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Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a fatal, x-linked disease that causes progressive muscle weakness and susceptibility to damage. DMD is caused by a lack of dystrophin, a large muscle protein that performs both structural and signaling functions. A promising treatment currently in clinical trials is microdystrophin gene therapy, which delivers a truncated version of dystrophin to muscle via a viral vector. Preclinical studies have established efficacy of microdystrophin to improve muscle quality and function. With clinical success of this treatment, patients affected by DMD could become more physically active. However, the effect of exercise on both dystrophic and gene therapy-treated muscles is unclear. Recently, we demonstrated that microdystrophin gene therapy with and without 21 weeks of voluntary wheel running (VWR) improved treadmill time to fatigue and in vivo plantarflexor torque output in young mdx mice, a mouse model of DMD. Although treated mice could run well, diaphragm force and power output were blunted by VWR. A subsequent study tested longevity of two different microdystrophin gene therapy constructs in combination with VWR. Versions of each construct are being tested in clinical trials. Construct 1 contained the nNOS-binding site found in full-length dystrophin, which localizes nNOS to the sarcolemma and reduces functional ischemia of exercising limb muscles, while construct 2 lacked the nNOS-binding site and was the same microdystrophin used in the previous study. Gene- therapy treated mice that were sedentary or performed 52 weeks of VWR demonstrated similar outcomes including increased plantarflexor torque and exceptional treadmill endurance capacity. However, ex vivo diaphragm and soleus force, as well as metabolic enzyme and mitochondrial respiration assays were differentially improved, revealing unique physiological adaptations to each microdystrophin construct. Together, the data demonstrated that response to exercise after gene therapy treatment was variable and dependent on age, microdystrophin construct, and muscle type. / Doctor of Philosophy / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a rare, fatal muscle disease that causes progressive muscle weakness and cardiorespiratory failure. Available treatments, such as corticosteroids, slow progression of the disease but do not address the underlying genetic cause. DMD is caused by a genetic mutation that results in the loss of the muscle protein dystrophin. Microdystrophin gene therapy aims to address the genetic cause of the disease by using a non-pathogenic virus to deliver microdystrophin, a small, functional version of dystrophin, to muscle. This gene therapy is in clinical trials, and, if it is successful, treated patients will likely want to engage in more physical activity than previously possible due to muscle weakness. However, the effects of physical activity on muscles treated with gene therapy are unclear. Therefore, we conducted two studies to test the effects of voluntary wheel running on microdystrophin gene therapy in the mdx mouse, a model of DMD. The first study demonstrated that voluntary wheel running was beneficial to whole-body muscle function in mice treated with microdystrophin gene therapy. However, adaptations to the gene therapy and voluntary wheel running were variable in individual muscles. In the second study, we tested two microdystrophin constructs, which each contain different structural components of full-length dystrophin. In addition, mice ran for 52 weeks, more than twice as long as the first study. The results of the second study found that adaptations in individual muscles depended on microdystrophin construct and activity level. Additionally, we confirmed that voluntary wheel running was beneficial to whole-body function of microdystrophin–treated muscles. Together, these studies demonstrated that adaptations of gene therapy-treated muscles were dependent on microdystrophin structure, activity level, and age.

