Une altération de l’épissage alternatif est impliquée dans certaines pathologies telles que la Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1). La DM1 est une maladie génétique multisystémique appartenant à la famille des maladies à expansion de triplets. En effet, bien que non traduites, les expansions CUG localisées en 3’ des transcrits DMPK répriment l’exportation nucléaire de ces transcrits. Ce phénomène entraine notamment une dérégulation de l’activité de plusieurs facteurs régulateurs d’épissage parmi lesquels les familles CELF (CUGBP and ETR-3 like factor) et MBNL (MuscleBlind like). Cette dérégulation aboutit à un défaut d’épissage alternatif de nombreux transcrits, en particulier dans les muscles squelettiques, le cœur et le cerveau. On compte parmi ces transcrits dérégulés celui du gène MAPT codant pour les protéines Tau. Six isoformes de Tau, issues de l’épissage alternatif des exons 2, 3 et 10, sont principalement exprimées dans le cerveau adulte humain. Dans le cerveau DM1, ces exons sont préférentiellement exclus.La régulation et la dérégulation de l’épissage alternatif de l’exon 2 de Tau dans la DM1 peuvent être étudiées via l’utilisation de minigènes. Ces minigènes sont constitués de séquences Tau plus ou moins délétées insérées dans un vecteur plasmidique. Nous avons démontré que la nature de ce vecteur a une influence sur l’épissage. La construction de différents minigènes a donc permis de sélectionner celui le plus adapté à la recherche des séquences cis régulatrices de Tau. L’étude de ces minigènes démontre l’existence d’éléments cis répresseurs éloignés de l’exon, entre les nucléotides +500 et +2100 en aval de l’exon 2. Par contre, les éléments ciblés par les répétitions CTG dans la DM1 sont proximaux à l’exon 2, dans les 250 pb de part et d’autre de l’exon. Dans ces expansions CTG peuvent être séquestrés certains facteurs d’épissage tels que ceux de la famille MBNL. Dans notre modèle cellulaire, l’extinction de l’expression de MBNL1 ou l’utilisation de minigènes mutants MBNL démontrent que ces facteurs sont impliqués dans la régulation et la dérégulation de l’épissage de l’exon 2 de Tau. De plus, la surexpression de MBNL2 restaure un épissage normal de l’exon 2 en présence de la mutation DM1. Cette restauration est augmentée lorsque MBNL1 est également surexprimé suggérant un effet synergique de ces deux facteurs. Par la suite, nous avons étudié l’intervention d’autres familles de facteurs ubiquitaires ou impliqués dans les pathologies à expansion de triplets. Les facteurs conduisant à la dérégulation de l’exon 10 dans la DM1 n’étant que très peu connus, l’épissage du transcrit de Tau endogène a été analysé afin d’étudier à la fois les exons 2 et 10. Ainsi, de nouveaux facteurs impliqués dans la régulation de l’exon 2 (CELF2, 4 et 6, PTB1 et 2, Sam68, MBNL2) et de l’exon 10 (Sam68, MBNL2, Fox 1 et 2) ont été identifiés. Pour la première fois, l’implication des facteurs CELF5, SC35, SRp20, SRp75, 9G8 pour l’exon 2 et CELF3, hnRNPA1 et Fox1 pour l’exon 10 dans la restauration d’un épissage normal en présence de la mutation DM1 a été identifiée. En conclusion, les exons 2 et 10 de Tau, bien que tous deux dérégulés dans la DM1, sont régulés et dérégulés de façon différente. / Myotonic Dystrophy Type 1 (DM1) belongs to the group of pathologies referred as misregulated alternative splicing or spliceopathies. DM1 is a multisystemic inherited disease characterized by an unstable CTG-repeat expansion in the 3’ UTR of the DMPK gene. These CUG expansions are not translated, but they inhibit nuclear exportation of DMPK transcripts modifying in this way, the pool of available splicing regulating factors like CELF (CUGBP and ETR-3 like factor) and MBNL (Muscleblind Like) families. This deregulation leads to a default of alternative splicing of numerous transcripts, particularly in skeletal muscle, heart and brain. Beyond them, we focus on RNA from the microtubule-associated protein Tau (MAPT). In human brain, six Tau RNA variants have been described from alternative splicing of exons 2, 3 and 10. In DM1 brains, it has been reported a repression of the inclusion of these exons. The functionality of alternative splicing of Tau exon 2 in DM1 can be studied by the use of minigenes. These minigenes are constituted of Tau sequences more or less deleted, inserted in a plasmidic vector. We demonstrated that the nature of the vector has an influence on splicing. The construction of different minigenes permit to choose the one more adaptated to the research of cis-elements involved in both normal and pathological splicing of Tau RNAs. So, cis elements implicated in regulation of Tau exon 2 are distant of the exon (between nucleotides +500 and +2100 upstream exon 2). On the over hand, cis elements targeted by CUG repetitions in DM1 are close to exon 2 (in 25O nucleotides around exon 2). In this CUG expansions, some splicing factors like MBNL family members can be sequestered. In our cellular model, extinction of expression of MBNL1 and the use of minigenes mutants for MBNL sites show that these factors are implicated in both regulation and deregulation of Tau exon 2 alternative splicing. Moreover, over-expression of MBNL2 can restore a normal Tau exon 2 splicing in presence of DM1 mutation. This restoration is increased when MBNL1 is also over-expressed, suggesting a synergic effect between MBNL1 and MBNL2. Secondly, we studied the involvement of other families of splicing factors such as ubiquitary factors (SR, hnRNP) or factors implicated in others pathologies with triplets expansions (p68, Sam68, Fox). Exon 10 deregulation was very studied in FTDP-17 (Frontotemporal dementia and parkinsonism linked to chromosome 17) but not in DM1. So, Tau endogene has been analysed to study both exon 2 and 10. So, new factors implicated in regulation of exon 2 (CELF2, 4, 6, PTB1 and 2, Sam68, MBNL2) and 10 (Sam68, MBNL2, Fox 1 and 2) were identified. For the first time, the implication of the factors CELF5, SC35, SRp20, SRp75, 9G8 for exon 2 and CELF3, hnRNPA1, Fox1 for exon 10 in the restoration of a normal Tau splicing in presence of DM1 mutation have been identified. In conclusion, our data show that Tau exon 2 and 10, both alterated in DM1 pathology, are regulated and deregulated by different mechanisms.

