La maladie de Steinert ou dystrophie myotonique de type 1 (DM1), dystrophie musculaire la plus commune chez l’adulte, est causée par l’expansion instable de triplets CTG dans la région 3’ non traduite du gène DMPK (Dystrophia Myotonica Protein Kinase). Cette maladie multisystémique, affectant principalement les muscles squelettiques et le cœur, est liée à l’épissage. En effet, les CUG exp forment des structures secondaires dans le noyau capables de séquestrer la protéine MBNL1, facteur d’épissage alternatif. En parallèle, un autre facteur d’épissage alternatif, CELF1 est stabilisé. La dérégulation de la balance entre ces deux protéines cause des défauts d’épissage, responsables de certains symptômes de la maladie, comme la myotonie, des défauts de conduction cardiaque et une résistance à l’insuline, causés respectivement par l’épissage aberrant du canal chlorure Clcn1, du canal sodique SCN5A et du récepteur à l’insuline IR. De plus, des dérégulations indépendantes de l’épissage sont aussi mises en jeu dans la DM1 mais leur responsabilité dans l’apparition des symptômes de la maladie reste à identifier. Pour identifier des dérégulations transcriptionnelles indépendantes de l’épissage mais liées à la progression et à la sévérité des symptômes, nous avons généré de nouveaux modèles drosophile de la DM1 avec un nombre croissant de répétitions CTG. Ces modèles étudiées au stade larvaire récapitulent les caractéristiques majeures de la DM1 : la formation de foci et une hypercontractilité musculaire. De plus, nous avons identifié dans ce modèle des dérégulations géniques indépendantes de l’épissage mais dépendantes du nombre de répétitions CTG. Notamment, une atténuation de Gbe1, codant pour une enzyme de branchement du glycogène pourrait participer aux phénotypes musculaires. Afin d’étudier les symptômes cardiaques de la maladie qui touchent 80% des patients et représentent la deuxième cause de mortalité, nous avons utilisé le modèle DM1 de drosophile développé dans notre équipe, et réalisé des analyses physiologiques cardiaques sur des mouches adultes qui expriment 960 CTG dans le cœur (Hand>DM1 960 ), un ARNi pour Mbl, l’orthologue de MBNL1, ou qui surexpriment l’orthologue de CELF1, Bru-3. Ces trois modèles DM1 reproduisent les symptômes cardiaques majeurs observés chez les patients comme des défauts de conduction, de l’arythmie (fibrillation) ou encore une cardiomyopathie dilatée. Afin d’identifier des dérégulations géniques susceptibles d’être responsables de ces défauts, nous avons réalisé une analyse transcriptomique par séquençage ARN après collection de l’ARN spécifique du cœur par la technique du TU-tagging. Les gènes dérégulés identifiés dans ces contextes ont été classés en fonction de leur conservation et du niveau de dérégulation. Parmi eux, la surexpression dans le cœur adulte de Straightjacket (Stj), l’orthologue de CACNA2D4 qui code pour une sous-unité d’un canal calcique voltage- dépendant, cause des défauts de conduction et de la fibrillation, mimant ce qui a été observé en contexte DM1 960 et gain de fonction pour Bru-3. Dans l’avenir, nous aimerions confirmer son implication dans la physiologie cardiaque et en particulier dans la DM1 en analysant son expression chez les patients présentant des défauts cardiaques similaires. / The most common muscular dystrophy found in adults, Steinert disease or Myotonic Dystrophy Type 1 (DM1) is caused by an unstable CTG repeat expansion in the 3’ untranslated region of the Dystrophia Myotonica Protein Kinase (DMPK) gene. This multisystemic disease, affecting particularly skeletal muscles and the heart, is called a spliceopathy because it involves the sequestration of the MBNL1 splicing factor by the expanded CUG-carrying transcripts and the stabilization of the CELF1 splicing factor. The misbalance of these two factors is responsible for splicing defects that cause most of the disease symptoms, like myotonia, conduction defects and arrhythmia but also insulin resistance, respectively associated to missplicing of Clcn1, SCN5A and IR. Moreover, DM1 toxicity is also associated to splice-independent deregulations but their link to disease symptoms remain poorly understood. To identify transcriptional deregulations independent of splicing and associated to disease progression and severity, we generated new DM1 Drosophila models with increasing number of CTG repeats. These larval models recapitulated the main DM1 muscular symptoms such as hypercontractility and foci formation and allowed us identifying gene deregulations independent