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe and fatal muscle wasting disease characterized by a high mutation rate in the gene that encodes the membrane-associated protein dystrophin that results in absence of expressed protein. Although the primary genetic defect for DMD is known, the mechanisms that initiate the onset of DMD are not currently understood. This study tested the hypothesis that pathophysiological processes involved in DMD could be identified by the global expression of mRNA in maturing dystrophin- and utrophin-deficient mouse (mdx:utrn-/-) muscles. Two potential dystrophic onset mechanisms targeted for analysis were (1) disrupted expression of calcium handling proteins; and, (2) increased expression of immune response markers. An mRNA expression profile was developed following isolation of total RNA from control and mdx:utrn-/- triceps surae (TS) muscles at ages 9-10 and 20-21 days using Affymetrix® Mu74Av2 GeneChips®. Compared to control, the mRNA expression profile in mdx:utrn-/- muscles revealed there was a 3-fold increase in the number of gene transcripts differentially expressed more than 2-fold (53 transcripts at ages 9-10 days; 153 at ages 20-21 days). However, there were no changes in the mRNA transcripts for calcium handling proteins. In distinct contrast, there was up-regulation of transcripts that corresponded to an immune response (40 transcripts), extracellular matrix activity (14), and proteolysis (8). Up-regulation of several transcripts corresponded to cytokines and their receptors (11), chemokines and their receptors (5), and lymphoid and myeloid markers (16) suggesting that dystrophic muscle is susceptible to invasion by macrophages, leukocytes, B- and T-cells. These results are consistent with several reports (Spencer et al., 1997; Chen et al., 2000; Porter et al., 2002; Porter et al., 2003a; Porter et al., 2003b; Porter et al., 2004) that indicate the immune system may play an important role in the early pathophysiology of DMD. Understanding the functional aspects of an immune response in DMD onset should lead to more effective therapeutics. / Master of Science

Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is characterized by progressive muscle degeneration and a chronic inflammatory response. Sphingolipid metabolites are associated with the generation or perpetuation of low-grade chronic inflammation critical in atherosclerosis, obesity and cancer. Dietary sphingolipids, however, can suppress intestinal inflammation. We hypothesized that dietary sphingomyelin (SM) from bovine milk can modulate the inflammatory signature and improve muscle function in mdx mice, a model of DMD. C57BL10 (WT) and mdx mice were fed AIN 76A diet ± 0.1% SM for 7 weeks starting at age 4 weeks (n=10/group: WT, WT + S, mdx, mdx + S). At ages 5, 7, and 9 weeks, ankle flexor torque was determined in vivo. Mice were euthanized at 11 wks. Serum creatine kinase and extensor digitorum longus (EDL) contractile properties in vitro were determined; Tibialis Anterior (TA) inflammatory markers were profiled by qRT-PCR; TA sections were stained with H&E and immunohistochemistry for p-Akt was performed. At age 9 weeks, in vivo ankle flexor torque at stimulation frequencies 50-150 Hz was greater in mdx+S vs. mdx (P=0.0160) and WT (P<0.0001). At 11 wks, only WT+S EDL stress in vitro was greater than all other groups at 50-150 Hz. The in vitro relative stress-frequency relationship of mdx+S EDL was left shifted from the other treatment groups. Inflammatory genetic markers were increased in mdx+S mice. These data suggest treatment of mdx mice with 0.1% SM improves ankle flexor torque in vivo, causes a left shift of the stress-frequency relationship in vitro, and modulates the inflammatory gene signature. / Master of Science

Une synchronicité existe entre l’apparition de l’atrophie musculaire et osseuse (ostéoporose) mais, très peu de groupes de recherche se sont intéressés à la possibilité qu’une voie de signalisation commune puisse contrôler simultanément ces tissus dans un contexte pathologique. Le but de cette thèse est de caractériser les rôles du sentier signalétique principal du remodelage osseux soit la voie RANK/RANKL/OPG, sur le muscle squelettique sain ou pathologique. Premièrement, nous avons démontré que RANK est exprimé dans le muscle squelettique et que son absence dans ce tissu induit un effet inotropique sur le muscle rapide extensor digitorum longus (EDL), limitant ainsi la perte de force maximale spécifique, tout en augmentant l'atrophie musculaire, la fatigabilité et la proportion de fibres rapides. Ensuite, nous avons montré qu’un blocage pharmacologique de la voie RANKL/RANK par l’OPG atténue la perte de la force musculaire de manière dose-dépendante et préserve l'intégrité