Les intéines sont des éléments protéiques qui sont excisés d'une séquence polypeptidique par un processus autocatalytique appelé épissage. Les intéines monomériques ou dimériques effectuent respectivement des réactions d'épissage intra- et intermoléculaires. L'objectif du travail est de mettre au point une technique pour la création de banques de mutants de grandes tailles en combinant deux banques de fragments protéiques. La protéine monomérique est restaurée par épissage d'une intéine dimérique. Comme les déterminants qui permettent l'épissage des intéines ne sont pas encore bien connus, il a été décidé d'étudier l'épissage d'une intéine introduite dans la bêta-lactamase. Des collections de mutants ont été construites et caractérisées par sélection in vivo. Parmi les clones sélectionnés tolérant l'insertion de l'intéine, mais incapables d'épisser, un grand nombre présentent, à la jonction N-terminale, deux cystéines de part et d'autre de la liaison peptidique à cliver. L'hypothèse est que la liaison entre les deux cystéines se trouve dans une conformation non coplanaire permettant ainsi la formation d'un pont disulfure entre ces deux résidus. Cette conformation est probablement imposée par l'intéine de manière à déstabiliser la liaison peptidique et à favoriser ainsi son clivage dans le mécanisme d'épissage. D'autre part, les mutants capables d'épisser possèdent tous une glycine du côté N-terminal de l'intéine et une sérine du côté C-terminal de l'intéine. Ces deux acides aminés sont donc les seuls requis pour permettre un épissage efficace. Afin de déterminer si l'épissage intermoléculaire est possible, une des enzymes sélectionnées a été fragmentée au niveau de l'intéine. Bien qu'aucun produit d'épissage n'ait été détecté par Western Blot, une faible activité bêta-lactamase in vivo permet de supposer que l'épissage a eu lieu.

L'objectif de mon travail est de comprendre le rôle de Rrp6, une exoribonuclease 3'-5', dans l'expression des gènes. Dans ce but, j'ai utilisé le promoteur du virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1) comme modèle d'étude de la régulation des gènes chez les mammifères. En utilisant ce modèle dans le chapitre 1 des résultats, nous avons montré l'existence d'un nouveau mécanisme de répression de l'expression des gènes dépendant de l'ARN qui requiert les actions combinées de Rrp6 et du microprocesseur. A la suite de ce travail, nous avons caractérisé les complexes de protéines associés à Rrp6 qui contribuent à cette répression de la transcription (résultats - chapitre 2). Ces deux études suggèrent un rôle de Rrp6 dans la répression de la transcription au niveau du promoteur du VIH-1 mais aussi sur certains gènes cellulaires. Au cours des études présentées dans le chapitre 1, nous avons observé une forte diminution de l'expression de la protéine Dicer dans les cellules déplétées de Rrp6. Dicer est un élément central de la régulation de la maturation des microARN (miRNA) et donc joue un rôle important dans tous les processus cellulaires qui sont régulés par les miRNA, incluant de nombreux processus biologiques et physiologiques. Ainsi, il est important de connaitre les voies de régulation de Dicer. Dans le chapitre 3 des résultats, nous décrivons un nouveau mécanisme de régulation de Dicer par Rrp6. En effet, nos résultats montrent que Rrp6 est nécessaire pour un epissage efficace de l'ARNm de Dicer. Nos travaux décrivent un nouveau role de Rrp6 dans des processus cellulaires distincts: transcription et splicing / The objective of my doctoral work was to understand the role of a 3' to 5' exoribonuclease, Rrp6, in gene expression. I used the Human Immunodeficiency Virus (HIV-1) promoter as a model to study gene regulation in mammalian cells. Using this model, in Result-chapter 1, we demonstrated a novel mechanism of RNA-dependent transcriptional gene silencing that depends on the cooperative activities of Rrp6 and microprocessor. Following this study, we characterized the Rrp6-containing complex that contributes to the transcriptional silencing at HIV-1 promoter (Result-chapter 2). These two studies suggest a role for Rrp6 in transcriptional repression at the HIV-1 promoter and also at a subset of cellular genes. During the course of our studies presented in chapter 1, we observed a dramatic decrease of Dicer protein level in the cells depleted of Rrp6. Dicer is a central regulator of microRNA (miRNA) maturation and therefore exerts an important role in all cellular processes that are regulated by miRNAs, including diverse biological and physiological processes. Thus, it is important to know how Human Dicer1 is regulated. In Result-chapter 3, we describe a new regulatory mechanism of Dicer1 expression by Rrp6. Indeed, our results demonstrate that Rrp6 is required for efficient splicing of Dicer1 mRNA. Our work describes a novel role for Rrp6 in distinct cellular processes: transcription and splicing.