of splicing. Among them, Gbe1 coding for a glycan branching enzyme is attenuated in the DM1 context in a CTG-repeat dependant manner and could participate in the severity of muscle phenotypes. To better understand the causes of cardiac symptoms that represent the second cause of death and affecting 80% of DM1 patients, we took advantage of our DM1 inducible Drosophila model and performed phenotypic analyses on the heart of adult flies expressing: 960 CTG specifically in the heart (Hand>DM1 960 ), a RNAi for the Drosophila MBNL1 orthologue (Muscleblind, Mbl) or overexpressing the CELF1 orthologue (Bruno-3, Bru3). These DM1 adult models display conduction abnormalities, arrhythmicity (fibrillation) and dilated cardiomyopathy (DCM). Thus, these three pathogenic contexts recapitulated collectively the main DM1 cardiac symptoms and prompted us to perform transcriptional profiling to identify symptom’s-associated gene deregulations. To identify new molecular actors responsible for the DM1 associated heart defects, we performed cardiac cell-specific transcriptional analyses by RNA-sequencing, using TU-tagging technique. Then, we selected deregulated candidate genes that could be linked to the particular observed phenotypes and ranked depending on their conservation and deregulation level. Among them, increased expression of Straightjacket (Stj), the CACNA2D4 orthologue, encoding a subunit of voltage- dependent calcium channel results in fibrillation and conduction defects, thus mimicking cardiac symptoms found in DM1 960 and Bru-3 gain of function contexts in which it was up- regulated. Whether identified candidates are deregulated in DM1 patients displaying cardiac abnormalities remains to be tested.

Les expansions du codon CAG (polyQ) sont impliquées dans neuf maladies neurodégénératives. Notre groupe a démontré que, lors de la traduction de la protéine ataxine-3 (Atx3) mutée qui est impliquée dans l’ataxie spinocérébelleuse de type 3 (SCA3), un changement du cadre de lecture vers un cadre décalé -1 (GCA) se produit. La traduction dans ce nouveau cadre de lecture entraine la production de polyalanine et ceci amplifierait la toxicité des polyQ. Le changement de cadre de lecture (ccl) ribosomique peut se produire des virus aux mammifères mais peu de choses sont connues sur son impact chez l’humain. Afin d’étudier ce phénomène dans la protéine Atx3 avec expansion de polyQ, nous avons établi un modèle de Drosophile transgénique et testé si c’était l’ARNm ou la protéine mutée qui était toxique. Nous avons aussi employé un essai de toeprinting (TP) afin d’identifier l’emplacement précis où les ribosomes changent de cadre de lecture sur l’ARNm. Nos résultats indiquent que la toxicité est due à la présence de polyalanines faisant suite au ccl et que l’ARNm en soi n’est pas la cause directe de la toxicité. De plus, nous avons observé que les ribosomes s’arrêtent au 48ième codon glutamine et que cet arrêt est spécifique aux polyQ. L’arrêt des ribosomes a d’ailleurs aussi été observé dans d’autres maladies avec expansions de polyQ. Puisque ces maladies ont des caractéristiques communes, un blocage de ce ccl pourrait atténuer les symptômes des patients SCA3 et d’autres maladies à expansions de polyQ / Coding CAG repeat disorders have been associated with nine neurodegenerative disorders. Our group has previously shown that during the translation of mutant ataxine-3 (Atx3), the protein involved in Spinocerebellar Ataxia type 3 (SCA3), a ribosomal frameshift occurs and leads to the reading of a GCA frame rather than a CAG frame. This new reading frame causes the production of polyalanine in the polyglutamine peptide which increases its toxicity. Ribosomal frameshifts are known to occur in all organisms but little is known about this phenomenon in human. To study ribosomal frameshift along the ATXN3 transcript, we generated a transgenic Drosophila model in which we looked at the toxicity of the mRNA. Also, we developed a toeprinting assay to precisely evaluate where the change of reading frame occurs along the mRNA. Our results suggest that the toxicity observed in our Drosophila model results from the production of polyalanine and not from the presence of the mRNA per se. Moreover, the change in reading frame seems to occur at the 48th CAG codon and this pausing of the ribosome also occurs in other polyQ tracts. Because CAG repeat disorders share many characteristics, an alteration of the frameshift could alleviate symptoms of SCA3 patients as well as of many other diseases with coding CAG repeats.

