O experimento 1 objetivou estabelecer um modelo de estudo do desvio folicular, permitindo identificar o momento exato do início do desvio. Vacas das raças Nelore (NEL; n=11) e Holandês (HPB; n=10) tiveram emergência da onda folicular ovariana sincronizada e avaliação ultrassonográfica ovariana realizada a cada 12 h. Quando o maior folículo (F1) atingiu tamanho médio de início do desvio para sua raça (NEL: 6,5; HPB: 8,5 mm), em crossover, foram aleatorizadas em dois grupos (CON: Controle; ASP: Aspiração), com aspiração do F1 ASP e nas vacas do grupo CON não houve aspiração. Avaliações ultrassonográficas foram mantidas até 48h pós-desvio. Os dados foram analisados pelo PROC MIXED (P<=0,05). No grupo CON,12h após F1 atingir tamanho de desvio, diferiu em diâmetro com os demais (F2/F3), caracterizando desvio. Não foi observada diferença entre F1 na aspiração e F2 12h após, no grupo ASP nas duas raças. Não houve diferença entre F1 CON com F2 ASP após aspiração do F1. Todavia, F2 ASP apresentou maior diâmetro em relação ao F2 CON a partir de 12h após o momento do desvio, em ambas as raças. Foi realizada colheita de sangue em 0, 3, 6, 12 e 24h após aspiração, para avaliação da concentração plasmática de FSH e aumentou em 12h após aspiração do F1 ASP. O experimento 2, objetivou verificar expressão de genes associados ao desvio, CYP19A1 (Aromatase), receptor de LH (LHr) e PAPP-A (Pappalysin 1) em vacas NEL utilizando o mesmo modelo do experimento 1, entretanto obtendo células da granulosa por meio de lavagem intrafolicular. As vacas (n=10) tiveram emergência da onda sincronizada. Foram estabelecidos três tratamentos: 0h, o maior folículo atingiu 6,5 mm, e os dois maiores folículos foram aspirados (FD0h; FS0h); 12h, os dois maiores folículos (FD12h; FS12h) foram aspirados 12h após o maior atingir 6,5 mm; e grupo desvio, o maior folículo (FD0h) foi aspirado quando atingiu 6,5 mm, e o segundo maior (FS->FD) 12h depois. A suspensão contendo células da granulosa, foi centrifugada, o sobrenadante dosado para estradiol-17&beta; (E2) por ELISA. O pellet foi analisado para expressão de RNAm. Análise estatística foi realizada pelo PROC MIXED do SAS. Concentração de E2 (ng/mL) para FS->FD diferiu do FS0h e FS12h e não diferiu de FD0h e FD12h comprovando que FS->FD na ausência de um FD0h aumenta sua concentração de E2 semelhante aos folículos dominantes. Não houve diferença entre os grupos para a expressão relativa para PAPP-A e CYP19A1. Para LHr, houve tendência de aumento na expressão nos folículos FS->FD, quando comparados ao do grupo 0h. Não houve diferença entre FS->FD e o grupo 12h. FD12h diferiu do grupo 0h (FD0h e FS0h) e FS12h. Conclui-se que, o segundo maior folículo é capaz de se tornar dominante quando se aspira o maior folículo permitindo que se tenha estimativa mais segura do momento exato da dominância; também, ocorre um aumento no FSH plasmático 12h após a aspiração do maior folículo. O aumento na expressão de LHr foi o principal fator para o estabelecimento do desvio em vacas NEL. / This study was conducted in two experiments. Experiment 1 aimed to establish a manipulative model to study follicle deviation. Nelore (NEL n=11) and Holstein (HOL n=10) cows had the emergence of the wave synchronized. Ovarian ultrasonography was performed every 12h. When largest follicle (F1) reached the average size of deviation to its breed (NEL: 6.5; HOL: 8.5 mm), cows were randomized into two groups (CON: control; ASP: Aspiration) in a crossover design. F1ASP was aspirated, and for cows of CON group there was no aspiration. Ultrasound exams were maintained through 48h post-deviation. Data were analyzed using PROC MIXED (P<=0.05). In the CON group, 12h after F1 has reached deviation size, there was difference in diameter in relation to F2 and F3, characterizing deviation. There was no difference between diameters of F1 at the time of aspiration and F2 12h after in the ASP group for both breeds. There was no difference between the F1 from CON group with F2 ASP group after F1 aspiration. However, F2ASP had a bigger diameter compared to the CON group F2 12h after the time