Les amplifications de répétitions de triplets CTG dans le gène DMPK humain sont à l'origine de la dystrophie myotonique de type 1 ou DM1. Les répétitions CUG présentes dans les ARNm DMPK séquestrent le facteur d'épissage MBNL1 au sein de foci nucléaires et dérégulent l'épissage des pré-ARNm cibles de MBNL1. Par ailleurs, 9 isoformes de MBNL1, produites par épissage alternative, coexistent dans les cellules. Dans un premier temps nous avons recherché quels exons constitutifs ou alternatifs étaient requis pour la reconnaissance des ARN, la régulation de l'épissage et la localisation cellulaire de MBNL1. Nous avons ensuite entrepris de rechercher par l'approche SELEX les séquences de haute affinité pour MBNL1. Nous avons ainsi identifié une séquence conservée de 12 nucléotides de long, contenant un seul motif de fixation pour MBNL1 et adoptant une structuration tige-boucle particulière. L'importance de cette structuration a été confirmée par l'existence de mutants compensatoires au sein des ARN sélectionnés. Finalement nous avons étudié les mécanismes de régulation de l'inclusion de l'exon 5 du pré-ARNm de la troponine T cardiaque humaine (hcTNT). Une approche in cellulo nous a permis d'identifier les séquences minimales requises pour la régulation de l'épissage en conditions normales et en présence des répétitions CUG. Au sein de ces séquences nous avons identifié 6 nouveaux sites MBNL1 dont nous avons montré l'importance fonctionnelle in cellulo et in vitro. Nous avons également mis en évidence l'implication d'autres séquences régulatrices dans la régulation de l'inclusion de l'exon 5 du pré-ARNm hcTNT et un rôle de la protéine hnRNP H dans ces régulations. L'ensemble de ces données apportent de nouveaux éléments d'information importants pour la compréhension de la DM1 / Amplifications of CTG motifs in the human DMPK gene are responsible for Myotonic Dystrophy of type 1. The resulting CUG repeats in pre-mRNAs capture the MBNL1 splicing factor, leading to mis-regulation of MBNL1 pre-mRNA targets. Due to the recent discovery of MBNL1 and its numerous isoforms (9) resulting from alternative splicing, little is known on how MBNL1 regulates splicing and how a decreased level of available MBNL1 generates splicing miss-regulations. First, we defined which of the MBNL1 alternative and constitutive exons are required for: i) RNA binding, ii) splicing activity and, iii) MBNL1 sub-cellular localization. Second, for a more precise definition of the MBNL1 RNA binding properties, we performed SELEX experiments using a library of RNA stem-loop structures containing a 18-nt long randomized sequence. Its leads to the identification of 12-nt long sequence adopting a peculiar stem-loop structure, whose importance for MBNL1 binding was revealed by its preservation by compensatory base-pair mutations. Finally, based on the above data, we studied the mechanisms involved in regulation of hcTNT exon 5 splicing. By in cellulo assays, we defined the hcTNT pre-mRNA region required for both normal inclusion and for the trans-dominant effect of CUG repeats. Within this region, we identified six new potential MBNL1 sites and demonstrated their functional role by in vitro and in cellulo assays. We also identified several additional splicing regulatory elements involved in normal and CUG-deregulated exon 5 inclusion and already showed a role of hnRNP H in splicing regulation. Altogether, our data bring new information important for understanding the pathology

Chez les organismes multicellulaires la diversité protéique dans chaque cellule et chaque tissu est obtenue initialement en régulant l’expression d’une partie des gènes d’un génome. Ces gènes sélectionnés peuvent ensuite être soumis à un épissage alternatif de sorte que certains exons sont retenus ou exclus dans l’ARNm final. Nous étudions les détails moléculaires de la protéine MEC-8, un facteur d’épissage tissu spécifique chez Caenorhabditis elegans. Les mutants MEC-8 sont responsables d’un phénotype insensible au touché chez Caenorhabditis elegans. Plus précisément, MEC-8 lie le pré-ARNm de mec-2 un composant des récepteurs mécanosensoriels afin de réguler la production d’un isoforme particulier nécessaire pour la transduction du signal mécanosensoriel. Des études portant sur le motif conservé de reconnaissance à l’ARN (RRM) chez des orthologues des vertébrés (RBPMS) et des insectes (couch potato, CPO) ont démontré la présence d’un motif d’homodimérisation dans le domaine RRM1 de MEC-8. Cependant MEC-8 contient aussi un second domaine RRM dans sa partie C-terminale, domaine qui n’est pas retrouvé dans les protéines RBPMS et CPO. Nous avons donc exprimé chaque domaine RRM de MEC-8 indépendamment ainsi que la protéine entière et ces constructions ont été utilisées pour diverses expériences biophysiques. Nous avons ainsi identifié la séquence de liaison optimale pour les deux domaines RRM1 et RRM2. Ces analyses ont aussi été menées sur les domaines homologues issus des protéines RBPMS et CPO qui présentent une forte affinité pour la même séquence d’ARN. Nous avons donc découvert que malgré des différences de fonction et de