Dans le domaine du diagnostic in vitro, l'étape d'extraction de micro-organismes à partir d'un échantillon complexe est une étape clé pour permettre l'identification du pathogène responsable d'une infection. Pour les septicémies, cette étape d'extraction est généralement précédée d'une étape de culture, ce qui conduit à une obtention des résultats au bout de plusieurs jours. Un résultat plus rapide (typiquement inférieur à 24h) permettrait d'augmenter le taux de survie des patients, et aurait ainsi une forte valeur ajoutée pour le corps médical. Le but de ces travaux est donc de développer une nouvelle méthode d'extraction et de concentration de pathogènes directement à partir d'un échantillon sanguin, sans étape de culture. Une stratégie en deux modules microfluidiques associés en série est proposée : elle repose sur la modification de la conductivité et de l'osmolarité de l'échantillon dans un premier module, puis sur la capture des micro-organismes par diélectrophorèse dans un second module. L'étude du premier module a permis de déterminer l'impact de la conductivité et de l'osmolarité du milieu sur les propriétés diélectriques des cellules. Deux voies ont ainsi été abordées, afin de diriger les cellules du sang et les micro-organismes vers un milieu de conductivité et d'osmolarité contrôlées : la dilution, et l'utilisation de forces acoustiques. L'étude du deuxième module a ensuite permis de démontrer la possibilité de capturer et concentrer des micro-organismes à partir d'un échantillon hypotonique et faiblement conducteur dans un écoulement microfluidique par diélectrophorèse. L'architecture d'un microsystème dédié a été définie grâce à un modèle numérique, puis validé expérimentalement avec des échantillons sanguins et différents micro-organismes (E. coli, S. epidermidis et C. albicans). La capture générique des micro-organismes est démontrée, et un taux de capture de 97% a été obtenu pour la séparation de \EC, avec une vitesse moyenne de l'échantillon dans le microsystème de 100 à 200 µm.s-1. Enfin, des perspectives d'amélioration sont présentées pour permettre d'effectuer cette étape de séparation sur un gros volume d'échantillon (1 à 10mL) en quelques heures, afin de répondre aux exigences imposées par l'urgence des tests de diagnostic des septicémies. / Extraction of pathogens from a biological sample is a key step for efficient diagnostic tests of infectious diseases. For bloodstream infections, current diagnostic methods are usually based on bacterial growth and take several days to provide valuable information. An accelerated result would have a high medical value to adjust therapeutic strategies. The aim of this study is to design a new approach for separation and concentration of microorganisms directly from a blood sample, to avoid time-consuming growth stages. We report a method based on two different microsystems connected in series: it combines modification of conductivity and osmolarity of the sample with generic capture of microorganisms by dielectrophoresis. First we explore the impact of conductivity and osmolarity on the dielectric properties of blood cells and microorganisms. Dilution and acoustic forces are both analyzed to transfer blood cells and microorganisms to the optimized buffer. Then we demonstrate the feasibility of achieving the dielectrophoretic separation of microorganisms from blood cells in a low conductivity and low osmolarity medium inside a fluidic device. The structure of the device is optimized with numerical simulations and experiments performed on blood samples and various microorganisms (E. coli, S. epidermidis and C. albicans).The generic capture of microorganisms is validated, and we achieved a separation of 97% efficiency with E. coli, with an optimal inlet velocity around 100-200 µm.s-1. Finally, we propose an improved microsystem to perform the sample preparation step on a larger volume (1-10mL) in a few hours, in order to fit the medical need.

