Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-06-16T14:28:34Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 605491 bytes, checksum: 3d6eb9f3a272ae7d5ab2a5509a143dac (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-16T14:28:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 605491 bytes, checksum: 3d6eb9f3a272ae7d5ab2a5509a143dac (MD5) Previous issue date: 2007-04-10 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / O vírus da doença infecciosa bursal (IBDV) é o agente etiológico de uma das mais importantes doenças para a indústria avícola mundial, e se caracteriza por ser altamente contagioso e produzir um estado de imunodepressão nas aves, trazendo falhas na vacinação e susceptibilidade a outras doenças, o que resulta em perdas econômicas ao setor avícola. O Brasil é o maior exportador de frango de corte do mundo o que motiva ao setor de sanidade avícola a oferecer alternativas de diagnóstico confiáveis, e rápidas, com tecnologia nacional. Por este motivo, a proposta do presente trabalho foi a produção de anticorpos monoclonais (AcM) de alta afinidade contra o vírus da doença infecciosa bursal (IBD), para uma possível utilização futura em testes de imunodiagnóstico do tipo imunofluorescência, imunohistoquímica ou ELISA de captura. Para a produção dos AcM se usou vírus inteiro proveniente de uma vacina comercial, estirpe intermediaria (Bur-706) o qual se multiplico em células VERO e foi purificado por ultracentrifugação em gradiente de sacarose, foi utilizado para a imunização dos camundongos BALB/c, usando como adjuvante saponina, o que permitiu a obtenção de anticorpos policlonais capazes de revelar a enzima por ELISA. A fusão das células esplênicas dos camundongos imunizados e o mieloma SP2/0 resultou na obtenção de 2 famílias de hibridomas (2H11 e 5C7) secretores de anticorpos. Após clonagem por diluição limitante, foram obtidos 3 clones secretores de AcM da classe IgG. Os três AcM obtidos foram capazes de revelar as proteínas virais VPX e VP2 por ”western blotting”, reconhecendo a proteína de 47 kDa e 41 kDa. A definição dos isótipos reconhecidos pelos AcM obtidos devem ser objeto de investigações futuras, de modo a permitir a utilização dos anticorpos em ensaios imunoenzimáticos para estudos epidemiológicos da doença o para diferenciar vírus vacinal e de campo. / The infectious bursal disease virus (IBDV) causes highly contagious and immunosuppressive disease for the world poultry, resulting in an impaired response to vaccination and susceptibility to other diseases, and severe economical losses to the poultry activity. Brazil is the world ́s largest exporter of chicken meat, condition which demands reliable and rapid procedures for diagnosis. The proposal of the present work is the production of monoclonal antibodies (MAbs) of high affinity against IBDV. The IBDV was strain S 706 (the intermediate vaccine) was replicated in VERO cell and purified by sucrose gradient, for ELISA and mice inoculation. For the immunization of the mice BALB/c using as a saponin adjuvant, that allowed an inflammation reaction which enhanced the antibody response, detectable by ELISA. The fusion of splenic cells of the immunized mice and the mieloma SP2/0 resulted in 2 hybridoma families (2H11 and 5C7). After cloning by limiting dilution, 3 clones secretors of MAbs from IgG class were obtained. The 3 obtained MAbs were capable to reveal the proteins turn VPX and VP2 by "western blotting", respectively of 47 kDa and 41 kDa. The definition of the isotypes recognized by obtained MAbs must be object of future characterization to allow the use of the antibodies in immunodiagnostic tests such as immunofluorescence, immunocitochemistry or capture ELISA, for epidemiologic of the disease researches or to differentiate vaccine’s virus of the field virus.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-19T11:33:37Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 14552 bytes, checksum: c7feb5483902e97430fd0ecfd37fc98b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-19T11:33:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 14552 bytes, checksum: c7feb5483902e97430fd0ecfd37fc98b (MD5) Previous issue date: 2005-03-18 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O vírus da doença infecciosa bursal é um importante agente patogênico de aves e desde 1962 tem estado relacionado com grandes prejuízos econômicos. Ainda hoje não foi estabelecido um protocolo de vacinação realmente eficiente e falhas na imunização das aves são geralmente descritas. Os motivos dessas falhas vem sendo pesquisados e as causas alegadas são desde o surgimento de cepas patogênicas por mutações na região do gene que codifica para a VP2, uso mal assessorado de vacinas pouco atenuadas e a reversão