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Caractérisation du rôle de l'Antigène 43 dans le processus de colonisation d'Escherichia coli O157∶H7 / Characterisation of the role of the Antigen 43 in the colonisation process of Escherichia coli O157∶H7Ageorges, Valentin 26 June 2019 (has links)
Les Escherichia coli entérohémorragiques (EHEC) O157:H7 sont des agents pathogènes alimentaires entrainant des colites hémorragiques et des syndromes hémolytiques et urémiques (SHU). Depuis le ruminant, le réservoir naturel, les EHEC peuvent contaminer certaines denrées alimentaires et in fine infecter l’Homme. La présence de composants de la matrice extracellulaire (ECM) le long de la chaine alimentaire pourrait participer à leur capacité de colonisation grâce à des protéines de surface bactérienne. Parmi ces protéines, l’antigène 43 (Ag43) est sécrété par le système de sécrétion de Type V, sous-type a (T5aSS) et appartient à la famille des SAAT (self-associating autotransporters). Ces protéines modulaires, composées d’un peptide signal N-terminal clivable, d’un domaine passager central exposé à la surface et d’un translocateur C-terminal membranaire, peuvent s’auto-associer selon un mécanisme de Velcro moléculaire. A l’origine, l’Ag43 était distribué en deux sous-familles SF-I et SF-II mais des analyses phylogénétiques ont révélé pour la première fois qu’il est en réalité distribué en 6 classes différentes nommées C1 à C6, basées sur le réarrangement de différents sous-domaines à l’intérieur du domaine passager de la protéine. Quant à la prévalence et la distribution chez les bactéries, l’agn43 s’est avéré être présent essentiellement chez E. coli avec jusqu’à 5 copies du gène par génome, en différentes combinaisons de classes d’Ag43. Des analyses fonctionnelles des Ag43 C1 à Ag43 C4 ont démontré que des interactions homotypiques survenaient pour toutes les classes mais l’Ag43 C3 présentait des différences significatives de cinétique de sédimentation et d’autoagrégation. L’étude des interactions hétérotypiques entre Ag43 de différentes classes a démontré qu’elles ne se produisaient que dans de rares cas. Chez E. coli O157:H7, l’Ag43 C2 a été démontré comme contribuant à l’adhésion des bactéries aux collagènes I et III et à l’autoagrégation. De plus dans cette souche, ce phénotype s’est avéré être régulé par la méthylase Dam et le régulateur de transcription OxyR. Globalement, ces travaux apportent de nouvelles connaissances concernant la diversité de l’Ag43 et son rôle et sa régulation chez E. coli O157:H7. Ainsi, l’Ag43 pourrait être un important facteur de colonisation de la chaine alimentaire pour les EHEC et les autres E. coli diarrhéiques. / Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O157:H7 are anthropozoonotic agents leading to haemorrhagic colitis and haemolytic-uremic syndrome (HUS). From the ruminants, their natural reservoir, EHEC can contaminate some foodstuffs and consequently infect humans. The presence of extracellular matrix (ECM) components along the food chain could contribute to the colonisation process. Numerous proteins can be present at the bacterial cell surface in EHEC, among them, antigen 43 (Ag43) is secreted by the Type V, subtype a, secretion system (T5aSS) and belongs to the family of self-associating autotransporters (SAATs). These modular proteins, comprising a cleavable N-terminal signal peptide, a surface-exposed central passenger and an outer membrane C-terminal translocator, self-recognise in a Velcro-like handshake mechanism. Ag43 was originally considered as distributed into two subfamilies, namely SF-I and SF-II but phylogenetic network analyses revealed for the first time that it actually distribute into six distinct classes, namely C1 to C6 based on the shuffling of different subdomains within the Ag43 passengers. Regarding prevalence and distribution in Bacteria, agn43 appeared to be essentially present in E. coli with up to 5 copies of the gene present in a single genome and in different combinations of Ag43 classes. Functional analyses of Ag43 C1 to Ag43 C4 revealed that homotypic interactions occurred for all Ag43 classes but Ag43 C3 induced significant differences in the sedimentation kinetics and autoaggregation state. In contrast, heterotypic interactions occurred in a very limited number of cases. In E. coli O157:H7, Ag43 C2 was shown to contribute to bacterial adhesion to collagens I and III and to the autoaggregation. Furthermore in this strain, the latter phenotype appeared to be regulated by the Dam methylase and the OxyR transcriptional regulator. Taken together, these results provide new insights of the diversity of Ag43 as well as its role and regulation in E. coli O157:H7. Thus, Ag43 may represent an important colonisation factor of the food chain by EHEC and other diarrheagenic E. coli.