Les micro et nanoparticules magnétiques sont de plus en plus utilisées en biologie et en médecine, pour une large gamme d'applications. Plusieurs applications utilisent le piégeage et le guidage de ces billes sous l'effet d'un champ et d'un gradient de champ magnétique. Dans la plupart des applications, le champ magnétique est macroscopique, créé par un aimant ou un électro-aimant. L'intégration plus poussée est souvent envisagée, dans les articles scientifiques, par des microbobines ou par des éléments magnétiques doux. Ceux-ci doivent alors être polarisés par un champ externe (de nouveau, un électroaimant ou un aimant).Les micro-aimants mis au point à l'Institut Néel permettent d'obtenir les mêmes inductions que les meilleurs aimants du marché et, par conséquent, de par la réduction d'échelle, des gradients de champ intenses et donc des forces volumiques très conséquentes. Ils sont, de plus, favorables à l'autonomie et à la stabilité du système.Ce travail propose d'utiliser ces micro-aimants pour des applications en diagnostic In Vitro afin de tirer parti des forces volumiques importantes issues des micro-aimants et de la facilité d'utilisation de telles sources de champ magnétiques pour l'utilisateur.Ces premières constatations nous ont permis de mettre un place un test de type ELISA en une seule étape. Grâce à ces avantages, il a été possible d'utiliser des nanoparticules magnétiques à la place des classiques microparticules comme rapporté dans l'état de l'art. Ces nanoparticules, fonctionnalisables par des anticorps permettent entre autre d'augmenter le rapport surface sur volume phénomène très favorable à la sensibilité des tests de diagnostic In Vitro. De plus, les nanoparticules étant de petite taille, il est possible d'augmenter fortement leur concentration et de favoriser ainsi la capture de ces particules par les micro-aimants grâce à un mécanisme d'interaction fluide/particule et in fine la cinétique du test.Un autre avantage des micro-aimants permanents est la possibilité de contrôler le champ magnétique sur des distances micrométrique. Cela ouvre la voie à des tests de diagnostic sans lavage, simples et sensibles. Enfin, tous ces avantages ont été combinés à ceux de la microfluidique pour permettre l'émergence de test portables tout en restant efficaces. Pour cela l'autonomie intrinsèque aux micro-aimants permanents sera un avantage incontestable. / The range of applications for magnetic micro- and nanoparticles is constantly expanding, in particular in medicine and biology. A number of applications involve particle trapping and deviation under the effect of a magnetic field and field gradient. In most publications, the required magnetic fields are produced either using soft magnetic elements polarized by an external magnetic field, electromagnets or bulk permanent magnets.Micromagnets produce high fields and favor autonomy and stability while downscaling leads to an increase of field gradients and consequently increase strongly the forces.Micromagnets developped at the Neel Institute produce magnetic induction as good as the best macro-magnets. Therefore, thanks to scale reduction laws, high field gradients and therefore intense forces can be obtained. Moreover, these magnets can easily be integrated in micro systems such as BioMEMS.The purpose of this work is to use these micromagnets to develop in vitro immunoassays.. An innovative system based on superparamagnetic nanoparticles attraction by micromagnets was developed in order to perform a “one step” ELISA.Nanoparticles can be functionalized with antibodies, increasing the surface/volume ratio, and therefore the test sensitivity. Thanks to their small size, the nanoparticles concentration can be increased, and a fluid/particles interaction optimizes their capture by the micromagnets. This phenomena is favorable to immunoassay's kinetics.A micrometric control of the magnetic field is possible thanks to micromagnets: this allows to design simple and sensitive immunoassays that need no washing steps. Finally, these properties combined to microfluidics is used to design of point of care and sensitive immunoassays.