localisation les membres de la famille RBPMS lient tous le même motif d’ARN. Les détails atomiques des deux RRM en complexe avec leur motif de liaison ont été obtenus en utilisant de la spectroscopie RMN et de la cristallographique des rayons X. Les deux complexes RRM-ligand de MEC-8 présentent de surprenantes similarités dans leur architecture. / In multicellular organisms, proteomic diversity in each cell and tissue is provided initially by selective expression of gene subsets from the total genome, which are further subjected to alternative splicing, such that a different pattern of exons can be retained or excluded in the final protein coding mRNA. We are investigating the molecular details of the tissue-specific splicing factor protein MEC-8 from the worm Caenorhabditis elegans. The MEC-8 mutant protein is responsible for a touch insensitive phenotype in Caenorhabditis elegans, relating to its role as an alternative splicing factor. More precisely, MEC-8 can bind to the mec-2 pre-mRNA, a component of mechanosensory receptor, to regulate the production of a certain isoform required for transducing the touch signal. Previous studies of the conserved RNA Recognition Motif (RRM) domain in orthologues from vertebrate (RBPMS) and insect (couch potato; CPO) have demonstrated a homodimerization motif in MEC-8 RRM1. However, MEC-8 also contains a second RRM domain in the C-terminus that is not found in the characterized RBPMS and CPO proteins. We have therefore expressed the independent RNA-binding domains of MEC-8 as well as the full-length protein and have used these constructs in a variety of biophysical assays. We identified the optimal RNA binding sequence for both the RRM1 and RRM2, and quantified the penalty of sequence variations. The investigation has also been extended to the homologous domains from human RBPMS and Drosophila CPO, which show a high affinity to the same RNA sequence. We therefore find that despite differences in function and localization, the members of the RBPMS protein family all bind to the same RNA motif. Atomic details of binding have also been obtained by using a combination of NMR spectroscopy and X-ray crystallography. The ligand-bound complexes reveal a surprising similarity in the architecture of the bound ligand for the first and second RRM domains from MEC-8.

Le processus d'excision-épissage des RNAs pré-messagers (pré-mRNAs) est une étape essentielle dans l'expression de la majorité des gènes eucaryotiques. Lépissage se déroule dans le noyau au sein dun complexe macromoléculaire appelé spliceosome, ou particule dépissage, qui sassemble sur des sites précis le long des pré-mRNAs. Il consiste en cinq petites particules nucléaires ribonucléoprotéiques dénommées snRNPs (small nuclear Ribonucleoproteins) constituées de snRNAs (small nuclear RNAs) riches en uridines (U1, U2, U4/U6 et U5) et denviron 150 protéines associées (Patel et Steitz, 2003; Jurica et al., 2004). Lépissage requiert également de nombreuses protéines non constitutives des snRNPs appelées de manière générique facteurs essentiels dépissage. Parmi ceux-ci, les protéines SR constituent une famille de facteurs dépissage conservés chez les Eucaryotes (Barta et al., 2008; Long et Caceres, 2009). Ces protéines possèdent toutes un ou deux domaines de liaison au RNA appelé RRM (RNA Recognition Motif) en N-terminal et un domaine riche en dipeptides sérine et arginine (SR ou RS) en C-terminal. Elles jouent un rôle crucial dans lépissage constitutif et alternatif et ce, par un jeu complexe d'interactions protéine-protéine et protéine-RNA (Bourgeois et al., 2004; Reddy, 2007). Le mécanisme dépissage alternatif permet de produire différents mRNAs à partir dun seul pré-mRNA et de ce fait peut amener à la synthèse de plusieurs isoformes protéiques. Chez Arabidopsis de ~20 à 40% des pré-mRNAs sont épissés alternativement (Campbell et al., 2006; Wang et Brendel, 2006; Severing et al., 2009; Filichkin et al., 2010). Le séquençage complet du génome dArabidopsis a révélé que ~80% des régions codantes des gènes nucléaires sont interrompues par des introns (Iida et al., 2004) et a également permis lidentification de 19 protéines SR (Kalyna et Barta, 2004). Ces protéines sont classées en 7 sous-familles, certaines ayant leur homologue chez lhomme, dautres étant spécifiques aux végétaux (Kalyna et Barta, 2004). Le nombre de protéines SR est plus élevé chez Arabidopsis comparé à lhomme, chez qui on en dénombre seulement 11. Cela soulignerait des différences entre ces deux règnes au niveau des mécanismes dépissage et des facteurs impliqués dans ce processus. Les travaux antérieurs réalisés par immunofluorescence (Docquier et al., 2004) et par fusion traductionnelle avec la GFP (Green Fluorescent Protein) ont permis de montrer que les protéines SR dArabidopsis se localisent dans le noyau et présentent une organisation nucléaire en speckles (ou Splicing Factors Compartments, SFCs) et ce dans différents types cellulaires (Ali et al., 2003; Docquier et al., 2004; Fang et al., 2004; Tillemans et al., 2005). Les speckles sont considérés comme des sites de stockage et/ou dassemblage des