As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são as células reprogramadas com fatores de transcrição, como Oct-4, Sox-2, Klf-4 e c-MYC (OSKM). As iPSCs são geralmente obtidas pela expressão ectópica de vetores retrovirais e lentivirais contendo os fatores transcricionais OSKM. No entanto, a utilização de sistemas de expressão virais pode levar a mutagênese de inserção e geração de células tumorais. Assim, é preferível que a reprogramação celular ocorra temporariamente por meio de fatores OSKM fusionados com sequências de peptideos para a transdução de proteínas. Neste sentido, os genes sintéticos codificadores de transdução de péptidos fusionados ao N ou C-terminal de OSKM pode ser obtido por ferramentas da bioinformática específicos e sintetizados utilizando técnicas químicas avançadas. Esses genes sintéticos podem ser aplicados para a síntese de proteínas utilizando tanto técnicas in vivo quanto in vitro. Assim, o objetivo deste trabalho foi gerar fatores OSKM fusionados a transportana (TP10) usando genes sintéticos e sistema de transcrição e de tradução in vivo. Além disso, três genes sintéticos adicionais também foram obtidos para expressão de Oct-4 contendo TP10 fusionado na região N-terminal (N-OCT4-TP10), C-terminal (C-OCT4-TP10), e sem TP10 (Oct-4). A expressão ectópica dos três genes sintéticos para Oct-4 foram testadas in vivo em duas diferentes linhagens comerciais de E. coli que expressam a enzima de T7 RNA polimerase. Os dados de Western blot indicaram que todos os genes sintéticos de Oct-4 foram capazes de produzir proteínas recombinantes. No entanto, a expressão mais elevada foi obtida com a construção N-OCT4-TP10. Além disso, as proteínas do fator de transcrição Oct-4 obtitdas foram avaliadas quanto a sua capacidade de ligação a sua respectiva seqüência-alvo de DNA sendo avaliada por meio dos extratos brutos das proteínas de E. coli contendo ou não Oct-4 proteínas ectópica. Os dados do ensaio de ligação demonstraram que todas as sequências de Oct-4 foram capazes de se ligar às suas sequências de reconhecimento. Em conclusão, as proteínas Oct-4 funcionais fusionadas com o peptideo o transdutor pode ser obtido a partir de genes sintéticos, permitindo potencialmente elaborar protocolos de reprogramação virais livres. / Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed cells with a transcription factors such as Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-MYC (OSKM). iPSCs are generally obtained by ectopic expression of retroviral and lentiviral vectors containing tOSKM. However, the use of viral expression systems can lead to insertional mutagenesis and generation of tumor cells. Thus, it is preferable to temporarily reprogram cell by means of OSKM factors fused to peptides sequences for protein transduction. In this sense, synthetic genes coding to transduction peptides fused to the N- or C-termini of OSKM can be designed by specific bioinformatics tools and synthesized using advanced chemical techniques. Those synthetic genes can be applied for protein synthesis using both in vivo and in vitro techniques. Thus, the objective of this work was to generate OSKM factors fused to transportan (TP10) using synthetic genes and in vivo transcription and translation systems. Moreover, three additional synthetic genes also were obtained for Oct-4 expression containing TP10 fused to: (i) N-terminus (N-OCT4-TP10), e, (ii) C-terminus (C-OCT4-TP10), and (iii) without TP10 (Oct-4). Ectopic expression of the three synthetic genes for Oct-4 was tested in vivo in two different commercial strains of E. coli expressing the enzyme T7 RNA polymerase. Western blot data indicated that the all Oct-4 synthetic genes were able to produce the recombinant protein. However, highest expression was obtained with the construction N-OCT4-TP10. Furthermore, the binding capacity of Oct-4 fusion proteins in these respective target DNA sequences was assessed by the evaluation of E. coli protein extracts containing or not ectopic Oct-4 fusion proteins. Data from binding assay demonstrated that all Oct-4 sequences are able to bind to its recognition sequences. In conclusion, functional Oct-4 proteins fused to transducer peptides can be obtained from synthetic genes, allowing to potentially design viral-free reprogramming protocols.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2013. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-10-09T12:48:34Z No. of bitstreams: 1 2013_KeylaCarolinedeAlmeida.pdf: 11359937 bytes, checksum: 832932f0a22621b26e18965b4beda83b (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-10-09T14:17:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_KeylaCarolinedeAlmeida.pdf: 11359937 bytes, checksum: 832932f0a22621b26e18965b4beda83b (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:17:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_KeylaCarolinedeAlmeida.pdf: 11359937 bytes, checksum: 832932f0a22621b26e18965b4beda83b (MD5) / As Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRaS) e o aparecimento de cepas multirresistentes representam um grave problema de saúde pública, sendo notória a necessidade de melhor compreender os mecanismos de resistência bacteriana e assim, elaborar antibióticos mais eficazes. Portanto, o objetivo deste trabalho consistiu em identificar, através de técnicas proteômicas e transcriptômicas, genes e proteínas diferencialmente expressos em linhagens de E. coli ATCC 8739 resistentes à magainina I. Para isso foi realizada a caracterização bioquímica através de microdiluição, VITEK®, MicroScan® e MALDI-TOF MS. Em seguida, foram analisadas a transcrição gênica e a expressão protéica por RNA-seq, nanoUPLC-MSE e 2-DE, respectivamente. Os resultados demonstram que as linhagens resistentes podem ser discriminadas por análises no MALDI-TOF MS e que a resistência à magainina I parece ser bastante específica. Utilizando técnicas proteômicas, foram identificadas 10 proteínas superexpressas dentre as quais, as porinas OmpW, OmpF, OmpC e OmpC fragmento 1b e as proteínas OppA, ZraP e MalM, que participam do transporte pela membrana e transdução de sinal. Por outro lado as proteínas GlpB, GlpA, GdpD, que participam do metabolismo de fosfolipídeos, e o regulador transcricional kdgR, DPS, DnaK, relacionado ao processamento de informação genética, estavam subexpressas. Observou-se também 60 proteínas exclusivas na linhagem resistente, que participam principalmente do metabolismo e processamento de informação genética e ambiental. A fim de aumentar a amplitude da análise, técnicas transcriptômicas também foram aplicadas ao mesmo modelo de estudo observando-se 80 genes com expressões diferenciais, principalmente correlacionados com o metabolismo. Dentre esses, a linhagem resistente versus susceptível com magainina I apresentou 5 genes diferenciais, estando 3 deles superexpressos (pspA, secM, xdhB) e 2 subexpressos (cdp, hldD). Os resultados sugerem que a bactéria foi capaz de desenvolver mecanismos de adaptação em resposta à presença de magainina, provavelmente regulando uma complexa rede de múltiplos genes. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Healthcare Associated Infections (HAIs) and emergence of multidrug-resistant bacteria represent a serious public heath problem, requesting a better understanding of bacterial resistance’s mechanisms in order to develop more effective antibiotics. Therefore, work aims to identify, through proteomics and transcripomics tools, genes and proteins differentially expressed in E. coli ATCC 8739 magainin I resistant strains. Biochemical characterization was performed by broth microdilution, VITEK, MicroScan and MALDI – TOF MS. Then, gene and proteins expression were analyzed by RNA –seq, nanoUPLC – MS and 2-DE. Results demonstrated that the resistant strains could be discriminated by MALDI- TOF MS analysis and resistance to magainin I seems to be quite specific. By using proteomic tools, ten proteins were upregulated, such OmpW, OmpF, OmpC e OmpC 1b fragment and fifteen proteins, sush GlpB, GlpA, GdpD, transcriptional factor regulator kdgR, DPS and DnaK, were downregulated in resistant strains. The upregulated proteins have been associated to membrance transport and sinal transduction and dowregulated proteins seem to participate in phospholipid metabolism and genetic information processing. It were also observed the presence of 60 unique proteins in the resistant strains that participate in bacterial metabolism, genetic and environmental information processing. In order to increase the knowledge of bacterial resistance, transcriptomic analysis was realized by using the same magainin I-resistant E. coli model being 80 genes identified, with differential expression in resistant strain being mainly related to metabolism. Among these, the comparison between resistant versus susceptible group cultured with magainin I showed five differential expressed genes, being three of them overexpressed (pspA, secM, xdhB) and the others subexpressed (cdp, hldD.) These data suggest that the bacterium was able to develop a adaptation mechanism in response to magainin, probably regulating a complex net formed by multiple genes.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2014 / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-12-05T11:26:50Z No. of bitstreams: 1 2014_JulianeFlaviaCançadoViana.pdf: 2329888 bytes, checksum: 2d94ac92e5852100cb1b6f27a077bb3d (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-12-19T12:58:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_JulianeFlaviaCançadoViana.pdf: 2329888 bytes, checksum: 2d94ac92e5852100cb1b6f27a077bb3d (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-19T12:58:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_JulianeFlaviaCançadoViana.pdf: 2329888 bytes, checksum: 2d94ac92e5852100cb1b6f27a077bb3d (MD5) / Na última década, a urgência na busca de novos e eficientes medicamentos para o combate das infecções hospitalares emergiu, principalmente, em função do desenvolvimento de mecanismos de resistência em microrganismos patogênicos. Neste âmbito, os peptídeos antimicrobianos (PAMs) surgem como uma potencial classe de substâncias a serem utilizadas na prevenção e controle de infecções por apresentarem múltiplas atividades que incluem tanto atividade bactericida e fungicida, quanto imunoprotetora. Esses peptídeos podem ser encontrados em diversas fontes na natureza como fungos, plantas, animais vertebrados e invertebrados, sendo que diversos estudos já demonstraram serem raros os episódios de resistência aos PAMs. Entretanto, estas moléculas estão presentes em concentrações muito baixas inviabilizando a sua utilização a partir da purificação de fontes naturais ou síntese química dependendo da esua estrutura primária. Dessa forma, a produção desses peptídeos utilizando ferramentas biotecnológicas permite que os mesmos sejam produzidos e empregados em estudos de estrutura-função e mecanismos de ação. A primeira etapa deste trabalho consistiu na produção heteróloga em sistema procarioto e eucarioto do peptídeo Pg-AMP1 utilizando proteínas de fusão, descrito originalmente com atividade antibacteriana. Entretanto, não foi observada atividade da proteína heteróloga fusionada contra nenhuma das bactérias testadas em ensaios in vitro, visto que o peptídeo não foi clivado. Paralelamente, o peptídeo Cm-p1, originalmente extraído do molusco Cenchritis muricatus, foi sintetizado quimicamente e incorporado a nanofibras para produzir um sistema de liberação controlada. As nanofibras antifúngicas mostraram atividade contra Candida albicans, sendo estas caracterizadas por espectrometria de massas, microscopia eletrônica de varredura, bem como microscopia de força demonstrando que a presença do Cm-p1 pode interferir na morfologia das nanofibras. Além disso, os testes de liberação mostraram que Cm-p1 foi quase todo liberado na primeira hora. A biocompatibilidade das fibras foi avaliada por MTS e geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) por células HUVEC, mostrando que as nanofibras contendo o peptídeo não afetaram a viabilidade celular. Somente as fibras contendo 10 % do Cm-p1 aumentaram a geração de ROS e a secreção de citocinas como IL6 e TNF-?. O emprego de ferramentas bionanotecnológicas possibilita a produção e incorporação de peptídeos antimicrobianos em sistemas de liberação controlada de fármacos que podem ser utilizados no tratamento e controle de infecções nosocomiais. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / In the last decade, the urgency in finding new and effective drugs to avoid hospital infections emerged due to the development of mechanisms of resistance in pathogenic microorganisms. In this context, antimicrobial peptides (AMPs) appear as a potential class of substances to be used in the prevention and control of infections by presenting multiple activities that include both bactericidal and fungicidal activities, as well as immunoprotective. These peptides can be found in nature from various sources such as fungi, plants, vertebrates and invertebrates, and several studies have already demonstrated they are rare episodes of AMPs resistance. However, these molecules are synthesized in very low concentrations precluding their use from natural sources or chemical synthesis. Thus, the production of these peptides using biotechnological tools allows their producing and using in studies of structure-function and mechanisms of action. The first step of this work consisted of heterologous production in eukaryote and prokaryote systems of Pg-AMP1 using fusion proteins. Originally, this peptide was described with antibacterial activity. However, unfortunately the fused heterologous protein was not active against any of the bacteria tested in vitro. In parallel, the Cm-p1 peptide, originally extracted from shellfish Cenchritis muricatus, was chemically synthesized and incorporated into nanofibers to produce a controlled release system. Nanofibers showed antifungal activity against Candida albicans, which were characterized by mass spectrometry, scanning electron microscopy, as well as atomic force microscopy demonstrating that the presence of Cm-p1 can interfere with nanofibers morphology. Furthermore, the release tests showed that Cm-p1 was almost completely released within the first hour. The MTS fibers biocompatibility and reactive oxygen species (ROS) generation by HUVEC cells were evaluated, showing that nanofibers containing peptide did not affect cell viability. Only 10% of the fibers containing Cm-p1 increased ROS generation and secretion of cytokines such as IL6 and TNF. The use of bionanotechnology enables the production and incorporation of antimicrobial peptides into controlled release systems that may be used in the treatment of nosocomial infections.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-05-29T13:29:24Z No. of bitstreams: 1 2013_RosaneMansanAlmeida.pdf: 6879054 bytes, checksum: aa646c5f2b16084d67f163cab9539a24 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-06-03T13:08:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_RosaneMansanAlmeida.pdf: 6879054 bytes, checksum: aa646c5f2b16084d67f163cab9539a24 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-03T13:08:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_RosaneMansanAlmeida.pdf: 6879054 bytes, checksum: aa646c5f2b16084d67f163cab9539a24 (MD5) / Escherichia coli de adesão difusa (DAEC) é considerada uma categoria diarreiogênica de E. coli. Essas cepas são identificadas pelo padrão de adesão em cultura de células. A maioria das cepas DAEC possui adesinas da família Afa/Dr. Sua patogenia tem sido muito discutida, embora alguns fatores de virulência já tenham sido propostos. O objetivo principal deste trabalho foi comparar cepas DAEC Afa/Dr isoladas de crianças e de adultos, a partir da análise de características relacionadas à virulência e à formação de biofilmes. Cepas DAEC Afa/Dr oriundas de crianças e adultos apresentaram marcantes diferenças na distribuição de características. Na coleção de adultos, uma nova adesina da família Afa/Dr foi associada aos casos de diarreia. Cepas de crianças, principalmente as de controles, apresentaram grande diversidade de adesinas Afa/Dr, nenhuma delas associada à diarreia. As cepas DAEC mostraram habilidade aumentada de formação de biofilme quando associadas a uma cepa de Citrobacter freundii. O aumento da formação de biofilme foi associado a maior capacidade de adesão a células cultivadas, indicando que cepas DAEC podem apresentar maior capacidade de colonização, dependendo dos parceiros, o que por sua vez, poderia aumentar a efetividade de uma toxina, como SAT - encontrada em número significativamente superior em cepas isoladas de casos de diarreia em crianças. A expressão de curli em meio CRI por cepas DAEC produziu um fenótipo adicional aos conhecidos em Enterobacteriacea. A frequência de curli foi significativamente associada aos casos de diarreia em adultos, sugerindo que curli é um possível fator de virulência nessas bactérias. Genes do TTSS e sorogrupos clássicos de EPEC foram encontrados apenas nas cepas de crianças. Somados, os resultados indicam que cepas DAEC Afa/Dr isoladas de adultos e de crianças constituem duas populações diferentes. _____________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Diffusely adherent Escherichia coli (DAEC) is considered a diarrheagenic category of E. coli. Those strains are identified by their adhesion pattern in cell cultures. Most DAEC strains possess adhesins belonging to the Afa/Dr family. Their pathogenicity has been widely discussed, although some virulence factors have already been proposed. This work’s main goal is to compare DAEC Afa/Dr strains isolated from children and adults, by analyzing characteristics related to virulence and biofilm formation. DAEC Afa/Dr strains from children and adults present remarkable differences in the distribution of the studied characteristics. Among strains from adults, a new adhesin from the Afa/Dr family was associated to cases of diarrhea. Strains from children, especially those isolated from control, present great diversity of Afa/Dr adhesins, none associated with diarrhea. DAEC strains showed an increase in biofilm formation when associated to a strain of Citrobacter freundii. The increase in biofilm formation was associated to a greater adhesion capacity in cultivated cells, indicating that DAEC strains can present a greater capacity for colonization depending on its partners, which, in turn, could increase the effectiveness of toxins, such as SAT - found in significantly higher numbers in strains isolated from cases of diarrhea in children. The expression of curli in the CRI medium produced an additional phenotype, as well as others previously described for Enterobacteriacea. The prevalence of curli was significantly associated to cases of diarrhea in adults, indicating that curli could be a possible virulence factor in those bacteria. Genes from the TTSS and classical EPEC serogroups were found exclusively in strains from children. Taken together, these results indicate that DAEC Afa/Dr strains isolated from adults and children constitute two different populations.