Two major proteins of the outer membrane of Escherichia coli, the matrix protein, A (M.W. 36,500) and the heat-modifiable protein, B were purified and partially characterized. Both have a low content of cysteine, . an excess of acidic amino acids over basic and a moderate content of hydrophobic amino acids. Protein B (M.W. 28,500) was converted to form B* (M.W. 33j^00) upon heating in the presence of sodium dodecyl sulfate at temperatures higher than 50°C. Physical studies showed that protein B unfolds upon heating without a large increase in binding of sodium dodecyl sulfate. It is proposed that protein B as extracted from the membrane contains some native structure which is lost upon heating. The level of protein A1, a major outer membrane protein in glucose-grown cells, was decreased in cells grown on other carbon sources with a concomitant increase in the amount of protein A2. Both proteins were tightly associated with the peptidoglycan and had similar amino acid composition, suggesting that they play the same role in the outer membrane. The organization of proteins in the outer membrane of E. coli was studied by proteolytic digestion, covalent labelling and crosslinking. The proteins of the outer membrane were inaccessible to pronase in intact cells and the cells altered in their lipopolysaccharide component. The protein components of isolated outer membrane preparations varied in their rates of digestion and labelling with fluoresca- ' mine, suggesting that they are asymmetrically arranged in the membrane. The proteins most rapidly degraded (proteins B,C-,D1 and E) were judged to be exposed at the surface of the membrane, while those resistant to digestion (proteins A1,A2 and D2) must be protected by their arrangement in the membrane. Digestion of outer membrane preparations with pronase left a fragment derived from protein B (protein Bp) embedded in the membrane. This fragment was not enriched in hydrophobic amino acids relative to protein B. Protein B could be reassociated with itself j without phospholipid or lipopolysacchari.de such that pronase digestion of the reassociated material gave protein Bp. These results suggest that protein B may not be held in the membrane primarily by hydrophobic interactions. The resistance of proteins A1 and A2 to protease digestion is likely due to protein-protein interactions since oligomers of protein A could be isolated. Treatment of protein A1- or A2-peptidogly-can complexes with dithiobis (succinimidyl propionate) or glutaraldehyde produced dimer, trimer and higher oligomers of protein A. No crosslinking of protein A to the peptidoglycan was detected. The proteins of the isolated outer membrane varied in their ease of crosslinking. Protein B, but not the pronase-resistant fragment, protein Bp, was readily crosslinked to give high molecular weight oligomers, while protein A formed dimers and trimers under the same conditions. No crosslinking of protein A to B was detected. Crosslinking of cell wall preparations showed that protein B and the free form of the lipoprotein, F, could be linked to the peptidoglycan. A dimer of protein F, and protein F linked to protein B, were detected. These results suggest that specific protein-protein interactions occur in the outer membrane. A model for the arrangement of the proteins in the outer membrane of E. coli, summarizing the results of proteolytic digestion, covalent labelling and crosslinking, is presented. / Medicine, Faculty of / Biochemistry and Molecular Biology, Department of / Graduate