complexes dépissage (Lamond et Spector, 2003). La phosphorylation des protéines SR joue un rôle important dans la régulation de leur localisation et de leurs fonctions. Une hyper- ou hypophosphorylation réduit leur activité générale suggérant que leur niveau de phosphorylation est strictement régulé in vivo (Misteli et Spector, 1996; Lai et al., 2003; Lin et al., 2005). Ainsi, la relocalisation des protéines SR au sein des speckles est activement dépendante de leur état de phosphorylation (Misteli, 2000; Docquier et al., 2004; Huang et Steitz, 2005; Tillemans et al., 2005). Le flux des facteurs nucléaires au sein de ces compartiments et leurs interactions transitoires et rapides soulignent une organisation spatiale et temporelle très dynamique (Eils et al., 2000; Phair et Misteli, 2000; Dundr et Misteli, 2001). Le but de cette thèse de doctorat est détablir un profil dexpression précis de RSZp22 au cours du développement de la plante, de caractériser les propriétés nucléocytoplasmiques de RSZp22 et enfin définir les rôles des domaines de liaison au RNA dans sa dynamique. RSZp22 est un homologue de la protéine 9G8 humaine. Cette protéine SR possède un domaine Zn-knuckle à motif CCHC localisé entre un domaine RRM unique et le domaine RS. Le domaine RRM reconnait les séquences activatrices dépissage présentes sur les exons (ESEs Exonic Splicing Enhancers) alors que le domaine RS est impliqué dans les interactions protéine-protéine et protéine-RNA (Shen et al., 2004). Le rôle du Zn-knuckle, qui se retrouve dans deux sous-familles de protéines SR dArabidopsis (RSZ et RS2Z), nest pas encore bien caractérisé et les spécificités dinteractions des domaines RRM et Zn-knuckle nont pas encore été étudiées. Parmi les protéines SR étudiées, RSZp22 semble être la seule à se localiser et se concentrer au sein du nucléole selon les conditions physiologiques dans lesquelles la cellule se trouve (Tillemans et al., 2005). Les travaux réalisés récemment au laboratoire montrent que RSZp22 fusionnée à la GFP et surexprimée transitoirement dans des cellules foliaires est une protéine hautement dynamique. Sa mobilité dépend du niveau de phosphorylation et de la concentration en ATP de la cellule. Le développement puis lutilisation des approches de FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) et de FLIP (Fluorescence Loss In Photobleaching) ont permis de suggérer que RSZp22 est une protéine SR dynamique et quelle peut transiter entre le noyau et le cytoplasme. RSZp22 ferait ainsi partie des protéines SR dites navettes comme, entre autres, son homologue humain 9G8 (Tillemans et al., 2006). Basés sur la délétion de domaines entiers de la protéine, nos travaux montrent également que le domaine RS est impliqué dans lorganisation en speckles des protéines SR dArabidopsis au sein du nucléoplasme et quil jouerait le rôle de signal de localisation nucléaire (NLS Nuclear Localisation Signal). Cette étude suggère aussi que le domaine RRM nest pas indispensable pour lorganisation en speckles de RSZp22 et que le domaine Zn-knuckle interviendrait dans lexportation de la protéine (Tillemans et al., 2006). Les études antérieures de la dynamique des protéines SR d'Arabidopsis et en particulier de RSZp22 ont été réalisées après surexpression ectopique -et quelquefois hétérologue- des facteurs d'épissage. Dans cette étude, nous avons exprimé la protéine RSZp22-GFP sous le contrôle du promoteur endogène RSZp22 après transformation stable dArabidopsis. Parallèlement, une analyse de RT-PCR quantitative et lutilisation du gène rapporteur -glucuronidase (GUS), nous ont permis d'établir un profil dexpression précis de RSZp22 et de complémenter -et valider- la localisation tissulaire de la protéine de fusion. Nous avons ensuite étudié en plantes transgéniques, la dynamique de la protéine RSZp22-GFP dans des types cellulaires spécifiques. Par analyses de FLIP cytoplasmique (dénommé FLIP-shuttling), nous avons démontré que RSZp22 est bien une protéine SR navette nucléocytoplasmique et établi une cinétique d'exportation. Nous avons également confirmé que son exportation vers le cytoplasme est partiellement dépendante de la voie du récepteur CRM1/XPO1. Notre travail a ainsi permis de mettre en évidence les avantages complémentaires des techniques de surexpression en transformation transitoire et de lexpression stable et spécifique pour létude de la dynamique des protéines nucléaires. Enfin, nous avons montré par mutagenèse dirigée que les motifs RNP1 et Zn-knuckle ne sont pas nécessaires pour la localisation nucléaire de la protéine RSZp22 ni pour sa concentration en speckles. Ces motifs de liaison au RNA sont cependant impliqués dans lexportation de RSZp22 par la voie CRM1/XPO1. De plus, les expériences de FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfert) indiquent que ces motifs interviennent dans les interactions moléculaires impliquant RSZp22. Ainsi, ce travail a permis de caractériser la dynamique nucléocytoplasmique de RSZp22 dans des tissus spécifiques dArabidopsis et de mettre en évidence limportance de son interaction avec le mRNA pour son exportation par la voie CRM1/XPO1.