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2010-03-02T17:23:51Z No. of bitstreams: 1 2009_AlexLeitePereira.pdf: 8066623 bytes, checksum: 7ecf0efab2fe486b439721642be48825 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-12T13:38:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_AlexLeitePereira.pdf: 8066623 bytes, checksum: 7ecf0efab2fe486b439721642be48825 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-12T13:38:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_AlexLeitePereira.pdf: 8066623 bytes, checksum: 7ecf0efab2fe486b439721642be48825 (MD5) Previous issue date: 2009-05-29 / Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é uma categoria diarreiogênica composta por isolados que expressam o característico padrão de adesão agregativa (AA) em associação com células epiteliais. Nas cepas protótipo de EAEC, o fenótipo AA está associado à presença dos plasmídios pAA que codificam para fímbrias de adesão agregativa (AAF). Não obstante, o padrão AA é um evento multifatorial influenciado pela expressão de adesinas afimbriais, de pili e de fimbriais não associadas aos plasmídios AA. Cepas de EAEC típicas (pAA+) são proficientes na formação de biofilmes, característica considerada fator de virulência consensual desta categoria. Durante um estudo epidemiológico, o isolado C. freundii (Cf) 205 demonstrando fenótipo AA foi isolado de uma criança diarréica juntamente com a cepa de EAEC 205-1. Em ensaios preliminares, foi mostrado que a adesão bacteriana a células epiteliais era intensificada em decorrência da co-infecção por Cf 205 e cepas de EAEC. Este estudo tem por objetivo determinar características de patogenicidade em cepas de C. freundii e definir os eventos biológicos mediadores da ação sinérgica de adesão descrita. Ensaios de adesão a células HeLa e de formação de biofilme, bem como a detecção de marcadores de virulência de E. coli, foram realizados para determinar possíveis associações entre cepas de C. freundii e diarréia. Todas as 28 cepas de C. freundii utilizadas no estudo foram negativas para os fatores de virulência pesquisados. Isolados de C. freundii recuperados exclusivamente de diarréia foram caracterizados pela expressão do padrão AA e pela formação de intenso biofilme, e, então, foram denominados C. freundii agregativo formadores de biofilme (BACF). Para determinar a natureza do efeito sinérgico desenvolvido por C. freundii e cepas de EAEC, ensaios de pré-condicionamento de meio de cultura foram conduzidos com o intuito de verificar a ocorrência eventos de sinalização química. Adicionalmente, análises de ultra-estrutura baseadas em microscopia eletrônica de varredura foram realizadas em complemento a ensaios de agregação bacteriana e de formação de biofilme para verificar o envolvimento de apêndices bacterianos na ação sinérgica descrita. A cepa de BACF 205 mostrou-se capaz de induzir agregação bacteriana quando na presença de cepas de EAEC. Os agregados bacterianos eram mediados por apêndices flexíveis expressos por cepas de EAEC que portavam genes para pilina F (traA). Estruturas semelhantes foram visualizadas nos biofilmes simples formados por cepas de EAEC traA-positivas, como também nos biofilmes mistos intensificados em decorrência da co-cultura de BACF 205 e cepas de EAEC traApositivas. O aumento dos biofilmes mistos produzidos pela combinação BACF 205-EAEC traA-positiva foi abolido por zinco, um inibidor específico de pili F. Complementarmente foi mostrado que zinco inibe seletivamente a maioria dos biofilmes formados por cepas de EAEC típicas isoladas de crianças diarréicas. Em conclusão, supostos pili F expressos por cepas típicas de EAEC incrementam a formação de biofilmes mistos quando na presença de BACF. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) are enteropathogenic strains that display the distinctive aggregative adhesion (AA) when in association with cultured cells. In typical EAEC strains, the AA phenotype is associated with specific fimbriae (AAFs) encoded by plasmids (pAA). However, other factors, including afimbrial adhesins and pili, are also associated with this adherence pattern, indicating its complex nature. The expression of biofilms has been considered a consensual virulence factor among typical (pAA+) EAEC isolates. During an epidemiologic study focusing infantile diarrhea, AA-positive Citrobacter freundii (Cf) 205 and EAEC strains were concomitantly recovered from a severe case of mucous diarrhea. Preliminary assays showed that the coinfection of epithelial cells with Cf 205 and EAEC strains led to an increase in the bacterial adhesion. The aim of this study was to verify the occurrence of pathogenic traits in C. freundii strains as well as to identify the biological events underlying the increase in bacterial adherence. Biofilm and adhesion assays showed that C. freundii strains that displayed aggregative adhesion to HeLa cells and formed strong biofilms were exclusively isolated from diarrhea. This subset of strains was then named biofilm-forming aggregative C. freundii (BACF). All C. freundii strains were tested negative for the EAEC fimbrial genes as well as for others E. coli virulence markers. In attempt to define the nature of the synergic events developed by C. freundii and EAEC strains, pre-conditioned media were used to verify the role of chemical signals in the studied events. Additionally, bacterial aggregation and biofilm assays were carried out and ultrastructurally analyzed employing electron microscopy. The increased adherence was mediated by physical interactions among the bacteria and primed in the absence of chemical signaling. Thus, significant increases in bacterial adhesion were also observed during the formation of mixed biofilms on abiotic surfaces. Bacterial settling assays showed that EAEC strains harboring F-pili genes (traA) were capable of forming bacterial aggregates only in the presence of BACF. In scanning electronic microscopy analyses, it was observed that bacterial aggregates as well as enhanced biofilms formed by BACF and traA-positive EAEC were mediated by non-bundle forming, flexible pili. Moreover, mixed biofilms formed by BACF and traA-positive EAEC strains were significantly reduced using nonlethal concentration of zinc, a specific inhibitor of F pili. In addition, EAEC strains isolated from diarrheic children frequently produced single biofilms sensitive to zinc. In conclusion, putative F pili expressed by EAEC strains boosted the mixed biofilm formation when in presence of biofilm-forming aggregative C. freundii.

Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-03-16T19:35:34Z No. of bitstreams: 1 2010_MarinaHeckmannBove.pdf: 14274068 bytes, checksum: 39c7fd2195ca55b34fee3168e4913b60 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-03-17T00:57:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_MarinaHeckmannBove.pdf: 14274068 bytes, checksum: 39c7fd2195ca55b34fee3168e4913b60 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-03-17T00:57:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_MarinaHeckmannBove.pdf: 14274068 bytes, checksum: 39c7fd2195ca55b34fee3168e4913b60 (MD5) / Embora as Escherichia coli de adesão difusa (DAEC) sejam classificadas como um dos seis grupos de E. coli diarreiogênicas, sua patogenicidade ainda é controversa. Diversas linhagens de bactérias intestinais, incluindo Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Shigella flexneri e Salmonella enterica, possuem em seu genoma uma ilha de patogenicidade (PAI) contendo genes que codificam um Sistema de Secreção do Tipo III (TTSS), responsável pela transferência de proteínas efetoras do citoplasma da bactéria diretamente para o citoplasma da célula hospedeira. A presença de genes TTSS é, portanto, um forte indicativo de virulência. Tendo em vista tais informações, este trabalho teve como objetivos a identificação e caracterização de potenciais genes TTSS de isolados de DAEC recuperados de crianças diarréicas. Experimentos de PCR utilizando iniciadores direcionados aos genes TTSS escD, espA, espD, espB e escF resultaram na detecção de sete prováveis genes em três isolados de DAEC. Dentre as sequências obtidas, detectou-se a presença dos genes espA, espB e escF completos em dois desses isolados de DAEC. Análises de identidade desses genes em relação aos homólogos de diversas linhagens de enteropatógenos sugerem que os isolados de DAEC são bastante heterogêneos. Além disso, as identidades dos genes TTSS de DAEC em relação aos homólogos de diferentes linhagens de E. coli enteropatogênicas e enterohemorrágicas são bastante elevadas, podendo atingir 100%. A construção de árvores filogenéticas empregando as sequências desses genes confirmou tais resultados e demonstrou que os isolados C39 e C74 são evolutivamente mais próximos entre si que em relação à DAEC C40, agrupada no mesmo clado da EPEC prototípica E2348/69. Ensaios de transcrição reversa utilizando RNA dos isolados C39 e C74 revelaram ainda que alguns dos possíveis genes consistem em genes de fato, uma vez que são transcritos sob indução. Com a finalidade de verificar a expressão dos genes TTSS de DAEC foram também realizados experimentos de microscopia eletrônica e de microscopia de força atômica, porém, as imagens obtidas por meio dessas técnicas foram inconclusivas. Conjuntamente, os resultados apresentados neste trabalho sugerem fortemente a presença de uma PAI contendo genes TTSS em DAEC, e constituem evidências a favor da patogenicidade desse grupo de E. coli. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Although diffusely adhering Escherichia coli (DAEC) are classified as one of the six pathotypes of diarrheiogenic E. coli, their pathogenicity is still controversial. Several strains of bacteria, including Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Shigella flexneri and Salmonella enterica, possess a pathogenicity island (PAI), containing genes that code for a Type III Secretion System (TTSS), dedicated to inject effector proteins directly from the bacterial cytoplasm into the host cell cytoplasm. Therefore, the presence of TTSS genes is considered a strong evidence of virulence of a given microorganism. This work describes the identification and characterization of potential TTSS genes in DAEC isolates recovered from diarrheic children. PCR experiments using primers targeted to the TTSS genes escD, espA, espD, espB and escF resulted in the detection of seven putative genes in three isolates of DAEC. Among the sequences obtained, it was possible to detect the presence of the complete espA, espB and escF genes in two of the DAEC isolates. Identity analyses of these genes with different strains suggest that DAEC isolates are quite heterogeneous. Moreover, the identities of TTSS genes of DAEC compared to enteropathogenic and enterohaemorrhagic E. coli are very high, sometimes reaching 100%. The construction of phylogenetic trees using the sequences of these genes confirmed these findings and showed that the isolates C39 and C74 are evolutionarily closer to each other than to the C40 DAEC isolate, which was grouped in the same clade of the prototypical EPEC E2348/69. Tests using reverse transcription of RNA isolated from C39 and C74 also revealed that some of the putative genes consist of true genes, since they were transcribed under induction conditions. In order to analyze the expression of TTSS genes in DAEC, electron microscopy and atomic force microscopy experiments were also carried out, however, the images obtained by these techniques were inconclusive. Together, the results obtained in this work strongly suggest the presence of a PAI containing TTSS genes in DAEC, and constitute evidence for the pathogenicity of this group of E. coli.