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Pathogénicité des Escherichia coli entérohémorragiques : identification de voies de régulation contrôlant la mobilité, la formation de biofilm et le locus d'effacement des entérocytesBranchu, Priscilla 10 December 2012 (has links) (PDF)
Les Escherichia coli entérohémorragiques (EHEC) sont responsables de toxi-infections alimentaires conduisant à des colites hémorragiques pouvant se compliquer d'un syndrome hémolytique et urémique. Une fois arrivés dans l'intestin, les EHEC adhèrent aux cellules épithéliales en causant des lésions d'attachement-effacement. Le système de sécrétion de type III et les protéines effectrices requis pour ce phénotype sont codés majoritairement par le locus d'effacement des entérocytes (LEE), constitué de plusieurs opérons (LEE1-5). Notre étude a permis de clarifier une des cascades de régulation contrôlant l'expression du LEE. Par des analyses en qRT-PCR et des immuno précipitations de la chromatine, nous avons déterminé que les régulateurs GadE et GadX sont des répresseurs indirects de l'expression du LEE. GadE active l'expression de gadX, et GadX réprime l'expression de ler, codant pour le principal activateur des opérons LEE2-5. De plus, GadE réprime aussi l'expression des opérons LEE4 et LEE5 indépendamment de Ler. En retour, Ler réprime l'expression de gadE et de gadX. Le monoxyde d'azote (NO) est un effecteur majeur de la réponse immune innée, produit en particulier par les cellules épithéliales intestinales. Il avait été montré que le NO réprime l'expression du LEE et active celle de gadE et de gadX. Notre étude a permis d'identifier le régulateur clé responsable de ces régulations, NsrR. NsrR réprime indirectement l'expression de gadE et gadX et active l'expression des opérons LEE1, LEE4 et LEE5 en se fixant sur leurs promoteurs respectifs. En présence de NO, NsrR devient inactif. Ainsi, le NO réprime directement l'expression du LEE en supprimant la fixation de NsrR aux promoteurs du LEE1, LEE4 et LEE5, et indirectement en activant l'expression de gadE et donc de gadX. Un modèle de régulation intégrant l'ensemble de ces résultats est proposé. D'autre part, nous avons identifié et caractérisé une nouvelle phosphodiestérase spécifique des EHEC les plus pathogènes, VmpA. Par son activité d'hydrolyse du di-GMPc, VmpA contrôle la mobilité bactérienne, la formation de biofilm, et probablement l'expression du LEE, mais aurait aussi un rôle plus général dans la physiologie des EHEC.
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Interaction d'Escherichia coli entérohémorragique (EHEC) avec Acanthamoeba castellanii et rôle du régulon Pho chez les EHECChekabab, Samuel Mohammed 03 1900 (has links)
Les EHEC de sérotype O157:H7 sont des agents zoonotiques d’origine alimentaire ou hydrique. Ce sont des pathogènes émergeants qui causent chez l’humain des épidémies de gastro-entérite aiguë et parfois un syndrome hémolytique-urémique. Les EHEC réussissent leur transmission à l’humain à partir de leur portage commensal chez l’animal en passant par l’étape de survie dans l’environnement. L’endosymbiose microbienne est une des stratégies utilisées par les bactéries pathogènes pour survivre dans les environnements aquatiques. Les amibes sont des protozoaires vivants dans divers écosystèmes et connus pour abriter plusieurs agents pathogènes. Ainsi, les amibes contribueraient à transmettre les EHEC à l'humain. La première partie de mon projet de thèse est centrée sur l'interaction de l’amibe Acanthamoeba castellanii avec les EHEC. Les résultats montrent que la présence de cette amibe prolonge la persistance des EHEC, et ces dernières survivent à leur phagocytose par les amibes. Ces résultats démontrent le potentiel réel des amibes à héberger les EHEC et à contribuer à leur transmission. Cependant, l’absence de Shiga toxines améliore leur taux de survie intra-amibe. Par ailleurs, les Shiga toxines sont partiellement responsables de l’intoxication des amibes par les EHEC. Cette implication des Shiga toxines dans le taux de survie intracellulaire et dans la mortalité des amibes démontre l’intérêt d’utiliser les amibes comme modèle d'interaction hôte/pathogène pour étudier la pathogénicité des EHEC.