During amino acid deprivation, the amount of meso-diaminopimelic acid (Dap) incorporated into peptidoglycan by dap lys amino acid auxotrophs of Escherichia coli was found to be dependent on the activity of the relA gene product. In relA⁺ bacteria, the- incorporation was substantially reduced, whereas the incorporation in relA⁻ bacteria was essentially equal to that in the unstarved control. The inhibition of Dap incorporation in relA⁺ bacteria was readily overcome by restoration of the required amino acid or by addition of chloramphenicol (CAM). Guanosine 5'-diphosphate 3'-diphosphate (ppGpp) is the product of the reaction between the relA gene product and idling ribosomes in stringent cells. In vitro experiments indicated that physiological levels of ppGpp inhibited at least two steps in peptidoglycan biosynthesis. One was the phospho-N-acetylmuramoyl-pentapeptide transferase (EC2.7.1.13) reaction and the other inhibition was probably at the transfer of peptidoglycan precursors from the glycosyl carrier lipid (GCL) to the nascent peptidoglycan. Quantitation of the peptidoglycan precursors and the net peptidoglycan in relA⁺ control and amino acid-deprived bacteria indicated that peptidoglycan accumulation was inhibited. There was as much UDP-MurNAc-pentapeptide and GCL-linked intermediates in the amino acid-deprived bacteria as in the control bacteria. This suggests that the transfer of lipid-linked precursors to nascent acceptor is the site of inhibition of Dap incorporation. In addition, the pool of soluble nucleotide-linked precursors was found to accumulate when relA⁻ bacteria were deprived of required amino acids. This suggests that the size of the precursor pool is also regulated by the activity of the relA gene product. / Science, Faculty of / Microbiology and Immunology, Department of / Graduate

Le cancer colorectal est un des cancers les plus fréquents en France. Les patients présentant une inflammation chronique de l'intestin sont à haut risque de développer un cancer colorectal. Il a récemment été démontré que certaines bactéries de l'espèce Escherichia coli pouvaient être impliquées dans la genèse de maladies inflammatoires intestinales, par des mécanismes d'adhésion et d'invasion aux cellules épithéliales intestinales faisant intervenir le récepteur CEACAM6, marqueur tumoral reconnu dans le cancer colorectal. Nous avons montré que certaines bactéries de l'espèce E. coli colonisaient la muqueuse colique de patients atteints de cancer colorectal et possédaient des propriétésd'adhésion et d'invasion dans les cellules épithéliales intestinales. Ces souches synthétisent des cyclomodulines variées susceptibles de jouer un rôle dans la carcinogenèse colique, et colonisent davantage les tumeurs les plus évoluées. Une corrélation a été observée entre la colonisation de la muqueuse colique par un clone unique de ces E. coli et l'expression du récepteur CEACAM6. Nous avons montré in vitro que certains clones de pouvaient induire l'expression de CEACAM6 par des cellules épithéliales intestinales en culture. Enfin, sur modèle animal transgénique exprimant le récepteur humain CEACAM6, ces mêmes clones ont montré des capacités de colonisation très supérieures à desE. coli non pathogènes, et l'induction d'une surexpression de marqueurs de prolifération au niveau de la muqueuse colique. Les E. coli associés à la muqueuse colique pourraient ainsi participer à la promotion du cancer colorectal via l'induction d'une surexpression du récepteur CEACAM6 et d'une hyperprolifération des cellules épithéliales. / No abstract available

Orientador : Domingos da Silva Leite / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-31T17:42:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_AlexSouzada_M.pdf: 2809054 bytes, checksum: a7208782bc39f37dd5ae5103b7c97476 (MD5) Previous issue date: 2002 / Mestrado

Orientadora : Marlene Braide Serafim / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-16T07:14:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Said_AparecidaCellideAlmeida_M.pdf: 2680850 bytes, checksum: 6c29a5202e3546b45fb97f05fb19511b (MD5) Previous issue date: 1985 / Resumo: Trabalhamos com 64 amostras Escherichia coli, já sabidamente produtoras de enterotoxina termolábil (LT), provenientes de diversas fontes, (humanas, suínas, alimentos e água de rio). Essas amostras foram examinadas nos testes de imunohemólise passiva (IHP) e ELEK modificado (Biken), procurando-se comparar o desempenho desses dois testes na detecção de LT, utilizando-se para isso