musculaire, en particulier des muscles rapides EDL de souris dystrophiques. Cette étude nous a également permis de démontrer que l’OPG-Fc a un effet intéressant mais plus limité sur la préservation de la force du muscle lent soleus (Sol). Par contre, nous avons découvert que l’OPG-Fc potentialise les effets positifs d'une faible dose de formotérol, un membre de la famille des β2-agonistes, et leur combinaison restaure complètement la fonction du Sol des souris dystrophiques. Finalement, nous avons débuté une étude mécanistique sur l’effet protecteur de l’OPG-Fc sur le muscle squelettique dystrophique. Structurellement, l'OPG-Fc pleine longueur contient quatre domaines TNFR (RANKL), deux domaines de la mort cellulaire par apoptose (TRAIL) et un domaine lié à l'héparine. Nos résultats indiquent que les injections d'anti-RANKL, d’anti-TRAIL et d’OPG-Fc tronquée (possédant seulement les domaines TNFR) ou la suppression génétique de RANK dans le muscle sont nettement moins efficaces sur la préservation de la force des muscles dystrophiques que celles d’OPG-Fc pleine longueur. Étonnamment, l'absence de Ca2+ extracellulaire réduit considérablement les effets de l’OPG-Fc pleine longueur sur la force des muscles dystrophiques dans un modèle de contractilité in vitro. Nos analyses en microscopie confocale ont démontré que l’OPG-Fc pleine longueur pourrait se lier à un récepteur présentement non identifié localisé sur les myotubes et que cette liaison entraîne possiblement une activation d’une kinase liée aux intégrines (ILK) et la surexpression d’une pompe calcique ATPase du réticulum sarcoplasmique appelée SERCA-2a, un déterminant clé de la performance musculaire. Les myotubes traités à l'héparinase, une enzyme connue pour cliver les domaines de l'héparine ou encore l’inhibition de l’ILK réduit significativement la surexpression de SERCA-2a induite par l’OPG-Fc. Cette thèse apporte globalement, une meilleure compréhension des fonctions de RANK/RANKL/OPG dans le muscle squelettique dénervé ou dystrophique et s’inscrit dans la liste des travaux pré-cliniques qui pourrait éventuellement contribuer à l’élaboration de nouveaux traitements pour les maladies musculaires et osseuses. / Although there is an obvious dynamic cross-talk between muscle and bone, a common signalling pathway that efficiently and synchronously controls these tissues has barely been investigated in all forms of muscle diseases. The aim of this thesis is to characterize the roles of RANK/RANKL/OPG, key regulators of bone remodeling, on skeletal muscle atrophy, phenotype and dysfunction. Firstly, we show that RANK is expressed in skeletal muscle and that muscle RANK deletion has inotropic effects in denervated fast-twitch extensor digitorum longus (EDL) muscles, preventing on one side the loss of maximum specific force while promoting muscle atrophy and fatigability, and increasing the proportion of fast-twitch fibers. We next demonstrate that a pharmacological treatment of dystrophic mdx mice with recombinant full-length OPG-Fc mitigates the loss of muscle force in a dose-dependent manner and preserves muscle integrity, particularly in EDL muscles. We also found that the full-length OPG-Fc has limited effects on slow-twitch soleus (Sol) muscles. However OPG-Fc potentiates the positive effects of a low dose of formoterol, a member of β2-agonists, and completely restores the function of the Sol dystrophic muscles. Finally, we investigated the mechanism by which the full-length OPGFc protects the dystrophic muscles. Structurally, the OPG protein contains four TNFR domains (RANKL), two death domains ( TRAIL) and a heparin-binding region. Our results indicate that anti-RANKL or anti-TRAIL or truncated OPG treatments (only TNFR domains) or RANK deletion are much less effective in preserving the strength of dystrophic muscles than full-length OPG-Fc. Surprisingly, the absence of extracellular Ca2+ significantly reduces the effects of full-length OPG-Fc on the force production of dystrophic muscles when incubated in a physiological bath in vitro. Confocal microscopy images showed that the full-length OPG-Fc binds directly to myotubes through a receptor that is currently unidentified activating possibly integrin-linked kinase (ILK) which upregulates sarco/endoplasmic calcium ATPase pump (SERCA-2a) expression in C2C12 myotubes. Heparinase, which cleaves heparin and heparin sulphate proteoglycan, or an inhibitor of ILK activity abrogates OPG-induced SERCA-2a expression, suggesting that OPG through ILK upregulates SERCA-2a expression, a key determinant of muscle performance. Overall, this thesis shed some light on RANK/RANKL/OPG functions in skeletal muscle which will potentially contribute to the development of new treatments for several forms of muscle and bone diseases.