A seqüência de nucleotídeos codificante do peptídeo derivado da hidrólise da canatoxina (jaburetox-2Ec), foi clonada e expressa nos sistema pET101/E. coli BL 21. Neste trabalho, estudamos a estabilidade dos plasmídeos da série pET contendo a seqüência codificante do jaburetox-2Ec no sistema de expressão E. coli BL 21 (Mulinari, 2004), e as condições para aumentar produção do peptídeo recombinante, avaliando a velocidade de transferência de oxigênio, o controle do pH, e a utilização da lactose como indutor em substituição ao IPTG. O cultivo da bactéria recombinante em incubadora orbital contendo 10 g/l de lactose como indutor produziu 1,26 μg de jaburetox-2Ec/mg de proteína total após oito horas de cultivo. A estabilidade do plasmídeo e a expressão do peptídeo recombinante foram estudadas em biorreatores. A expressão do jaburetox-2Ec foi fortemente afetada pelo pH da cultura, com a diminuição de mais de 50 % da concentração desse peptídeo quando ocorre acidificação do meio de cultura. Da mesma forma, o aumento da aeração e agitação tem efeito negativo sobre a produção do peptídeo, diminuindo em sete vezes a produção do jaburetox-2Ec Apesar do aumento da biomassa devido ao cultivo da E. coli recombinante em meio mínimo, contendo como fonte de carbono a glicose, isto não representou aumento da concentração do peptídeo recombinante. Contudo, sob a melhor condição de cultivo em biorreator estudada (pH controlado e menor transferência de oxigênio), obteve-se uma produção de 7,14 μg de jaburetox-2Ec/mg de proteína total, representando em torno de 2 % da proteína total da célula. Em todas as bateladas, após atingir a máxima expressão do peptídeo, essa concentração diminui provavelmente devido à atividade das proteases da célula causando a degradação do peptídeo recombinante. A carga metabólica imposta à célula devido à expressão do jaburetox-2Ec, é uma das possíveis causas da instabilidade do plasmídeo observada em todas as bateladas.

As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são as células reprogramadas com fatores de transcrição, como Oct-4, Sox-2, Klf-4 e c-MYC (OSKM). As iPSCs são geralmente obtidas pela expressão ectópica de vetores retrovirais e lentivirais contendo os fatores transcricionais OSKM. No entanto, a utilização de sistemas de expressão virais pode levar a mutagênese de inserção e geração de células tumorais. Assim, é preferível que a reprogramação celular ocorra temporariamente por meio de fatores OSKM fusionados com sequências de peptideos para a transdução de proteínas. Neste sentido, os genes sintéticos codificadores de transdução de péptidos fusionados ao N ou C-terminal de OSKM pode ser obtido por ferramentas da bioinformática específicos e sintetizados utilizando técnicas químicas avançadas. Esses genes sintéticos podem ser aplicados para a síntese de proteínas utilizando tanto técnicas in vivo quanto in vitro. Assim, o objetivo deste trabalho foi gerar fatores OSKM fusionados a transportana (TP10) usando genes sintéticos e sistema de transcrição e de tradução in vivo. Além disso, três genes sintéticos adicionais também foram obtidos para expressão de Oct-4 contendo TP10 fusionado na região N-terminal (N-OCT4-TP10), C-terminal (C-OCT4-TP10), e sem TP10 (Oct-4). A expressão ectópica dos três genes sintéticos para Oct-4 foram testadas in vivo em duas diferentes linhagens comerciais de E. coli que expressam a enzima de T7 RNA polimerase. Os dados de Western blot indicaram que todos os genes sintéticos de Oct-4 foram capazes de produzir proteínas recombinantes. No entanto, a expressão mais elevada foi obtida com a construção N-OCT4-TP10. Além disso, as proteínas do fator de transcrição Oct-4 obtitdas foram avaliadas quanto a sua capacidade de ligação a sua respectiva seqüência-alvo de DNA sendo avaliada por meio dos extratos brutos das proteínas de E. coli contendo ou não Oct-4 proteínas ectópica. Os dados do ensaio de ligação demonstraram que todas as sequências de Oct-4 foram capazes de se ligar às suas sequências de reconhecimento. Em conclusão, as proteínas Oct-4 funcionais fusionadas com o peptideo o transdutor pode ser obtido a partir de genes sintéticos, permitindo potencialmente elaborar protocolos de reprogramação virais livres. / Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed cells with a transcription factors such as Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-MYC (OSKM). iPSCs are generally obtained by ectopic expression of retroviral and lentiviral vectors containing tOSKM. However, the use of viral expression systems can lead to insertional mutagenesis and generation of tumor cells. Thus, it is preferable to temporarily reprogram cell by means of OSKM factors fused to peptides sequences for protein transduction. In this sense, synthetic genes coding to transduction peptides fused to the N- or C-termini of OSKM can be designed by specific bioinformatics tools and synthesized using advanced chemical techniques. Those synthetic genes can be applied for protein synthesis using both in vivo and in vitro techniques. Thus, the objective of this work was to generate OSKM factors fused to transportan (TP10) using synthetic genes and in vivo transcription and translation systems. Moreover, three additional synthetic genes also were obtained for Oct-4 expression containing TP10 fused to: (i) N-terminus (N-OCT4-TP10), e, (ii) C-terminus (C-OCT4-TP10), and (iii) without TP10 (Oct-4). Ectopic expression of the three synthetic genes for Oct-4 was tested in vivo in two different commercial strains of E. coli expressing the enzyme T7 RNA polymerase. Western blot data indicated that the all Oct-4 synthetic genes were able to produce the recombinant protein. However, highest expression was obtained with the construction N-OCT4-TP10. Furthermore, the binding capacity of Oct-4 fusion proteins in these respective target DNA sequences was assessed by the evaluation of E. coli protein extracts containing or not ectopic Oct-4 fusion proteins. Data from binding assay demonstrated that all Oct-4 sequences are able to bind to its recognition sequences. In conclusion, functional Oct-4 proteins fused to transducer peptides can be obtained from synthetic genes, allowing to potentially design viral-free reprogramming protocols.