of deviation in both breeds. Blood samples were collected at 0, 3, 6, 12 and 24h after aspiration, to evaluate plasma concentrations of FSH. FSH increased at 12h after the F1 aspiration in ASP group. Experiment 2 was conducted to verify the expression of genes associated with follicle deviation, CYP19A1 (aromatase), LH receptor (LHR) and PAPP-A (Pappalysin 1) in NEL cows using same model of experiment 1, however by obtaining granulosa cells through intrafollicular flushing. Cows (n=10) had the wave emergence synchronized. Three treatments were established: 0h, when the biggest follicle reached 6.5 mm, the two biggest follicles were aspirated (DF0h; SF0h); 12h, the two biggest follicles (DF12h; SF12h) were aspirated 12h after the biggest follicle had reached 6.5 mm; and deviation group, biggest follicle (DF0h) was aspirated when reached 6.5 mm, and the second biggest follicle (SF->DF) was aspirated 12h later. The follicular fluid granulosa cells was centrifuged and supernatant was assayed for 17&beta;-estradiol (E2) concentration by ELISA. The pellet was analyzed for mRNA expression. Statistical analysis was performed using the SAS PROC MIXED. Concentration of E2 (ng/mL) for SF->DF differed from SF0h and SF12h and did not differ from DF0h and DF12h showing that SF->DF in the absence of a DF0h had an increased concentration of E2 similar to dominant follicles. There was no difference between groups for the relative expression of mRNA for PAPP-A and CYP19A1. For LHr expression, there was a tendency to increase in SF->DF follicles when compared to the group 0h. There was no difference between SF->DF and group 12h. DF12h differed from group 0h (DF0h/SF0h) and SF12h. In conclusion, second biggest follicle can become dominant when the biggest follicle is aspirated, allowing to have more reliable estimation of the exact moment of follicle deviation, associated with an increase in plasma FSH 12h after aspiration of the biggest follicle. Increased expression of LHr was the main characteristic of establishment of deviation in NEL cows.

O experimento 1 objetivou estabelecer um modelo de estudo do desvio folicular, permitindo identificar o momento exato do início do desvio. Vacas das raças Nelore (NEL; n=11) e Holandês (HPB; n=10) tiveram emergência da onda folicular ovariana sincronizada e avaliação ultrassonográfica ovariana realizada a cada 12 h. Quando o maior folículo (F1) atingiu tamanho médio de início do desvio para sua raça (NEL: 6,5; HPB: 8,5 mm), em crossover, foram aleatorizadas em dois grupos (CON: Controle; ASP: Aspiração), com aspiração do F1 ASP e nas vacas do grupo CON não houve aspiração. Avaliações ultrassonográficas foram mantidas até 48h pós-desvio. Os dados foram analisados pelo PROC MIXED (P<=0,05). No grupo CON,12h após F1 atingir tamanho de desvio, diferiu em diâmetro com os demais (F2/F3), caracterizando desvio. Não foi observada diferença entre F1 na aspiração e F2 12h após, no grupo ASP nas duas raças. Não houve diferença entre F1 CON com F2 ASP após aspiração do F1. Todavia, F2 ASP apresentou maior diâmetro em relação ao F2 CON a partir de 12h após o momento do desvio, em ambas as raças. Foi realizada colheita de sangue em 0, 3, 6, 12 e 24h após aspiração, para avaliação da concentração plasmática de FSH e aumentou em 12h após aspiração do F1 ASP. O experimento 2, objetivou verificar expressão de genes associados ao desvio, CYP19A1 (Aromatase), receptor de LH (LHr) e PAPP-A (Pappalysin 1) em vacas NEL utilizando o mesmo modelo do experimento 1, entretanto obtendo células da granulosa por meio de lavagem intrafolicular. As vacas (n=10) tiveram emergência da onda sincronizada. Foram estabelecidos três tratamentos: 0h, o maior folículo atingiu 6,5 mm, e os dois maiores folículos foram aspirados (FD0h; FS0h); 12h, os dois maiores folículos (FD12h; FS12h) foram aspirados 12h após o maior atingir 6,5 mm; e grupo desvio, o maior folículo (FD0h) foi aspirado quando atingiu 6,5 mm, e o segundo maior (FS->FD) 12h depois. A suspensão contendo células da granulosa, foi centrifugada, o sobrenadante dosado para estradiol-17&beta; (E2) por ELISA. O