two Hybrid System verwendet, womit die Interaktion von TgFd und TgLipA gezeigt werden konnte. Da angenommen wird, dass Fd eine zentrale Rolle in verschiedenen Stoffwechselwegen übernimmt, ist für einen Fd Knockout ein komplexer biochemischer Phänotyp zu erwarten, der möglicherweise zum Absterben der Parasiten führt. Zur Untersuchung dessen wurden zwei komplementäre Wege verfolgt. Eine der Strategien basierte auf dem grundsätzlichen Nachweis, dass Fd unerlässlich für das Überleben von T. gondii ist. Mit Hilfe des DiCre Systems sollte ein definierter genetischer Fd Knockout hergestellt werden, welcher jedoch nicht zweifelsfrei generiert werden konnte. Bei der zweiten Strategie kam ein konditionales Knockdown System zur Anwendung, bei welchem die Expression des Fd Gens nach Induktion herabreguliert wird. Mit Hilfe dessen konnten weitreichende Auswirkungen der Fd Defizienz auf T. gondii gezeigt werden: die Fettsäuresynthese der im Apicoplasten synthetisierten Fettsäuren ist reduziert sowie die Motilität durch eine beeinträchtigte Isoprenoidsynthese verringert, wodurch insgesamt drastische Auswirkungen auf das Parasitenwachstum gezeigt werden konnten. Beide Stoffwechsel sind vom Elektronendonator Fd abhängig und durch die Fd Herabregulation betroffen. Die Ergebnisse unterstreichen die essentielle Rolle des Fd-Redoxsystems von T. gondii. / Toxoplasmosis is one of the most common parasitic zoonoses world-wide, around 30% of human beings are infected. Toxoplasma gondii (phylum: Apicomplexa) contains a unique intracellular organelle derived from plastids, called apicoplast. The only known redox system in the apicoplast consists of the ferredoxin NADP+-reductase and its redox partner, ferredoxin (Fd). The latter donates electrons to different essential metabolic pathways in the apicoplast like the last two enzymes of the isoprenoid precursor biosynthesis and the lipoic acid synthesis. To dissect protein protein interactions for an electron transfer a bacterial reverse two hybrid system was used. The physical interaction of both proteins TgFd and TgLipA could be shown.
Fd is supposed to play an important role in diverse metabolic pathways, hence a knock-out of the Fd gene is expected to generate a complex biochemical phenotype and be lethal to the parasite. Therefore two complementary approaches were used to analyze the role of TgFd in this context. The first strategy shall verify the essentiality of TgFd for the survival of T. gondii. It is based on the DiCre system whereby a defined genetic knock out of TgFd is produced. Respectives parasites have been generated, but at the end no genetic Fd knock out could be produced. In the second approach a conditional knock-down was generated, where the expression of the TgFd gene is repressed after induction. The Fd deficiency has wide ranging effects on T. gondii: The fatty acid synthesis of the apicoplast-synthesized fatty acids is reduced as well as the motility is decreased due to an affected isoprenoid synthesis. In total this leads to a dramatic inhibition of parasite growth. Both metabolic pathways depend upon the electron carrier Fd and thus are affected by Fd deficiency. The results underline the essential role of the ferredoxin redoxsystem of T. gondii.
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