La dystrophie musculaire de Duchenne est une myopathie héréditaire récessive liée au chromosome X. Elle est causée par l’absence de la dystrophine dans les fibres musculaires. La thérapie cellulaire est l’une des approches thérapeutiques possibles, mais son succès dépend du contrôle du rejet des myoblastes greffés et des fibres musculaires hybrides. À présent, le contrôle du rejet est obtenu par l’administration d’immunosuppresseurs puissants. Notre objectif à long terme est de développer un protocole de tolérance immunologique qui permettrait de prévenir le rejet, sans recours à une immunosuppression soutenue. La première étape du protocole de tolérance immunologique que nous souhaitons développer est d’induire la formation de lymphocytes T régulateurs en utilisant le facteur de transcription Foxp3. Nos travaux nous ont permis de produire, dans des bactéries E. coli, la protéine de fusion Tat-Foxp3. Par des essais in vitro nous avons démontré l’augmentation de l’expression du récepteur CD25 sur les lymphocytes T CD4+ naïfs après transduction de la protéine Tat-Foxp3. Cela suggère que la protéine Tat-Foxp3 pourrait convertir les lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes T régulateurs. D’autres travaux seront nécessaires pour confirmer que ces cellules exprimant le CD25 sont vraiment des T régulateurs. / The Duchenne muscular dystrophy is the most common hereditary muscular disease. This disease is inherited as an X-linked recessive trait. It is caused by the absence of dystrophin in muscle fibers. Cell therapy is the potential treatment but, its success depends on the control of the rejection of the transplanted myoblasts and of the hybrid fibers that they formed. At present, the control of the graft rejection is achieved by administration of powerful immunosuppressive drug. Our long-term aim is to develop a protocol for immune tolerance that would prevent the graft rejection without sustained immunosuppression. The first step of this tolerance protocol that we want to develop is to induce the formation of regulatory T cells using the transcription factor Foxp3. In this study we generated, in bacteria E. coli, a fusion protein Tat-Foxp3. By in vitro assays, we demonstrated that Tat-Foxp3 protein up-regulated the expression of CD25 in naïve CD4+ T cells. Additional experiments will be required to confirm that these CD25 expressing cells are Treg.

Titre de l'écran-titre (visionné le 29 juin 2023) / La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie neuromusculaire héréditaire causée par des mutations dans le gène DMD codant pour la dystrophine, une protéine importante dans le maintien de l'intégrité de la membrane des fibres musculaires. L'absence de la dystrophine se manifeste par la dégénérescence progressive des fibres musculaires à l'effort. La DMD représente un fardeau pour les patients et leurs familles. Elle affecte environ 20 000 nouveaux nés de sexe masculin dans le monde chaque année. Il existe plusieurs approches thérapeutiques allant du ciblage de l'ARNm au remplacement ou substitution de la dystrophine. Cependant, ces traitements sont transitoires et induisent des améliorations phénotypiques limitées. La découverte il y a une dizaine d'années du système CRISPR-Cas a ouvert des possibilités presque illimitées en biologie. Ce système a été modifié et adapté en 2019 pour développer le Prime editing, une technologie dynamique de modification du génome. Cette technologie permet de faire une interconversion de tout nucléotide du génome, des insertions ou des délétions de nucléotides. Le système d'édition est constitué d'un plasmide éditeur (PE2) fait d'une Cas9 nickase fusionnée à une transcriptase inverse et d'un plasmide contenant un ARN guide pour le Prime editing (pegRNA) contenant une séquence espaceur, une séquence d'amorçage et une matrice pour la transcriptase inverse (RTT). Notre étude visait donc à utiliser cette technologie CRISPR-Cas9 Prime editing pour développer une approche de traitement permanent de la DMD. Les deux premiers chapitres de cette thèse présentent de façon approfondie l'état de la littérature actuelle sur les différentes approches thérapeutiques de la DMD. Le premier chapitre décrit les stratégies moléculaires médiant la restauration de la dystrophine. Ces approches incluent la lecture à travers les codons, les sauts d'exons, la modification de l'ADN par la technique CRISPR, la modulation des