L'épissage alternatif est un processus biologique qui génère la diversité du protéome malgré le nombre limité de gène. Ce mécanisme régule à la fois les gènes de manières qualitatives (isoformes exprimées) mais aussi quantitatives (niveau d'expression). Avec le développement des technologies de séquençage à haut débit, il est maintenant possible d'étudier à large échelle les aspects quantitatif et qualitatif du transcriptome avec une même expérience (RNA-seq). Durant ma thèse, j'ai développé une nouvelle méthode d'analyse de l'épissage alternatif dans les données RNA-seq. J'ai également participé à la mise en place du pipeline global d'analyse de données RNA-seq (expression et épissage) qui a été utilisé pour analyser un grand nombre de jeux de données. Dans un second temps, nous avons comparé notre outil d'analyse de l'épissage, FaRLine, qui est basé sur l'alignement sur un génome de référence, à KisSplice, une méthode basée sur l'assemblage. Nous avons montré que ces méthodes trouvaient un grand nombre d'événements en communs (70%), mais qu'il existait des différences non négligeables dues à la méthodologie. Nous avons analysé et classifié ces événements en 4 grandes catégories. Les variants faiblement exprimés et les exons chevauchant des éléments répétés sont mieux annotés par les méthodes basées sur l'alignement. Alors que les méthodes basées sur l'assemblage trouvent des nouveaux variants (exons ou sites d'épissage non annotés) et prédisent de l'épissage alternatif dans les famille de gènes paralogues. Notre travail souligne les points qui nécessitent encore l'amélioration des méthodes bioinformatiques. Enfin, j'ai participé au développement de méthodes permettant d'aider les biologistes à évaluer l'impact fonctionnel de modification d'épissage, que ce soit au niveau de la protéine produite (annotation des domaines protéiques au niveau des exons), ou à un niveau plus global en intégrant les modifications d'épissage dans les voies de signalisation / Alternative splicing is the biological process that explain the large diversity of the proteome compared to the limited number of genes. This process allow a qualitative regulation (expressed isoforms) and a quantitative regulation (expression level). The growth of high-trhoughtput sequencing methods enabled the analysis of these two aspects (quantitative and qualitative regulation) with the same experiment (RNA-Seq). During my PhD, I developped a new tool to analyse alternative splicing from RNA-Seq data. I also participated in the automatisation of the complet pipeline of RNA-Seq analysis (expression and splicing). This pipeline has been used to analyse various datasets. Then, we compared our mapping-first tool, FaRLine, with an assembly-first method, KisSplice. We found that the predictions of the two pipelines overlapped (70\% of exon skipping events were common), but with noticeable differences. The mapping-first approach allowed to find more lowly expressed splicing variants, and was better in predicting exons overlapping repeated elements. The assembly-first approach allowed to find more novel variants, including novel unannotated exons and splice sites. It also predicted AS in families of paralog genes. Our work point out where the bioinformatic improvment are still needed. Finally, I participated in the developpement of bioinformatics methods to help biologists to evualuate the fonctionnal impact of splicing alteration : at the level of the protein product by annotating fonctionnal domain at the exon level or at a more global level, by integrating splicing modifications in signaling pathways

Les petites particules ribonucléoprotéiques nucléaires (snRNPs) sont les composants majeurs du splicéosome, la machinerie responsable de l'épissage des pré-messagers. La biogenèse des snRNPs est un processus complexe qui fait intervenir de nombreux facteurs comme les protéines SMN et ICln. Au cours de ma thèse, je me suis intéressé à l'étude du rôle de ces deux protéines dans la maturation et la production des snRNPs du splicéosome.Dans la première partie de mon travail, les modifications internes des snRNAs ont été caractérisées dans des cellules dont les corpuscules de Cajal sont dispersés à cause d'une déficience de la protéine SMN. En effet, en plus de son rôle dans les étapes précoces de formation des snRNPs, la protéine SMN est également requise pour la formation des corpuscules de Cajal, structures nucléaires qui concentrent les scaRNAs impliqués dans le processus de modification post-transcriptionnelle des ARNs. Nous avons pu ainsi montrer que la protéine SMN et les corps de Cajal ne sont pas essentiels à la production des résidus 2'-O-methyl et pseudouridine dans les snRNAs majeurs et mineurs.La deuxième partie de mon travail a porté sur l'étude des relations fonctionnelles entre les protéines ICln et SMN in vivo en utilisant l'organisme modèle S. pombe. Après avoir caractérisé un homologue de la protéine humaine dans la levure fissipare, nous avons montré que la protéine ICln n'est pas essentielle mais est importante pour une croissance optimale des cellules de levure. Notre étude montre aussi que la modulation de l'activité de la protéine ICln