os antissoros: anti LT humano (anti-LTh); anti LT suíno (anti-LTs); antitoxina colérica (anti TC) e anti coleragenóide (anti-Cg). As toxinas LT de origem humana (LTh) e de origem suína (LTs), necessárias para obtenção dos respectivos antissoros, foram purificadas segundo o método de Clementes & Finkelstein (6), e posteriormente inoculadas em coelhos seguindo-se o esquema de imunização proposto por Honda et alii (33). Já o soro ant-Cg, e a toxina colérica purificada nos foram doados, sendo o soro ant-TC obtido através de inoculação da mesma em cavalo, seguindo-se o mesmo esquema de imunização utilizado para a obtenção dos antissoros anti-LTh e anti-LTs (33). Os antissoros foram então titulados nos testes de IHP e Biken, frente as amostras padrão de Escherichia coli produtora de LT, de origem suína. Uma vez conhecidos os títulos dos mesmos, passamos ao exame das 64 amostras com cada um dos antissoros, em ambos os testes, IHP e Biken ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Not informed. / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Antonio Fernando Pestana de Castro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-16T22:05:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ricci_LucilaCostallat_D.pdf: 10174303 bytes, checksum: ecb6e9b94df041a1820a718f3691aec2 (MD5) Previous issue date: 1987 / Resumo: Nas reações sorológicas de imuno-hemólise passiva (IHP), imuno-hemólise radial (IHR) e hemaglutinação indireta (IH), usadas na detecção das enterotoxinas LTs de Escherichia coli, de origem humana e suína e toxina colérica, estas se absorvem naturalmente as hemácias de carneiro, sem a necessidade de qualquer agente ligante. Esta ligação só poderia ser explicada, pela presença de receptores específicos para estas essas enterotoxinas nessas células, que até o momento, não haviam sido identificados e caracterizados. Como o propósito de esclarecermos a natureza desses receptores, nos propusemos, no presente trabalho, a estudar os seguintes itens: a) Verificar a sensibilização de eritrócitos de galinha cobaia, boi e do homem, pelas enterotoxinas LTs, de origem humana e suína e TC, a fim de obtermos subsídios para podermos comparar eventuais diferenças nos receptores para estas toxinas em hemácias, além de uma provável adaptação das técnicas sorológicas de IHP, IHR e HI, à essas células. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Not informed. / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador : Tomomasa Yano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-17T03:11:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leite_DomingosdaSilva_M.pdf: 6050410 bytes, checksum: dac8ea3da299a8f11a6af5ddd92d6db5 (MD5) Previous issue date: 1986 / Resumo: No presente trabalho, procuramos purificar e caracterizar fíSico-química e biologicamente o antígeno de aderência F42 produzido pela amostra de Escherlch1a col1 enterotoxigênica (STa) de origem suína,além de verificar quais as melhores condições de cultivo para a sua produção.Verificamos que o meio Mínimo A é o meio de cultura mais apropriado para a produção do antígeno F42.Quando a amostra de E.col! 5&7/7 foi cultivada a 372C, produziu o antígeno F42 que apresentou atividade hemaglutinante, o mesmo não foi observado quando a amostra em estudo foi cultivada a 182C. A adição de D-alanina ou de acetato de s6dio ao meio Mínimo, inibiu a produç~o do antígeno F42. A produç~o do antígeno F42 é dependente da presença de glicose.o pH do meio Mínimo deve ser neutro ou alcalino, pois em pH ácido o antígeno F42 não foi produzido.o antígeno F42 extraído por aquecimento, foi purificado por precipitaç~o com sulfato de amônio, tratamento com desoxicolato de s6-dio e cromatografia em coluna de Sepharose 4B.Verificamos que seu peso molecular é de 31.000 daltons e ponto isoelétrico próximo ao pH 3,2. A análise sorologica do antígeno F42, por Imunodifusão e Imunoeletroforese, mostrou que este era diferente dos antígenos de aderência de origem animal conhecidos. . ... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Not informed. / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Fumio Yokoya / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agricola / Made available in DSpace on 2018-07-17T06:48:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rossell_CarlosEduardoVaz_D.pdf: 3428895 bytes, checksum: 6ed68815173eb2da63f7abdd96b0868b (MD5) Previous issue date: 1976 / Resumo: Foi estudada a produção de penicílinainidahidrolase (PAH) por fermentação com Escherichia coli ATCC 3637, em fermentadores de laboratório, banco e piloto. No meio de fermentação empregado, baseado em água de maceração de milho, a cinética de crescimento apresenta duas fases exponenciais sucessivas. A mudança de uma a outra é provocada pela limitação de oxigênio dissolvido, A programação do incremento da taxa de transferência de oxigênio em função do tempo controla a duração relativa de ambas as fases. A velocidade específica de crescimento no primeiro período (µI) foi bem maior que no segundo (µII) - A produção de PAH segue uma cinética exponencial, ficando associada ao crescimento celular e sendo maior quanto menor o valor de µII. Quando µ tende a ymax. não se tem o acumulo de enzima. São condições necessárias para a produção de PAH a adição de ácido fenilacético como indutor e a manutenção da concentração de oxigênio dissolvida a valores muito baixos. Foi desenvolvido ura modelo cinético para a produção de PAH, baseado nas variáveis mencionadas. A fermentação foi ampliada de escala de um fermentador banco com 10 litros de meio até um fermentador piloto com 15 a 20 vezes este volume de meio de fermentação. Entre ambas unidades não se manteve similaridade geométrica. O critério seguido na ampliação da escala foi a de manter as velocidades tangenciais no agitador na mesma ordem para o modelo e o protótipo, a porcentagem da tensão de oxigênio dissolvido próxima de zero, ajustando a taxa de transferência de oxigênio máxima e o coeficiente volumétrico de transferência de massa (k1a) mediante a taxa de aeração. De uma análise dos resultados obtidos experimentalmente concluiu-se que (k1a) ou a área interfacial (a) podem ser descritos mediante as correlações de Yoshida para k1a ou de Calderbank para a, desde que seja substituído nas mesmas a velocidade de aeração associada com a secção transversal do fermentador (Vs) pela velocidade de aeração associada com a secção total dos orifícios do distribuidor. Os rendimentos de PAH foram da mesma ordem em escala banco e piloto / Abstract: Penicillinamidohiydrolase (PAH) production by Escherichia coli ATCC 9637 was studied in laboratory, bench and pilot scale fermentors. Using a culture medium based on corn steep liquor, it was shown that kinetics of growth has two succesive exponential phases. The shift from one to the other is caused by limitation of dissolved oxygen. The relative length of those phases can be controlled by programming the increment of oxygen transfer rate with time. The specific growth rate during the first period is larger than the second period. PAH production follows .exponential kinetics and it is associated with cell growth being larger if the second growth phase shows the slower rate (µII). When the value approaches the µmax no enzyme accumulation was observed. The conditions required for PAH production were the addition of phenylacetic acid as inducer and the maintenance of dissolved oxygen concentration at very low level. A kinetic model for the production of PAH was developed based on the variables above mentioned. Fermentation was scaled-up from a bench fermentor with ten liters of medium to a fermentor with 15-20 times larger volume. Geometric similarity was not maintained between those units. The criteria followed for scaling-up were to maintain a similar peripheral velocity at the tip of the impeller between model and prototype, and the percent of dissolved oxygen tension near zero. Adjustment of the maximum oxygen transfer rate and volumetric mass transfer coefficient (k1a) was acomplished by changing air rate. It was concluded, from experimental data, that (k1a)or the interfacial area (a) can be described by the correlation of Yoshida for k1a or Calderbank for a, if the surface air velocity at the cross section of the fermentor (Vs) is replaced by air velocity at the total area of holes in the sparger. Yield of PAH obtained in bench and pilot scale fermentor was the same / Doutorado / Doutor em Ciências e Tecnologia de Alimentos