L'utilisation des technologies haut débit est en train de changer aussi bien les pratiques que le paysage scientifique en microbiologie. D'une part la spectrométrie de masse a d'ores et déjà fait son entrée avec succès dans les laboratoires de microbiologie clinique. D'autre part, l'avancée spectaculaire des technologies de séquençage au cours des dix dernières années permet désormais à moindre coût et dans un temps raisonnable de caractériser la diversité microbienne au sein d'échantillons cliniques complexes. Aussi ces deux technologies sont pressenties comme les piliers de futures solutions de diagnostic. L'objectif de cette thèse est de développer des méthodes d'apprentissage statistique innovantes et versatiles pour exploiter les données fournies par ces technologies haut-débit dans le domaine du diagnostic in vitro en microbiologie. Le domaine de l'apprentissage statistique fait partie intégrante des problématiques mentionnées ci-dessus, au travers notamment des questions de classification d'un spectre de masse ou d'un “read” de séquençage haut-débit dans une taxonomie bactérienne.Sur le plan méthodologique, ces données nécessitent des développements spécifiques afin de tirer au mieux avantage de leur structuration inhérente: une structuration en “entrée” lorsque l'on réalise une prédiction à partir d'un “read” de séquençage caractérisé par sa composition en nucléotides, et un structuration en “sortie” lorsque l'on veut associer un spectre de masse ou d'un “read” de séquençage à une structure hiérarchique de taxonomie bactérienne. / Using high-throughput technologies is changing scientific practices and landscape in microbiology. On one hand, mass spectrometry is already used in clinical microbiology laboratories. On the other hand, the last ten years dramatic progress in sequencing technologies allows cheap and fast characterization of microbial diversity in complex clinical samples. Consequently, the two technologies are approached in future diagnostics solutions. This thesis aims to play a part in new in vitro diagnostics (IVD) systems based on high-throughput technologies, like mass spectrometry or next generation sequencing, and their applications in microbiology.Because of the volume of data generated by these new technologies and the complexity of measured parameters, we develop innovative and versatile statistical learning methods for applications in IVD and microbiology. Statistical learning field is well-suited for tasks relying on high-dimensional raw data that can hardly be used by medical experts, like mass-spectrum classification or affecting a sequencing read to the right organism. Here, we propose to use additional known structures in order to improve quality of the answer. For instance, we convert a sequencing read (raw data) into a vector in a nucleotide composition space and use it as a structuredinput for machine learning approaches. We also add prior information related to the hierarchical structure that organizes the reachable micro-organisms (structured output).

Dans le domaine du diagnostic in vitro, l'étape d'extraction de micro-organismes à partir d'un échantillon complexe est une étape clé pour permettre l'identification du pathogène responsable d'une infection. Pour les septicémies, cette étape d'extraction est généralement précédée d'une étape de culture, ce qui conduit à une obtention des résultats au bout de plusieurs jours. Un résultat plus rapide (typiquement inférieur à 24h) permettrait d'augmenter le taux de survie des patients, et aurait ainsi une forte valeur ajoutée pour le corps médical. Le but de ces travaux est donc de développer une nouvelle méthode d'extraction et de concentration de pathogènes directement à partir d'un échantillon sanguin, sans étape de culture. Une stratégie en deux modules microfluidiques associés en série est proposée : elle repose sur la modification de la conductivité et de l'osmolarité de l'échantillon dans un premier module, puis sur la capture des micro-organismes par diélectrophorèse dans un second module. L'étude du premier module a permis de déterminer l'impact de la conductivité et de l'osmolarité du milieu sur les propriétés diélectriques des cellules. Deux voies ont ainsi été abordées, afin de diriger les cellules du sang et les micro-organismes vers un milieu de conductivité et d'osmolarité contrôlées : la dilution, et l'utilisation de forces acoustiques. L'étude du deuxième module a ensuite permis de démontrer la possibilité de capturer et concentrer des micro-organismes à partir d'un échantillon hypotonique et faiblement conducteur dans un écoulement microfluidique par diélectrophorèse. L'architecture d'un microsystème dédié a été définie grâce à un modèle numérique, puis validé expérimentalement avec des échantillons sanguins et différents micro-organismes (E. coli, S. epidermidis et C. albicans). La capture générique des micro-organismes est démontrée, et un taux de capture de 97% a été obtenu pour la séparation de \EC, avec une vitesse moyenne de l'échantillon dans le microsystème de 100 à 200 µm.s-1. Enfin, des perspectives d'amélioration sont présentées pour permettre d'effectuer cette étape de séparation sur un gros volume d'échantillon (1 à 10mL) en quelques heures, afin de répondre aux exigences imposées par l'urgence des tests de diagnostic des septicémies.