ne permet pas de compenser les défauts dans la production de snRNPs observés dans les cellules portant un allèle muté de SMN. Finalement, l'utilisation d'une approche génomique montre que la délétion du gène ICln entraine des défauts différentiels d'épissage, indiquant que le choix des sites et la cinétique d'épissage sont fortement dépendants de la concentration des composants de base du splicéosome. / Small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) are the major components of the spliceosome, the machinery responsible for the splicing of pre-messenger RNAs. The biogenesis of snRNPs is a complex process that involves many factors such as the SMN and ICln proteins. During my thesis, I studied the role of these two proteins in the maturation and the production of the spliceosome snRNPs.The goal of the first part of my work was to characterize the internal modifications of snRNAs in SMN-deficient cells carrying disrupted Cajal bodies. Indeed, in addition to its role in the early stages of snRNPs assembly, the SMN protein is also required for the formation of Cajal bodies which are nuclear structures carrying the scaRNAs involved in the post-transcriptional modification process of RNAs. We could show that the SMN protein and Cajal bodies are not essential for the formation of 2'-O-methyl and pseudouridine residues in the major and minor snRNAs.In the second part of my work, the functional relationships between the ICln and SMN proteins were examined in vivo using the S. pombe model organism. We first identified a fission yeast homologue of the human ICln protein and found that the ICln protein is not essential but important for optimal growth of yeast cells. Our study also showed that the modulation of the activity of the ICln protein does not compensate for defects in the production of snRNPs observed in yeast cells carrying a SMN mutated allele. Finally, the use of a genome-wide approach allowed us to show that deletion of the ICln gene resulted in differential splicing defects, indicating that the choice of splice sites and the kinetics of splicing are strongly dependent on the concentration of the basic components of the spliceosome.

L’épissage, une étape majeure de l’expression des gènes, consiste en l’élimination des introns et la production de transcrits matures ou ARNm. La régulation ou des perturbations de l’épissage sont impliquées dans de nombreuses situations physiopathologiques. Dans ce travail, j’ai utilisé et analysé par des approches de bio-informatiques un grand nombre de données générées à large échelle afin de mieux définir les règles gouvernant la reconnaissance des exons au cours de l’épissage. Je montre que les mécanismes de reconnaissance des exons dépendent du biais de la composition nucléotidique des gènes qui les hébergent. Ainsi, la reconnaissance des exons hébergés par des gènes enrichis en guanine et cytosine dépend essentiellement de leur site 5’ d’épissage qui peut être masqué par des structures secondaires. La reconnaissance des exons hébergés par des gènes enrichis en thymine et adénine dépend essentiellement des signaux d’épissage situés en amont des exons. Je montre également que l’organisation chromatinienne est différente selon les biais de composition nucléotidique des gènes et que cela a un impact spécifique sur la reconnaissance des exons. De nombreuses études démontrent que les gènes ne sont pas organisés de façon aléatoire dans un génome et que l’architecture des gènes et des chromosomes dépend de leur composition nucléotidique. Par conséquent, mes travaux suggèrent qu’il existe un lien direct entre composition nucléotidique d’une région du génome, architecture de la chromatine et sélection des exons au cours de l’épissage. / Splicing, a major step in gene expression, consists in the removal of the introns and the production of mature transcripts or mRNA. The regulation of or the disturbances in splicing are involved in numerous physiopathological situations. In this work, I used and analysed with bio-informatic approaches a lot of genome-wide datasets in order to define better the rules governing exon recognition during the splicing step. I show in this work that the mechanisms of exon recognition depend on the nucleotidic composition bias of the genes which host these exons. Thus, the recognition of the exons located in genes enriched with guanine and cytosine essentially depends on their 5' splicing site, which can be hidden by secondary structures. The recognition of the exons located in genes enriched with thymine and adenine essentially depends on splicing signals placed upstream the exons. Moreover, I show that the chromatin organization varies according to the nucleotidic composition bias in the genes, and that it has a particular impact on exon recognition. A lot of studies have shown that the genes are not randomly organized in a genome and that the architecture of the genes and of the chromosomes depends on their nucleotidic composition. Put together, my work suggests that it exists an direct link between the nucleotidic composition of a genomic region, the chromatin architecture and the recognition of the exons during the splicing step.