progéniteurs, le remplacement et la substitution du gène DMD ainsi que la transplantation cellulaire. Le deuxième chapitre apporte plus de détails et de précisions sur les approches CRISPR en développement pour la DMD permettant ainsi de mieux comprendre la pertinence de notre choix technologique (CRISPR-Cas9 Prime editing) pour l'approche que nous avons développé dans cette thèse. Le troisième chapitre de cette thèse vise à démontrer la capacité du Prime editing à introduire ou corriger des mutations ponctuelles dans le gène DMD et permettre l'expression de la protéine dystrophine complète. Initialement, nous avons conçu plusieurs pegRNAs pour introduire les mutations nonsenses présentes dans la population canadienne dans les exons 6, 9, 20, 35, 43, 55 et 61 du gène DMD. Suite à des taux d'édition très faibles variant entre 2 et 10%, plusieurs optimisations dont, les traitements répétés consécutifs, l'usage d'un guide supplémentaire pour induire une autre coupure de l'autre brin d'ADN à distance du site de coupure initial, et l'ajout d'une mutation simultanée dans la séquence adjacente au protoespaceur (PAM) pour préserver la mutation induite, ont permis d'augmenter jusqu'à 5,8 fois le taux d'édition. Ces stratégies ont permis par la suite de corriger la mutation c.428 G>A dans l'exon 6 des myoblastes d'un patient suivi par l'expression de la dystrophine détectée par western blot à partir des protéines provenant de la fusion des myoblastes en myotubes. Le séquençage haut débit analysé par CRISPResso2 a montré un taux d'INDEL inférieur à 1%. Le quatrième chapitre de cette thèse vise à démontrer la capacité du Prime editing à corriger efficacement la mutation c.8713C>T dans l'exon 59 du gène DMD dont la position à +13 nucléotides du site de coupure la rend défavorable pour la correction par Prime editing. Plusieurs variants de PE2 ont été testés et le meilleur variant (SpCas9-NGG) a été choisi pour la suite des expériences. Ajoutées aux optimisations du chapitre 3 précédent, la variation de la longueur du RTT et des mutations synonymes supplémentaires à différentes positions de la cible ont permis d'augmenter jusqu'à 7 fois le taux d'édition. Cette autre stratégie a été utilisée pour la correction de la mutation c.8713C>T dans l'exon 59 des myoblastes d'un patient à un taux de 22% suivi par l'expression de la dystrophine (42%). Le cinquième chapitre de cette thèse a permis de démontrer la capacité du Prime editing à effectuer en plus des substitutions, des délétions et des insertions de nucléotides dans les sites d'épissages afin de médier un saut d'exon et restaurer l'expression de la dystrophine. La stratégie consistait à corriger dans les myoblastes de patients, les mutations causées par les délétions de l'exon 52 et des exons 45-52 en modifiant respectivement les sites donneurs d'épissage des exons 51 et 53 pour les éliminer. Cela a permis la jonction respective de l'exon 50 à l'exon 53 et de l'exon 44 à l'exon 54 pour les délétions 52 et 45-52 respectivement. Ces modifications des sites d'épissage ont permis l'expression de la protéine dystrophine. Ces résultats sont une preuve de principe et démontrent le potentiel de notre approche à modifier efficacement le gène DMD pour médier la restauration de l'expression de la dystrophine chez les patients DMD. Cependant, il sera important de développer un système de livraison efficace en utilisant par exemple un vecteur Dual-AAV ou des particules virales VLPs ayant respectivement des capsides ou des glycoprotéines spécifiques des muscles squelettiques et cardiaques pour un essai in vivo de ces stratégies. Il sera également pertinent de développer une approche Prime editing multiplexe afin de cibler simultanément plusieurs mutations du gène DMD et examiner les effets hors cibles et immunologiques de cette dernière. / Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is an inherited neuromuscular disease caused by mutations in the DMD gene encoding dystrophin, a protein involved in maintaining muscle fibers membrane integrity. The absence of dystrophin leads to a progressive muscle wasting due to muscle contractions. DMD represents a burden for patients and their families. It affects approximately 20,000 newborn males worldwide each year. There are several therapeutic approaches ranging from mRNA targeting to dystrophin replacement or substitution. However, these treatments are transient and induce limited phenotypic