Los micoplasmas son bacterias sin pared celular que pertenecen a la clase Mollicutes. Estos microorganismos se caracterizan por su pequeño tamaño y por tener un genoma reducido con un bajo porcentaje de C+G. Muchas especies de mycoplasma actúan como parásitos y patógenos de un amplio rango de huéspedes, causando enfermedades comunes en humanos. Por ejemplo, Mycoplasma genitalium, objeto de esta tesis, es el causante de la uretritis no gonocócica. La secuenciación del genoma de algunos micoplasmas ha favorecido el conocimiento de la fisiología y genética de estos microorganismos, pero algunos mecanismos como la regulación de la expresión génica y la división celular siguen siendo aún un misterio por desvelar. M. genitalium, con tan sólo 525 genes, es considerado un modelo de célula mínima. Posee el genoma más pequeño de entre todas las bacterias que se pueden cultivar axénicamente, siendo así un candidato ideal para el estudio de los procesos biológicos con el mínimo número de genes implicados. El trabajo presentado en esta tesis se divide en tres capítulos independientes. En el primero se estudia la regulación de la expresión génica en M. genitalium y M. pneumoniae. El trabajo con M. pneumoniae fue llevado a cabo durante una estancia en el laboratorio del Prof. J. Stülke (Göttingen, Alemania). Este primer trabajo dio lugar a un artículo publicado en la revista Microbiology. La obtención de un mutante por transposición de M. genitalium que deleccionaba el gen ftsZ, descrito como esencial para la división celular en la mayor parte de bacterias, derivó en el segundo capítulo de esta tesis. En este segundo trabajo se investiga la división celular en micoplasma en ausencia de este gen. Este estudio ha sido publicado recientemente en la revista Molecular Microbiology. Por último, con el objetivo de profundizar en el tema de la división celular en micoplasma, en el tercer capítulo se analiza la funcionalidad del gen mraZ, que junto con mraW, mg223 y ftsZ conforma el operón de división celular de M. genitalium. / Mycoplasmas are the smallest and simplest free-living microorganisms. They are members of the Mollicutes class which is characterized by the absence of cell wall and by having genomes with a low G+C content. Despite this apparent simplicity, some mycoplasma species are parasites and pathogens of a wide range of hosts. For instance, Mycoplasma genitalium, which is the object of this thesis, is the agent of non-gonococcal and non-chlamydial urethritis. Genome sequencing has advanced the knowledge concerning the physiology and genetics of these microorganisms, but some mechanisms such as the regulation of gene expression and the cell division remain unclear. With only 525 genes M. genitalium is considered a model of minimal cell, since it has the smallest genome of any microorganism that can be grown in a pure or axenic culture. It is considered a perfect candidate to study biological processes with the minimal set of genes. This thesis is divided into three independent chapters. In the first one we study the regulation of gene expression in M. genitalium and M. pneumoniae. This work was published in 2007 in the journal "Microbiology". A minitransposon insertion was found in the ftsZ gene of M. genitalium, indicating that this gene was not essential for cell division in this microorganism. In the second chapter of this thesis we investigate the cell division process in M. genitalium in the absence of ftsZ. This work was recently published in the journal "Molecular Microbiology". Finally, to gain insight into the cell division process in mycoplasma, in the third chapter we analyze the function of the mraZ gene, which together with mraW, mg223 and ftsZ comprise the cell division operon of M. genitalium.