Les expansions du codon CAG (polyQ) sont impliquées dans neuf maladies neurodégénératives. Notre groupe a démontré que, lors de la traduction de la protéine ataxine-3 (Atx3) mutée qui est impliquée dans l’ataxie spinocérébelleuse de type 3 (SCA3), un changement du cadre de lecture vers un cadre décalé -1 (GCA) se produit. La traduction dans ce nouveau cadre de lecture entraine la production de polyalanine et ceci amplifierait la toxicité des polyQ. Le changement de cadre de lecture (ccl) ribosomique peut se produire des virus aux mammifères mais peu de choses sont connues sur son impact chez l’humain. Afin d’étudier ce phénomène dans la protéine Atx3 avec expansion de polyQ, nous avons établi un modèle de Drosophile transgénique et testé si c’était l’ARNm ou la protéine mutée qui était toxique. Nous avons aussi employé un essai de toeprinting (TP) afin d’identifier l’emplacement précis où les ribosomes changent de cadre de lecture sur l’ARNm. Nos résultats indiquent que la toxicité est due à la présence de polyalanines faisant suite au ccl et que l’ARNm en soi n’est pas la cause directe de la toxicité. De plus, nous avons observé que les ribosomes s’arrêtent au 48ième codon glutamine et que cet arrêt est spécifique aux polyQ. L’arrêt des ribosomes a d’ailleurs aussi été observé dans d’autres maladies avec expansions de polyQ. Puisque ces maladies ont des caractéristiques communes, un blocage de ce ccl pourrait atténuer les symptômes des patients SCA3 et d’autres maladies à expansions de polyQ / Coding CAG repeat disorders have been associated with nine neurodegenerative disorders. Our group has previously shown that during the translation of mutant ataxine-3 (Atx3), the protein involved in Spinocerebellar Ataxia type 3 (SCA3), a ribosomal frameshift occurs and leads to the reading of a GCA frame rather than a CAG frame. This new reading frame causes the production of polyalanine in the polyglutamine peptide which increases its toxicity. Ribosomal frameshifts are known to occur in all organisms but little is known about this phenomenon in human. To study ribosomal frameshift along the ATXN3 transcript, we generated a transgenic Drosophila model in which we looked at the toxicity of the mRNA. Also, we developed a toeprinting assay to precisely evaluate where the change of reading frame occurs along the mRNA. Our results suggest that the toxicity observed in our Drosophila model results from the production of polyalanine and not from the presence of the mRNA per se. Moreover, the change in reading frame seems to occur at the 48th CAG codon and this pausing of the ribosome also occurs in other polyQ tracts. Because CAG repeat disorders share many characteristics, an alteration of the frameshift could alleviate symptoms of SCA3 patients as well as of many other diseases with coding CAG repeats.