Tese (livre-docencia) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-17T22:00:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Yano_Tomomasa_LD.pdf: 2699113 bytes, checksum: 8356f2338c5b27cb5ab8aadb11675ed7 (MD5) Previous issue date: 1987 / Resumo: Entre 70 amostras de Escherichia coli verocitoto-xigênicas (VTEC) isoladas de bezerros com diarréia foram selecionadas 4 (55/3, 492, 494/4, 495/2), sorologicamente identificadas como pertencentes ao sorogrupo 0125, que, quando examinadas pela prova de microhemaglutinacão manose-resistente (MHMR) foram capazes de aglutinar apenas hemácias humanas. Este dado sugeria a possibilidade de que tais amostras fossem produtoras de um antígeno de aderência, por nós designado provisoriamente de EAF44. Suspensões bacterianas destas amostras cultivadas em meio mínimo solido {MMS), incubado a 379C, e/ou o antígeno EAF44 semi-purifiçado obtido a partir destes cultivos, foram estudados através de diferentes procedimentos que incluíram: a) Atividade MHMR comparada com a descrita para outros fatores de colonização tais como: F4,F5,"F41" e "F42"; b) inibição da MHMR, usando-se antissoros homólogos e heterólogos para os antígenos acima mencionados; c) fatores que poderiam influenciar na expressão do antlgeno EAF44 "in vitro", utilizando-se para tal, a prova de MHMR frente a hemácias humanas e/ou microscopia eletrônica. Entre esses fatores selecionamos: temperatura de incubação das culturas, variação de pH do meio de cultura (MMS) e, adição a este de, compostos tais como glicose, acetato de sódio e DL-alanina; d) teste de aderência às células HeLa em presença de D-manose da amostra de VTEC 55/3 cultivada a 379C e a 169C. Inibição desta aderência com antissoro anti-EAF44; e) estudo através da microscopia eletrônica da amostra de VTEC 55/3 produtora de antígeno EAF44, com a finalidade de identificar na mesma a presença de estruturas do tipo fímbria; f) semi-purificação do antígeno EAF44, usando-se técnicas semelhantes âs descritas, com este objetivo, para outros antlgenos de aderência; g) estudos das relações antigênicas entre o antígeno EAF44 e outros fatores de colonização (F4,F5,"F41" e "F42"), descritos em amostras E. coli enterotoxigênicas (ETEC) de origem animal; h) pesquisa, através de teste de alça ligada de coelho, de possíveis alterações histológicas causadas pelas amostras de E. coli 55/3, produtora do antígeno EAF44 e de verocitotoxina (VT). Os principais resultados e conclusões decorrentes destes estudos podem ser assim resumidos: 1) As amostras de VTEC, isoladas de bezerros com diarréia e por nós estudadas, foram capazes de aglutinar, especificamente, na presença de D-manose, apenas hemácias humanas. Resultados semelhantes foram obtidos com o antígeno EAF44 semi-purificado. Este perfil de MHMR mostrou ser totalmente distinto dos descritos para outros fatores de colonização, mas especificamente F4,F5,"F41" e "F42". 2) Os testes de inibição de MHMR mostraram que apenas antissoro anti-EAF44 foi capaz de inibir efetivamente a hemaglutinação das amostras de VTEC (55/3,494/2,494/4, 495/2), sugerindo, portanto, que o antlgeno em questão era antigenicamente diferente dos demais fatores de colonização por nós estudados. 3) Entre os fatores que poderiam influenciar na expressão do antlgeno EAF44 "in vitro" foi verificado que: 3.1. A produção do antlgeno EAF44, quando medida por teste MHMR e verificada através da microscopia eletrônica/ foi inibida quando cultura da amostra VTEC 55/3 era incubada a 169C. Ao contrário, em cultivos incubados a 379C houve produção do antlgeno EAF44. Estes resultados são bastante semelhantes aos observados com outros fatores de colonização, codificados por plasmídios presentes em amostras de ETEC de origem animal. 