improvements. The discovery a decade ago of CRISPR-Cas system opened almost unlimited possibilities in biology. This system was modified and adapted in 2019 to develop the Prime editing, a dynamic genome editing technology. That technology makes possible the interconversion of any nucleotide of the genome, and the insertions or deletions of nucleotides. The editing system consists of a prime editor plasmid (PE2) made of a Cas9 nickase fused to a reverse transcriptase and a plasmid encoding a Prime editing guide RNA (pegRNA) containing a spacer sequence, a primer binding site (PBS) sequence and a reverse transcriptase template (RTT). Our study therefore aimed to use this CRISPR-Cas9 Prime editing technology to develop a permanent treatment approach for DMD. The first and second chapters of this thesis present in depth the state of the current literature on the different DMD therapeutic approaches. The first chapter describes the molecular strategies involved in the dystrophin restoration. These approaches include read through codon, exon skipping, CRISPR DNA editing, progenitor modulation, DMD gene replacement or substitution, and cell transplantation. The second chapter provides more details and precisions on the CRISPR approaches in development for DMD, thus allowing a better understanding of the relevance of our technological choice for the approach that we have developed in this thesis. The third chapter of this thesis aims to demonstrate the ability of Prime editing to introduce or correct point mutations in the DMD gene and restore the expression of the dystrophin protein. We initially designed several pegRNAs to induce the nonsense mutations present in the Canadian population in exons 6, 9, 20, 35, 43, 55 and 61 of the DMD gene. Following very low editing rates varying from 2 to 10%, several optimizations including consecutive repeated treatments, the use of an additional sgRNA to induce a second nick at a distance from the initial nick site, and the simultaneous mutation in the protospacer adjacent motif (PAM) to preserve the induced mutation, permitted to increase by 5.8-fold the editing rate. These strategies subsequently made possible to correct the c.428 G>A mutation in exon 6 of a patient's myoblasts. That was followed by dystrophin expression detected by western blot from proteins coming from the fusion of the myoblasts in myotubes. High-throughput sequencing analyzed by CRISPResso2 showed an INDEL rate less than 1%. The fourth chapter of this thesis aims to demonstrate the ability of Prime editing to efficiently correct the c.8713C>T mutation in exon 59 of the DMD gene whose position at +13 makes it unfavorable to the correction by Prime editing. Several PE2 variants were tested, and the best variant (SpCas9-NGG) was chosen for further experiments. Added to the optimizations of the previous chapter 3, varying the RTT length and additional synonymous mutations at different positions beside the target increased the editing rate by 7-folds. This other strategy was used for the correction of the c.8713C>T mutation in exon 59 of a patient's myoblasts at the editing rate of 22% followed by the dystrophin expression (42%). The fifth chapter of this thesis has demonstrated the ability of Prime editing to perform in addition to substitutions, deletions, and insertions of nucleotides in the splice sites to mediate exon skipping and restore the dystrophin expression. The strategy consisted of correcting in patient myoblasts, the mutations caused by the deletions of exon 52 (Del52) and exons 45-52 (Del45-52) respectively by modifying the splice donor sites of exons 51 and 53 for their skipping. This allowed the binding of exon 50 to exon 53 and exon 44 to exon 54 respectively for Del52 and Del45-52 permitting the expression of the dystrophin protein. These results are a proof of concept and demonstrate the potential of our approach to effectively modify the DMD gene to mediate the dystrophin restoration in DMD patients. However, it will be important to develop an efficient delivery system using for example a Dual-AAV vector or virus like particles (VLPs) with skeletal and cardiac muscle-specific capsids or glycoproteins, respectively, for in vivo experimentation of these strategies. It will also be relevant to develop a multiplex Prime-editing approach to simultaneously target multiple DMD gene mutations and examine the off-target and immunological effects.