vacinal. Este trabalho teve como objetivo pesquisar e comparar a patogenicidade de isolados de campo com a de cepas vacinais. Foram testadas 21 amostras de bursa que foram submetidas à Unidade de Sanidade Avícola da Universidade Federal de Viçosa com suspeita de doença infecciosa bursal e três amostras vacinais. O isolamento viral foi realizado em células VERO, sendo o vírus isolado de 14,28% (3/21) das amostras de campo e de todas as amostras vacinais. As amostras foram padronizadas pela habilidade de provocar efeito patogênico em cultivo celular e foram inoculadas em ovos embrionados de 10 dias de idade. Amostras de fígado, rins, bursa, baço e intestino de cada um dos embriões foram coletadas durante 8 dias e as alterações macroscópicas avaliadas. Metade de cada amostra coletada foi mantida à 4°C e metade foi fixada com formol 10%. As amostras fixadas foram processadas pelo método de inclusão em parafina, coradas com hematoxilina e eosina e as alterações microscópicas avaliadas. Das amostras mantidas a 4°C foi extraído o RNA total pelo método do TRIzol e testadas pela técnica de RT- PCR. Nas observações anatomopatológicas os embriões inoculados apresentavam tamanho reduzido quando comparado aos embriões controle e órgãos com lesões sugestivas de danos vasculares. Nas análises histopatológicas, os órgãos linfóides apresentaram pronunciada depleção linfóide, os hepátocitos vacuolização citoplasmática e os rins estruturas basófilas dentro de túbulos. No teste de RT-PCR foi possível detectar a presença do ácido nucléico viral em todos os tecidos, sendo que a distribuição tecidual dos isolados de campo foi maior quando comparada aos isolados vacinais. Esses resultados revelaram não haver grande diferença quando comparadas as lesões causadas pelos isolados de campo com as lesões causadas por algumas amostras vacinais. Porém há distintos padrões de distribuição em tecidos que poderia indicar uma variação na atenuação de algumas amostras vacinais. Esses resultados sugerem que as amostras vacinais podem causar lesões características da doença e que o uso de determinada cepa, mais ou menos invasiva, deve ser avaliada com cuidado pelo profissional no campo. / The infectious bursal disease virus is an important pathological agent of poultry and since 1962 it has been related to great economical losses. Until now, an efficient vaccination protocol has not been established and faults in poultry immunization are generally described. These faults motifs are being searched and various causes have been quoted, from the emergence of pathogenic strains by mutations in the gene responsible for coding VP2, to bad usage of vaccines attenuated for low passage and vaccinal reversion. The aim of this work was to examine and compare field isolates pathogenicity with vaccinal strains. Twenty-one bursa samples suspicious of infectious bursal disease submitted to Unidade de Sanidade Avícola da Universidade Federal de Viçosa and three vaccinal samples were tested. The viral isolation was accomplished in VERO cells, the virus was isolated in 14,28% (3/21) of field samples and in all vaccinal samples. The samples were standardized by its ability to provoke pathogenic effect in cellular culture and were inoculated in 10 days embryonic eggs. Liver, kidney, bursa, spleen and gut samples of each embryo were collected during 8 days and the macroscopic alterations evaluated. Half of each collected sample was stored at 4°C and the other half was fixed with 10% formol. The fixed samples were processed by paraffin xinclusion method, dyed with hematoxilin and eosin and the microscopic alterations evaluated. Total RNA extraction was performed on those samples stored at 4°C by TRIzol method and tested by RT-PCR technique. In anatomopathological observations inoculated embryos presented reduced size when compared to control embryos and organs with characteristics lesions of vascular injury. In histopathological analysis lymphoid organs presented an accentuated lymphoid depletion, hepatocytes presented citoplasmatic vacuolization and kidneys basophiles structures inside tubules. In RT-PCR test was possible to detect the presence of viral nucleic acid in each and every tissues, and the distribution of field isolates was larger when compared to vaccinal isolates. The results revealed that there is not much difference between lesions caused by field isolates with lesions caused by some of vaccinal samples. However, there are distinct distribution patterns in tissues that could indicate a variation on attenuation in some vaccinal samples. These results suggest that vaccinal samples could cause characteristics disease lesions and that the use of a determinate strain more or less invasive should be evaluated with care by the field professional.