pellet foi analisado para expressão de RNAm. Análise estatística foi realizada pelo PROC MIXED do SAS. Concentração de E2 (ng/mL) para FS->FD diferiu do FS0h e FS12h e não diferiu de FD0h e FD12h comprovando que FS->FD na ausência de um FD0h aumenta sua concentração de E2 semelhante aos folículos dominantes. Não houve diferença entre os grupos para a expressão relativa para PAPP-A e CYP19A1. Para LHr, houve tendência de aumento na expressão nos folículos FS->FD, quando comparados ao do grupo 0h. Não houve diferença entre FS->FD e o grupo 12h. FD12h diferiu do grupo 0h (FD0h e FS0h) e FS12h. Conclui-se que, o segundo maior folículo é capaz de se tornar dominante quando se aspira o maior folículo permitindo que se tenha estimativa mais segura do momento exato da dominância; também, ocorre um aumento no FSH plasmático 12h após a aspiração do maior folículo. O aumento na expressão de LHr foi o principal fator para o estabelecimento do desvio em vacas NEL. / This study was conducted in two experiments. Experiment 1 aimed to establish a manipulative model to study follicle deviation. Nelore (NEL n=11) and Holstein (HOL n=10) cows had the emergence of the wave synchronized. Ovarian ultrasonography was performed every 12h. When largest follicle (F1) reached the average size of deviation to its breed (NEL: 6.5; HOL: 8.5 mm), cows were randomized into two groups (CON: control; ASP: Aspiration) in a crossover design. F1ASP was aspirated, and for cows of CON group there was no aspiration. Ultrasound exams were maintained through 48h post-deviation. Data were analyzed using PROC MIXED (P<=0.05). In the CON group, 12h after F1 has reached deviation size, there was difference in diameter in relation to F2 and F3, characterizing deviation. There was no difference between diameters of F1 at the time of aspiration and F2 12h after in the ASP group for both breeds. There was no difference between the F1 from CON group with F2 ASP group after F1 aspiration. However, F2ASP had a bigger diameter compared to the CON group F2 12h after the time of deviation in both breeds. Blood samples were collected at 0, 3, 6, 12 and 24h after aspiration, to evaluate plasma concentrations of FSH. FSH increased at 12h after the F1 aspiration in ASP group. Experiment 2 was conducted to verify the expression of genes associated with follicle deviation, CYP19A1 (aromatase), LH receptor (LHR) and PAPP-A (Pappalysin 1) in NEL cows using same model of experiment 1, however by obtaining granulosa cells through intrafollicular flushing. Cows (n=10) had the wave emergence synchronized. Three treatments were established: 0h, when the biggest follicle reached 6.5 mm, the two biggest follicles were aspirated (DF0h; SF0h); 12h, the two biggest follicles (DF12h; SF12h) were aspirated 12h after the biggest follicle had reached 6.5 mm; and deviation group, biggest follicle (DF0h) was aspirated when reached 6.5 mm, and the second biggest follicle (SF->DF) was aspirated 12h later. The follicular fluid granulosa cells was centrifuged and supernatant was assayed for 17&beta;-estradiol (E2) concentration by ELISA. The pellet was analyzed for mRNA expression. Statistical analysis was performed using the SAS PROC MIXED. Concentration of E2 (ng/mL) for SF->DF differed from SF0h and SF12h and did not differ from DF0h and DF12h showing that SF->DF in the absence of a DF0h had an increased concentration of E2 similar to dominant follicles. There was no difference between groups for the relative expression of mRNA for PAPP-A and CYP19A1. For LHr expression, there was a tendency to increase in SF->DF follicles when compared to the group 0h. There was no difference between SF->DF and group 12h. DF12h differed from group 0h (DF0h/SF0h) and SF12h. In conclusion, second biggest follicle can become dominant when the biggest follicle is aspirated, allowing to have more reliable estimation of the exact moment of follicle deviation, associated with an increase in plasma FSH 12h after aspiration of the biggest follicle. Increased expression of LHr was the main characteristic of establishment of deviation in NEL cows.