El Presente Trabajo de Título se enmarca dentro del proyecto de investigación Fondecyt Nº1080143 denominado “Effects of hydrophobic polypeptide tag fusion on protein purification by Hydrophobic Interaction Chromatography”, cuyo objetivo es determinar, cuantitativa y cualitativamente, el efecto de la fusión de polipéptidos hidrofóbicos en diferentes etapas del proceso de producción de proteínas recombinantes. Una de las etapas del proyecto, consiste en la optimización de las condiciones y el modo de operación del cultivo de Escherichia coli, que maximicen la productividad de cutinasas recombinantes. El microorganismo hospedero corresponde a Escherichia coliBL21 (DE3), cepa en la que se ha introducido el vector de expresión pET11a, el cual, bajo inducción, permite la producción de la proteína recombinante cutinasa a la que se han adicionado los aminoácidos triptófano(W), prolina(P) y tirosina(Y). Los polipéptidos hidrofóbicos adicionados son WPWP(Cutinasa-(WP)2) e YYY(Cutinasa-(Y)3). Las condiciones de cultivo en estudio, variables de entrada, corresponden a: temperatura de crecimiento y temperatura de inducción (25/18°C y 37/25°C), densidad celular en el punto de inducción (0,8 y 1,5 U Abs600nm ), concentración de inductor (0,1 y 0,5 mM IPTG); concentración de extracto de levadura (5 y 20 g/L), concentración de triptona (10 y 15 g/L) y concentración de glicerol (0 y 0,3 % v/v), en el medio de cultivo. Para realizar el estudio, se desarrolló un diseño experimental factorial fraccionario (26-2IV) que permite obtener información contundente respecto de los efectos principales de los factores (condiciones de cultivo) y sus interacciones (interacciones entre 2 factores) en cultivos batch en matraces. Se llevó a cabo la totalidad de experimentos establecidos en la malla de tratamientos, para las variantesCutinasa-(WP)2 y Cutinasa-(Y)3. Mediante un análisis estadístico de los resultados obtenidos se determinó la significancia de los factores y sus interacciones sobre la productividad y rendimiento (test ANOVA 95% nivel de significancia), se elaboró un modelo matemático lineal para estas variables en función de los factores e interacciones significativas y se determinaron las condiciones óptimas que maximizan la productividad y rendimiento para cada variante en particular, utilizando el modelo anteriormente nombrado. Los resultados obtenidos permitieron optimizar la producción de Cutinasa-(WP)2, sin inconvenientes, alcanzando una producción total de 28.870 [U Cutinasa-(WP)2/L] lo que equivale a 5,3 veces lo producido bajo las condiciones del caso base. El rendimiento optimizado fue 6,5 veces el rendimiento del caso base. Las condiciones óptimas de cultivo son: temperatura de crecimiento y temperatura de inducción, 37oC/25oC (Alto); densidad celular en el punto de inducción, 1,5 U Abs600nm(Alto); concentración de inductor, 0,1 mM IPTG (Bajo); concentración de extracto de levadura, 20 g/L (Alto); Concentración de triptona, 10 g/L (Bajo) y concentración de glicerol nula. El comportamiento errático de la variante Cutinasa-(Y)3 generó dificultades para modelar, predecir y optimizar la productividad y rendimiento de los cultivos. Se propone que las problemáticas de esta variante provienen de la cepa electrocompetente transfomada productora de Cutinasa-(Y)3. La comparación de los modos de operación en el fermentador Biostat B entregaron como resultado que el modo batch, para la variante Cutinasa-(WP)2, presentó mayor productividad específica total y rendimiento equivalentes a 2,5 y 1,4 veces la producción de fermentador operando en modo fed-batch con alimentación constante de nutrientes. En el caso de la variante Cutinasa-(Y)3, el modo de fermentación batch también fue el más favorable. Se concluye que todos los factores analizados tienen efectos significativos sobre la productividad y/o rendimiento de cutinasa recombinante en cultivos de E. coli BL21(DE3). Los factores e interacciones que poseen un efecto positivo y significativo sobre la productividad y/o rendimiento de ambas variantes corresponden a: densidad celular y sus interacciones con los factores temperatura de crecimiento e inducción y concentración de extracto de levadura. Los factores e interacciones que presentan efectos negativos y significativos sobre la productividad y/o rendimiento de ambas variantes son la concentración de inductor, concentración de triptona y la interacción concentración de glicerol-concentración extracto de levadura.