Orientadores: Wanderley Dias da Silveira, Marcelo Palma Sircili / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T16:00:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maturana_VictorGoncalves_M.pdf: 5059455 bytes, checksum: b3305e2d1e0d658292aa1e194e68fb8f (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Escherichia coli patogênica para aves (APEC) causa diferentes tipos de infecções sistêmicas extraintestinais nestes hospedeiros, coletivamente denominadas colibaciloses, causando grandes prejuízos econômicos à indústria aviária. Essas doenças incluem, dentre outras, septicemia, onfalite, celulite e síndrome da cabeça inchada. Entretanto, não há até o momento wna descrição de genes ou características que permitam classificar as linhagens aviárias em patótipos responsáveis por causar doenças específicas em seus hospedeiros, a semelhança do que ocorre para linhagens de E. co/i patogênicas para seres humanos. O objetivo deste estudo foi caracterizar linhagens de Escherichia coli de origem aviána representantes de 4 grupos, sendo um grupo de linhagens comensais (AFEC - stgla em inglês para "Avian Fecal Escherichia co/i") e três grupos de linhagens patogêmcas, causadoras de três sindromes diferentes em seus hospedeiros (septicemia, síndrome da cabeça inchada e onfalite). Para o trabalho, as características biológicas estudadas foram: adesão em células eucarióticas, formação de biofilme, produção de molécula sinalizadora de quorum sensing, presença de genes de ilhas de patogenicidade, dose de letalidade (LD50), grupo filogenético e presença de genes de virulência. A comparação entre as diferentes linhagens com base nestes traços genotípicos e fenotípicos, por meio de diferentes ferramentas de estatística multivariada além de redes complexas, permitiu inferir a estrutura populacional do grupo estudado. Os resultados indicam que APEC não constitui um grupo homogêneo, mas um conjunto estruturado de diferentes subgrupos, cada um associado a uma síndrome infecciosa específica causada no hospedeiro, possivelmente definindo diferentes patótipos ou subpatótipos dentro de linhagens APEC. Assim, sugerimos a existência de um subpatótipo associado à onfalite, com características de letal idade semelhantes as de linhagens AFEC, mas com um padrão de adesão diferente, que pode ser atribuído a uma especialização do grupo relacionada a colonização de um nicho particular, o saco da gema do ovo. E um subpatótipo associado à síndrome da cabeça inchada, igualmente adaptado à patogenicidade, mas com características mais "agressivas" evidenciadas pelos altos índices de letalidade, grande número de genes de virulência e altos índices de adesão. Linhagens associadas à septicemia, contudo, não constituem um grupo coeso, sugerindo tratar-se de uma miscelânea de linhagens que podem pertencer a diferentes subpatótipos e que em última instância geram a síndrome sistêmica (septicemia), devido à evolução do quadro clínico e/ou às condições imunológicas do hospedeiro. Este trabalho é pioneiro em demonstrar a existência de subpatótipos dentro de linhagens APEC, relacionando diferentes síndromes infecciosas com grupos específicos de linhagens as quais possuem características fenotípicas e genotípicas particulares. Tais resultados abrem novas possibilidades no estudo de genes responsáveis pelos diferentes processos de patogênese em APEC, bem como no desenvolvimento de vacinas. Talvez seja importante considerar estes subgrupos no desenvolvimento de vacinas, com o intuito de produzir vacinas com proteção cruzada, o que ainda não foi atingido com sucesso para linhagens APEC. / Abstract: Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC) cause different types of systemic extraintestinal infections in poultry, which are collectively termed colibacillosis, imposing significant economic casses for the avian industry Among these diseases are septicaemia, omphalitis, cellulites and swollen head syndrome. However, to the date, there is no description of genes or characteristics which allow us to classify avian strains in pathotypes responsible for causing specific diseases in their hosts, as there are for human pathogenic E. co/i strains. In this study we aimed to characterize avian pathogenic E. co/i strains representing 4 groups, one of commensal strains (AFEC - Avian Fecal Escherichia co/i) and 3 groups of pathogenic strains responsible for causing 3 different syndromes in their hosts (septicaemia, omphalitis and swollen head syndrome). The biological characteristics studied were: adhesion to eukaryotic cells, biofilm formation, capacity of synthesizing quorum sensing s1gnaling molecule, presence of pathogenicity island, pathogenicity levels according to lethal dose (50%) assay, phylogenetic group and presence of virulence genes. The comparison between strains based on these genotypic and phenotypic traits, by different multivariate statistics tools and complex network, allowed us to infer. the population structure of the studied group. The results indicate that APEC do not constitute a unique homogeneous group, but a structured set of different subgroups, each one associated to a specific infectious syndrome inflicted to the host, possibly defining pathotypes or subpathotypes within APEC strains. Thus, we suggest the existence of a subpathotype associated to omphalitis, with lethality characteristics similar to AFEC strains, but with a different adhesion pattem, which may be due to a specialization related to the colonization of a particular niche, the egg's yolk sac. Anda subpathotype associated to the swollen head syndrome, equally adapted to pathogenicity, but with more "aggressive" characteristics demonstrated by the high lethality and adhesion levels. Septicaemic strains, however, do not constitute a cohesive group, which suggests a constellation of strains associated to different subpathotypes and capable of, eventually, cause a systemic syndrome (sepsis), due to the clinical evolution of the illness ami/or host immunological conditions. This work is pioneer in demonstrating the existence of subpathotypes within APEC strains, relating different infectious syndromes to specific groups of strains possessing particular genotypic and phenotypic characteristics. These results offer new possibilities in studying the genes responsible for different pathogenesis processes within APEC and for the vaccine developing. It may be important to consider these subgroups in the process of vaccine developing, in the efforts for obtain cross protection, which had not yet being accomplished successfully concerning APEC strains. / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