Grâce à la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF, l'identification des bactéries est maintenant possible en quelques minutes. Mais le taux de mortalité des patients augmente lorsqu'une antibiothérapie inappropriée est utilisée et les instruments MALDI-TOF ne sont pas capables d'analyser rapidement et exhaustivement la résistance bactérienne. Actuellement, 6 à 24 heures sont nécessaires pour déterminer le phénotype de résistance. En couplant une chromatographie liquide et un spectromètre de masse à ionisation électrospray (LC-MS/MS), nous avons identifié les marqueurs de résistance en 1 à 2 heures. En 30 min, nous avons pu détecter les mécanismes de résistance aux β-lactamines, aux glycopeptides, à la méthicilline et aux fluoroquinolones, à l'aide de méthodes de type "Suivi de Réactions Sélectionnées", ou "Selected Reaction Monitoring" (SRM). Au cours de la même analyse multiplexée, des dizaines de protéines peuvent être détectées de façon hautement spécifique et sensible. Comme l'illustre l'étude de la résistance multifactorielle chez Acinetobacter baumannii, cette approche permet en outre une analyse quantitative d'un grand intérêt pour certains mécanismes de résistance. Cependant, malgré ces perspectives attrayantes, la LC-MS/MS reste, aujourd'hui, loin d'une possible implantation en routine dans les laboratoires de microbiologie. Les instruments sont trop coûteux et la technologie trop complexe pour un usage pour du diagnostic in vitro. La spectrométrie de masse pourrait déjà avantageusement compléter les technologies actuelles de biologie moléculaire. Aujourd'hui, le séquençage de nouvelle génération est la méthode de référence pour la caractérisation moléculaire des bactéries. Mais, comme démontré dans ce travail, l'annotation des gènes est perfectible. Pour quelques dizaines d'euros et quelques heures d'analyse, les peptides identifies par spectrométrie de masse facilitent l'assemblage des séquences (« scaffolds ») et la détection des gènes. De surcroît, la spectrométrie de masse permet une quantification précise des protéines. Elle apporte ainsi une nouvelle dimension analytique et une vision moléculaire plus proche du phénotype. En conclusion, la spectrométrie de masse LC-MS/MS peut être une technologie complémentaire attractive, voir une future alternative, à la biologie moléculaire pour la caractérisation des bactéries / Thanks to MALDI-TOF mass spectrometry, identification of isolated bacteria is now possible within a few minutes. But doctors also need to rapidly know the phenotype of resistance of the bacteria. Indeed, the patient mortality rate increases when the antibiotherapy is not appropriate. However, MALDI-TOF instruments are not able to analyze antibacterial resistance rapidly and comprehensively.Today, 6 to 24 hours are nedded for antibiotic susceptibility testing. When combining a liquid chromatography and a mass spectrometer with electrospray ionization (LC-MSMS), the detection of resistance biomarkers was possible within 1 to 2 hours. Using a Selected Reaction Monitoring (SRM) method, resistance mechanisms to beta-lactams, methicillin, glycopeptides and fluoroquinolones were detected in strains within 30 minutes. Tens of resistance determinants can be analyzed in a single multiplexed assay, with high specificity and sensitivity. Illustrated by the study of multifactorial resistance in Acinetobacter baumannii, the technology allows furthermore a quantitative analysis, which is of great value for some resistance mechanisms. Similarly, we identified virulent strains of enterohemorrhagic Escherichia coli by targeting toxins and serotype biomakers in the same assay. Mass spectrometry offered deeper bacterial characterization than conventional serotyping using polyclonal antibodies. However, despite all these favorable prospects, LC-MS/MS remains today far from reaching a routine use in microbiological hospital laboratories. Instruments are too expensive and the technology is too cumbersome for a daily in vitro diagnostic use. Waiting for a more suitable use, mass spectrometry could yet advantageously complement current molecular technologies. Today, the gold standard to study bacteria at molecular level is next generation sequencing. However, as demonstrated during this work, gene annotation remains imperfect. For tens of euros and few hours of analysis, peptides identified by mass spectrometry analysis of a bacteria might improve scaffold assembly and gene detection. Moreover, mass spectrometry gives an accurate protein quantitation and brings a new analytical dimension, potentially closer to the phenotype than molecular techniques. In conclusion, LC-MS/MS mass spectrometry could be an attractive complementary, or alternative technology in a near future, to conventional molecular biology techniques for deep characterization of bacteria