La maladie de Steinert ou dystrophie myotonique de type 1 (DM1), dystrophie musculaire la plus commune chez l’adulte, est causée par l’expansion instable de triplets CTG dans la région 3’ non traduite du gène DMPK (Dystrophia Myotonica Protein Kinase). Cette maladie multisystémique, affectant principalement les muscles squelettiques et le cœur, est liée à l’épissage. En effet, les CUG exp forment des structures secondaires dans le noyau capables de séquestrer la protéine MBNL1, facteur d’épissage alternatif. En parallèle, un autre facteur d’épissage alternatif, CELF1 est stabilisé. La dérégulation de la balance entre ces deux protéines cause des défauts d’épissage, responsables de certains symptômes de la maladie, comme la myotonie, des défauts de conduction cardiaque et une résistance à l’insuline, causés respectivement par l’épissage aberrant du canal chlorure Clcn1, du canal sodique SCN5A et du récepteur à l’insuline IR. De plus, des dérégulations indépendantes de l’épissage sont aussi mises en jeu dans la DM1 mais leur responsabilité dans l’apparition des symptômes de la maladie reste à identifier. Pour identifier des dérégulations transcriptionnelles indépendantes de l’épissage mais liées à la progression et à la sévérité des symptômes, nous avons généré de nouveaux modèles drosophile de la DM1 avec un nombre croissant de répétitions CTG. Ces modèles étudiées au stade larvaire récapitulent les caractéristiques majeures de la DM1 : la formation de foci et une hypercontractilité musculaire. De plus, nous avons identifié dans ce modèle des dérégulations géniques indépendantes de l’épissage mais dépendantes du nombre de répétitions CTG. Notamment, une atténuation de Gbe1, codant pour une enzyme de branchement du glycogène pourrait participer aux phénotypes musculaires. Afin d’étudier les symptômes cardiaques de la maladie qui touchent 80% des patients et représentent la deuxième cause de mortalité, nous avons utilisé le modèle DM1 de drosophile développé dans notre équipe, et réalisé des analyses physiologiques cardiaques sur des mouches adultes qui expriment 960 CTG dans le cœur (Hand>DM1 960 ), un ARNi pour Mbl, l’orthologue de MBNL1, ou qui surexpriment l’orthologue de CELF1, Bru-3. Ces trois modèles DM1 reproduisent les symptômes cardiaques majeurs observés chez les patients comme des défauts de conduction, de l’arythmie (fibrillation) ou encore une cardiomyopathie dilatée. Afin d’identifier des dérégulations géniques susceptibles d’être responsables de ces défauts, nous avons réalisé une analyse transcriptomique par séquençage ARN après collection de l’ARN spécifique du cœur par la technique du TU-tagging. Les gènes dérégulés identifiés dans ces contextes ont été classés en fonction de leur conservation et du niveau de dérégulation. Parmi eux, la surexpression dans le cœur adulte de Straightjacket (Stj), l’orthologue de CACNA2D4 qui code pour une sous-unité d’un canal calcique voltage- dépendant, cause des défauts de conduction et de la fibrillation, mimant ce qui a été observé en contexte DM1 960 et gain de fonction pour Bru-3. Dans l’avenir, nous aimerions confirmer son implication dans la physiologie cardiaque et en particulier dans la DM1 en analysant son expression chez les patients présentant des défauts cardiaques similaires. / The most common muscular dystrophy found in adults, Steinert disease or Myotonic Dystrophy Type 1 (DM1) is caused by an unstable CTG repeat expansion in the 3’ untranslated region of the Dystrophia Myotonica Protein Kinase (DMPK) gene. This multisystemic disease, affecting particularly skeletal muscles and the heart, is called a spliceopathy because it involves the sequestration of the MBNL1 splicing factor by the expanded CUG-carrying transcripts and the stabilization of the CELF1 splicing factor. The misbalance of these two factors is responsible for splicing defects that cause most of the disease symptoms, like myotonia, conduction defects and arrhythmia but also insulin resistance, respectively associated to missplicing of Clcn1, SCN5A and IR. Moreover, DM1 toxicity is also associated to splice-independent deregulations but their link to disease symptoms remain poorly understood. To identify transcriptional deregulations independent of splicing and associated to disease progression and severity, we generated new DM1 Drosophila models with increasing number of CTG repeats. These larval models recapitulated the main DM1 muscular symptoms such as hypercontractility and foci formation and allowed us identifying gene deregulations independent of splicing. Among them, Gbe1 coding for a glycan branching enzyme is attenuated in the DM1 context in a CTG-repeat dependant manner and could participate in the severity of muscle phenotypes. To better understand the causes of cardiac symptoms that represent the second cause of death and affecting 80% of DM1 patients, we took advantage of our DM1 inducible Drosophila model and performed phenotypic analyses on the heart of adult flies expressing: 960 CTG specifically in the heart (Hand>DM1 960 ), a RNAi for the Drosophila MBNL1 orthologue (Muscleblind, Mbl) or overexpressing the CELF1 orthologue (Bruno-3, Bru3). These DM1 adult models display conduction abnormalities, arrhythmicity (fibrillation) and dilated cardiomyopathy (DCM). Thus, these three pathogenic contexts recapitulated collectively the main DM1 cardiac symptoms and prompted us to perform transcriptional profiling to identify symptom’s-associated gene deregulations. To identify new molecular actors responsible for the DM1 associated heart defects, we performed cardiac cell-specific transcriptional analyses by RNA-sequencing, using TU-tagging technique. Then, we selected deregulated candidate genes that could be linked to the particular observed phenotypes and ranked depending on their conservation and deregulation level. Among them, increased expression of Straightjacket (Stj), the CACNA2D4 orthologue, encoding a subunit of voltage- dependent calcium channel results in fibrillation and conduction defects, thus mimicking cardiac symptoms found in DM1 960 and Bru-3 gain of function contexts in which it was up- regulated. Whether identified candidates are deregulated in DM1 patients displaying cardiac abnormalities remains to be tested.