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) ou maladie de Steinert est la maladie génétique neuromusculaire la plus commune avec une incidence de 1/8000 à travers le monde. Cette maladie multisystémique touche particulièrement les muscles squelettiques (myotonie, faiblesse et perte musculaires) et le coeur qui présente des symptômes variés comme des troubles de la conduction et des arythmies. La DM1 est causée par une expansion instable de répétitions CTG dans la région 3’ non traduite du gène DMPK. Les individus sains possèdent entre 5 et 37 répétitions CTG tandis que les patients DM1 portent entre 50 et plusieurs milliers de répétitions. Il est bien établi que les expansions de répétitions non codantes forment des foci dans les noyaux musculaires où elles séquestrent le facteur d'épissage MBNL1. Toutefois, l'implication de la stabilisation et l'accumulation de CUGBP1 hyperphosphorylé par la PKC dans la maladie est un sujet controversé dans la communauté DM1. Dernièrement, en plus de la rupture de l'équilibre entre MBNL1/CUGBP1, plusieurs mécanismes ont été mis en cause dans la pathogenèse de la DM1. Parmi eux, l'expression perturbée de facteurs de transcription, la maturation altérée de miARNs, l'activation de kinases... chacune de ces altérations menant au final à une perturbation du transcriptome. Afin d'étudier l'effet de la toxicité des répétitions sur les phénotypes et lestranscriptomes, nous avons généré trois lignées de Drosophile inductibles et site-spécifiques exprimant 240, 600 et 960 répétitions de triplets. Nous avons travaillé en parallèle sur une lignée atténuée pour mbl (orthologue de MBNL1) et deux lignées gain de fonction bru -3 (orthologue de CUGBP1). Exprimées dans les muscles somatiques, les répétitions CTG conduisent à une mobilité réduite, le fractionnement des fibres musculaires, une réduction de leur taille et une altération du processus de fusion des myoblastes de manière dépendante de Mbl et Bru-3. En outre, l'expression des répétitions cause une hypercontraction musculaire dépendante de Mbl et due à un mauvais épissage de dSERCA. L'analyse transcriptionnelle comparative réalisée sur les muscles larvaires des différentes conditions pathologiques montre que l'atténuation de mbl reproduit 70-82% des dérégulations transcriptomiques des larves DM1 alors que le gain de fonction bru-3 représente 32-53% des altérations transcriptomiques des lignées DM1. Ainsi Mbl est un facteur clé des dérégulations observées dans les muscles somatiques des lignées DM1. Au contraire, les analyses physiologiques effectuées sur les coeurs adultes suggèrent que Bru-3 est un facteur clé dans la mise en place des phénotypes cardiaques. En effet, d'une part, l'atténuation de mbl dans le coeur cause une cardiomyopathie dilatée, un symptôme rarement diagnostiqué chez les patients. D'autre part, les lignées gain de fonction bru-3 et DM1 présentent de la fibrillation qui évolue avec l'âge ou la taille des répétitions vers un phénotype qui rappelle l'insuffisance cardiaque chez les patients. / Myotonic Dystrophy Type 1 (DM1) or Steinert's disease is the most common genetic neuromuscular disorder affecting 1 out of 8000 people worldwide. This multisystemic disease affects particularly the skeletal muscles (myotonia, muscle weakness and wasting) and the heart, which can exhibit various symptoms like conduction disturbances and arrhythmia (auricular fibrillation and flutter). DM1 is caused by an unstable CTG repeat expansion in the 3' non-translated region of the DMPK gene. In healthy individuals, the number of CTG repeats ranges from 5 to 37 whereas DM1 patients carry from 50 to thousands repeats. It is well established that when expanded non-coding repeats aggregate into foci within muscle nuclei and sequester the MBNL1 splicing factor. However, the involvement of the stabilization and accumulation of CUGBP1 following PKC hyper-phosphorylation in the disease is a controversial matter in the DM1 community. Lately, in addition to the disruption of the balance between MBNL1/CUGBP1, several mechanisms were identified as part of the DM1 pathogenesis. Among them, transcription factors perturbations, altered maturation of miRNA, kinases activation… each of them leading eventually to transcriptomic alterations. In order to investigate the effect of toxic repeat expression on phenotypic and transcriptomic alterations, we generated three inducible site-specific Drosophila lines expressing 240, 600 and 960 triplet repeats. We worked in parallel on a mbl (MBNL1 orthologue) knocked-down line and two bru-3 (CUGBP1 orthologue) gain of function lines. When expressed in somatic muscles, CTG repeats lead to altered motility, fiber splitting, reduced fiber size and affected myoblast fusion process in a Mbl and Bru-3 dependent manner. In addition, toxic repeats cause fiber hyper-contraction in a Mbldependentmanner due to dSERCA mis-splicing. Comparative transcriptional profiling performed on larval muscles of different conditions show that mbl attenuation reproduces 70-82% of DM1 transcriptomic deregulations whereas bru-3 gain of function represents 32-53% of transcritomic alterations. Thus Mbl appears as a key factor of transcripts deregulations observed in DM1 muscles. On the contrary, physiologic analyses performed on adult hearts suggest that Bru-3 is a key factor for cardiac phenotypes. Indeed, on one hand, mbl attenuated flies display dilated cardiomyopathy, a symptom barely diagnosed in patients. On the other hand, bru-3 gain of function line and DM1 lines display fibrillation, which evolves withage or repeat size into a phenotype reminiscent of heart insufficiency in patients.