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Para a caracterização do transcrito do LHR, CG foram recuperadas de folículos dominantes de vacas das raças Gir (n=16) e Holandês (n=16). Após a PCR e o sequenciamento, os dados foram analisados para a presença de polimorfismos, frequência alélica, conteúdo de informação polimórfica (PIC) e Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE). Vinte e um polimorfismos de base única (SNPs) foram identificados, sendo 17 em Gir e 14 em Holandês. A classificação dos SNPs de acordo com os valores de PIC identificou 12 como altamente informativos em Gir e cinco em Holandês. Em relação a HWE, oito SNPs não estavam em equilíbrio em Gir e 10 em Holandês. Duas isoformas derivadas de splicing alternativo também foram identificadas, uma no éxon 1 e outra no éxon 10. Conclui-se que o LHR em bovinos leiteiros apresenta uma alta frequência de polimorfismos e múltiplas isoformas. Para avaliar o papel das isoformas do LHR nas CG durante a divergência folicular, a emergência da onda folicular foi sincronizada em novilhas Gir (n=10) e Holandês (n=10) e os folículos foram aspirados individualmente em diâmetros correspondentes aos períodos de pré-divergência, divergência, e pós-divergência. A expressão relativa das isoformas de LHR foi determinada por PCR em Tempo Real e os resultados foram relacionados com as concentrações intrafoliculares de estradiol (E2if). Em ambas as raças, houve um aumento progressivo na concentração de E2if ao longo do desenvolvimento folicular. O E2if foi maior em Holandês quando comparado com Gir antes, durante, e depois da divergência; mas foi similar em folículos de mesmo diâmetro nas duas raças. Observou-se um pico de expressão de LHR total após o início da divergência folicular. A expressão das isoformas de LHR foi ou baixa (Holandês) ou sub-regulada (Gir) durante este mesmo período. Os resultados sugerem que a divergência precoce do folículo dominante em raças de Bos indicus podem estar relacionados à maior sensibilidade ao feedback negativo do estradiol. Além disso, mudanças sequenciais na expressão das isoformas de LHR podem regular a função do LHR durante da divergência folicular em bovinos. A avaliação do comportamento das isoformas de LHR durante a indução exógena do crescimento folicular foi realizada em novilhas Gir caracterizadas com boa (n=5) ou má (n=5) resposta à superovulação. Em ambos os grupos, foram coletadas CG de folículos (8 mm) cujo crescimento ocorreu sem (Controle) ou com estimulação por FSH (SOV). No grupo de boa resposta, não houve diferença na expressão de LHR total entre os tratamentos Controle e SOV. No grupo de má resposta, a expressão de LHR total foi menor em SOV comparado com Controle, mas não houve diferença na expressão das isoformas. Conclui-se que o LHR é diferencialmente expresso em folículos dominantes de novilhas caracterizadas com boa ou má resposta a superovulação. / The aim of this study was to evaluate genomic and transcriptomic variations at the luteinizing hormone receptor (LHR) and its role at the follicular dominance establishment and superovulation outcome in bovine. Three experiments were performed, and for all evaluations cDNA synthesized from total RNA extracted from follicular granulosa cells (GC) were used. To characterize the LHR transcript, GC were recovered from dominant follicles from Gir (n=16) and Holstein (n=16) cows. After PCR and sequencing, data were analized to identify polymorphisms, allelic frequency, polymorphic information content (PIC) and Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE). Twenty one single nucleotide polymorphism (SNP) were identified, being 17 in Gir and 14 in Holstein. The classification of SNP according to PIC values identified 12 as highly informative in Gir and five in Holstein. Considering HWE, eight SNP were not in equilibrium in Gir and 10 in Holstein. Two isoforms were also identified, one in exon 1 and other in exon 10. We concluded that LHR in dairy cattle shows a high frequency of polymorphism and multiple isoforms. To evaluate the LHR isoforms role in GC during follicular divergence, the follicular wave emergence was synchronized in Gir (n=10) and Holstein (n=10) heifers and follicles were individually aspirated at the corresponding sizes of pre-, divergence, and post-. The relative expression of LHR isoforms was determined by real time PCR and results were correlated to the intrafollicular estradiol (E2if) concentrations. In both breeds, there was a progressive increase in E2if concentration during follicular development. The E2if in Holstein was higher when compared to Gir before, during, and after divergence; but was similar in follicles of same size in both breeds. We observed a peak for the total LHR expression after the beginning of the follicular divergence. The expression of LHR isoforms was low (Holstein) or under-regulated (Gir) during this same period. The results suggest that the early follicular divergence of the dominat follicle in Bos indicus breeds can be related to a higher sensitivity to the estradiol negative feedback. Besides, sequential changes in LHR isoforms expression can act regulating the LHR function during folicullar divergence in bovine. The evaluation of LHR isoforms behavior during the exogenous induction of follcilualr development was performed in Gir heifer previously characterized as good (n=5) or poor (n=5) responders to superovulation. In both groups, GC were collected from follicles (8 mm) which growth occurred without (Control) or with FSH stimulation (SOV). In good responders group, there was no difference in the LHR expression between the Control and SOV treatments. In the poor responders group, the total LHR expression was lower in SOV when compared to Control, but there was no difference in the expression of the isoforms. We concluded that LHR is differentially expressed in dominant follicles from heifers characterized as good or poor responders to superovulation.