3.2. A adição de glicose, ao MMS, a semelhança do que ocorre como antlgeno "F42" é necessário para ex pressão deste antlgeno, detectável pela prova de MHMR. 3.3. A adição de DL-alanina ao MMS não interferiu na produção do antlgeno EAF4 4 em culturas da amostra de VTEC 55/3, quando " examinada pela prova de MHMR. Estes resultados são contrários aos observados com os antígenos F5,"F41" e "F42" cuja produção foi inibida por este aminoácido. 3.4. A produção do antígeno EAF44, mediada pela prova de MHMR, foi inibida por acetato de sódio adicionado ao MMS na concentração de lOOmM. Estes resultados foram parcialmente semelhantes aos obtidos, com relação ao antígeno "F42" que, cuja produção, embora inibida por este sal, ocorreu em con contrações menores. 3.5. Culturas da amostra de VTEC 55/3 cultivadas em MMS com pHs que variaram entre 5,4 a 8,2 mostraram, a semelhança do que já foi relatado para os antígenos F5 e "F42", que a produção do antígeno EAF44, também examinada pela prova de MHMR, não ocorreu em pH ácido. Os resultados obtidos nos testes de aderência às células HeLa ,da amostra de E. coli 55/3 cultivada a 379C, mostrou uma aderência do tipo difuso, mesmo na presença de D-manose. 0 teste de inibição de aderência frente a antissoro anti-EAF44 demonstrou que este fenômeno era efetivamente causado pelo antígeno EAF44. Os estudos de microscopia eletrônica, aliados a outros dados referentes a MHMR e aderência ã células HeLa e respectiva inibição destas propriedades por antissoro anti-EAF44, mostraram que este antígeno era constituído por uma estrutura do tipo fímbria, cuja expressão ocorria em cultivos incubados a 379C, sendo porém, inibida quando a temperatura de inci.bação era 169C. Estes dados são semelhantes aos relatados para outros fatores de co Ionização, presentes em amostras de E. coli do grupo ETEC de origem humana e animal. 6. Os testes de imunodifusão dupla e imunoeletroforese pro varam, que o antígeno EAF44 é antigenicamente diferente dos demais fatores de colonização incluídos na presente pesquisa, ou seja, F4,F5,"F41" e "F42". 7. A inclusão do teste de alça ligada em coelhos, no estudo da amostra de E. coli 55/3 produtora de VT e do antígeno EAF44, partiu do pressuposto de que este antígeno de aderência q na realidade, um provável fator de colonização para os bezerros suceptíveis. Este ensaio te ve, portanto, como objetivo, pelas características do teste, averiguar uma ação direta da VT sobre o epitélio intestinal destes animais. Entre várias alterações observadas foi relevante o achado histológico de uma severa desorganização da estrutura da mucosa do intestino delgado e do intestino grosso, em especial no epitélio do revestimento. Foram observadas ainda alterações na lâmina própria da mucosa, caracterizados por restos nucleares! Estes achados foram semelhantes a outros relatos da literatura sobre experimentos "in vivo" realizados com amostras de VTEC de origem humana e animal. 8. Finalmente, diante de todos os resultados por nós obtidos, podemos afirmar que as amostras de VTEC, isoladas de bezerros com diarréia, pertencentes ao sorogrupo 0125 produzem um antígeno de aderência do tipo fímbria, semelhante em várias propriedades aos antígenos F5,"F41" e "F42", porém, distinto destes, sob o ponto de vista antigênico. Ao que nos consta, é este o primeiro relato na literatura sobre a existência de um antígeno de aderência com estas características em amostras de E. coli do grupo VTEC isoladas de bezerros com diarréia / Abstract: Not informed / Tese (livre-docencia) - Univer / Microbiologia / Livre-Docente em Ciencias Biologicas

Orientador : Wanderley Dias da Silveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-18T07:56:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sperandio_Vanessa_M.pdf: 5909936 bytes, checksum: 1f6ae24fce68b96ed6d2512dbf6c5f70 (MD5) Previous issue date: 1993 / Mestrado / Genetica / Mestre em Ciências Biológicas