orientador: Domingos da Silva Leite / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T16:22:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pancetti_AlessandraRoque_M.pdf: 4244205 bytes, checksum: 53fdcd93d28647a26b93f7db9190a2f2 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Neste trabalho foram pesquisadas as melhores condições de cultivo e estocagem da amostra de Escherichia coli 86-6136 para a produção da Toxina Citoletal Distensora (CLDT), assim como o melhor método de extração e purificação para a caracterização parcial da toxina. Após o que, foi realizada a produção de anticorpos neutralizantes policlonais em coelhos albinos e a análise dos efeitos citopáticos e citotóxicos da CLDT em cultura de células. O melhor meio para cultivo da amostra 86-6136 encontrado foi o "Evans Toxin Medium", pois com este meio foi verificada a produção de CLDT em ensaios de atividade citotóxica em cultura de células, com efeito semelhante ao descrito em literatura. Os estudos de obtenção da toxina demonstraram que o método mais vantajoso para a extração era a ultrasonicação do sedimento bacteriano, pois dispendia menos tempo e havia boa recuperação da atividade citotóxica, quando comparado com os outros métodos empregados, além de existir ganho no rendimento de mais de 4 vezes em atividade específica e 2 vezes em citotoxicidade, quando comparado ao sobrenadante inicial. Após a extração, o material foi submetido a diversos processos cromatográficos (Deae-Sepharose Fast-Flow; CM-Sepharose Fast-Flow; Phenil Sepharose; Sepharose CL6B; Sepharose CL4B; Superdex 200). A cromatografia que teve mais relevância para melhorar o grau de pureza da amostra foi em Sepharose CL6B. A amostra, quando submetida a cromatografia nesta resina, mostrou padrão de eluição com 3 picos, sendo que a atividade biológica estava concentrada no primeiro pico. Em eletroforese com SDS-P AGE, o material contendo atividade biológica apresentou 3 bandas, com os pesos moleculares estimados em 38,8; 37,3 e 22,4 kDa. Não foram obtidos resultados em ensaios eletroforéticos em P AGE convencional. Os ensaios cromatográficos em Sepharose CL6B resultaram em aumento de 100 vezes na citotoxicidade da amostra, e 237 vezes em atividade relativa. Os ensaios em cromatografia líquida de alta performance (HPLC) em coluna Mono-Q não permitiram a recuperação da atividade citotóxica da toxina CLDT, e por isso foram abandonados. A atividade da toxina CLDT pôde ser observada em cultura de células Vero, HeLa e CHO. Apenas nas células CHO tanto o efeito citopático quanto o citotóxico foram observados. Em ensaios em células Vero e HeLa, o efeito de distensão celular não é evidente, e em células Vero, a viabilidade celular, ao final das 120 hrs de ensaio, é bem maior em relação às outras duas linhagens. A produção de anticorpo policlonal em coelhos albinos pôde ser verificada em teste de imunodifusão radial dupla, e sua capacidade neutralizante foi observada em ensaios de soroneutralização em cultura de células CHO. Os antissoros obtidos apresentaram atividade neutralizante do efeito citotóxico da toxina CLDT no título até 1/1024 / Abstract: In this work, the best conditions of culture and stock methods of EscherichiQ coli 86-6136 strain for the production of citolethal distending toxin (CLDT), as well as its partial characterization, were studied. The production of polyclonal antibodies in rabbits and the study of citophatic and citotoxic effects of CLDT in culture cells was determined. The best growth medium found for CLDT production was Casaminoacid- Yeast Extract CA YE), as determined by biological activity assays in culture cells. The best method for CLDT extraction was sonic disruption of the bacterial cells. Higher yield of citotoxic activity was reached when compared to other methods, in addition to 4-fold increased specific activity and 2-fold citotoxicity, compared to the initial culture supernatant. After bacterial cells disruption, the supernatant was cromatographed on several columns (Deae-Sepharose Fast-Flow; CM-Sepharose Fast-Flow; Phenil-Sepharose; Sepharose CL6B; Sepharose CL4B; Superdex 200). The best method for increasingpurity was Sepharose CL6B. The material was separated in three peaks spectrophotometrically detected (absorbance 280 nm) among these the first one displayed biological activity. On SDS-PAGE, this material exhibited three bands whose M.W. were 38.8, 37.3 and 22.4 kDa. After cromatography on Sepharose CL6B, the material displayed increased citotoxicity and relative activity of 100 and 237-fold, respectively. High-performance liquid chromatography (HPLC) on Mono-Q column resulted in unrecoverable biological activity. The CLDT biological activity could be observed in Vero, ReLa and CRO cultured cells. Only in CRO, both citophatic and citotoxic effects could be observed. In Vero and HeLa cells the cellular progressive distention could not be observed and in Vero cells cellular viability was higher than in the other cells after 120 hr. Production of polyclonal antibodies was verified in Ouchterlony test and its neutralization capability was determined in seraneutralization tests in CHO cells. The sera obtained was shown to neutralize citotoxic activity of CLDT up to the 1/1024 dilution / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Ciências Biológicas