Durant leur cycle de transmission, les EHEC rencontrent des carences en phosphate inorganique (Pi) dans l’environnement. En utilisant conjointement le système à deux composantes (TCS) PhoB-R et le système Pst (transport spécifique de Pi), les EHEC détectent et répondent à cette variation en Pi en activant le régulon Pho. La relation entre la virulence des EHEC, le PhoB-R-Pst et/ou le Pi environnemental demeure inconnue. La seconde partie de mon projet explore le rôle du régulon Pho (répondant à un stress nutritif de limitation en Pi) dans la virulence des EHEC. L’analyse transcriptomique montre que les EHEC répondent à la carence de Pi par une réaction complexe impliquant non seulement un remodelage du métabolisme général, qui est critique pour sa survie, mais aussi en coordonnant sa réponse de virulence. Dans ces conditions le régulateur PhoB contrôle directement l’expression des gènes du LEE et de l’opéron stx2AB. Ceci est confirmé par l’augmentation de la sécrétion de l’effecteur EspB et de la production et sécrétion de Stx2 en carence en Pi. Par ailleurs, l’activation du régulon Pho augmente la formation de biofilm et réduit la motilité chez les EHEC. Ceci corrèle avec l’induction des gènes régulant la production de curli et la répression de la voie de production d’indole et de biosynthèse du flagelle et du PGA (Polymère β-1,6-N-acétyle-D-glucosamine). / EHEC O157:H7 are an emerging zoonotic food- and water-borne hazard highly pathogenic to humans and associated with diseases ranging from acute gastroenteritis to hemolytic uremic syndrome. From their commensal carriage by farm animals to human targets, EHEC pass through a crucial step of persistence in the open environment. Microbial endosymbiosis is one strategy used by pathogenic bacteria to survive in aquatic environments. Amoebae species are free-living protozoa found in diverse environmental habitats and known to host several water-borne pathogens. Thus amoebae could contribute to transmission of EHEC to humans. The first part of my PhD project was focused on interaction of the free-living amoebae Acanthamoeba castellanii with EHEC. The results showed that the presence of amoeba extends the persistence of EHEC that survived phagocytosis by amoebae. This demonstrates the real potential of amoebae to harbourd EHEC that may contribute to their transmission. However, absence of shiga toxins enhanced the intra-amoeba survival. Moreover, EHEC had a toxic and lethal effect on amoebae partially due to shiga toxins. The involvement of shiga toxins in the intracellular survival and mortality of amoebae suggests the value of using amoebae as a model of host/pathogen interactions to study the pathogenicity of EHEC.
During their transmission cycle, EHEC encounter limitation inorganic phosphate (Pi) in the environment. Using jointly the PhoB-R two-component system (TCS) and the Pst (Pi specific transport) system, EHEC detect and respond to this Pi limitation by activating the Pho regulon. The interplay between the EHEC virulence, the Pho-Pst and/or the environmental Pi remains unknown. The second part of my project explored the role of Pho regulon (responding to Pi-limitation stress) in the virulence of EHEC. Transcriptomic analysis showed that EHEC has evolved a sophisticated response to Pi deficiency involving not only biochemical strategies that are likely critical to its survival, but also coordinating its virulence response. In these conditions, the regulator PhoB regulates directly the expression of LEE and Stx2 genes. This is confirmed by an increase in EspB secretion and Stx2 production and secretion in low Pi conditions. Moreover, the activation of Pho regulon increases biofilm formation and reduces motility in EHEC. This correlated with the induction of genes regulating curli production and repression of indole production pathway and the flagellum and PGA biosynthesis.
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Pathogénicité des Escherichia coli entérohémorragiques : identification de voies de régulation contrôlant la mobilité, la formation de biofilm et le locus d'effacement des entérocytes / Pathogenicity of enterohemorrhagic E. coli : identification of regulatory pathways controlling motility, biofilm formation and the locus of enterocyte effacementBranchu, Priscilla 10 December 2012 (has links)
Les Escherichia coli entérohémorragiques (EHEC) sont responsables de toxi-infections alimentaires conduisant à des colites hémorragiques pouvant se compliquer d’un syndrome hémolytique et urémique. Une fois arrivés dans l’intestin, les EHEC adhèrent aux cellules épithéliales en causant des lésions d’attachement-effacement. Le système de sécrétion de type III et les protéines effectrices requis pour ce phénotype sont codés majoritairement par le locus d’effacement des entérocytes (LEE), constitué de plusieurs opérons (LEE1-5). Notre étude a permis de clarifier une des cascades de régulation contrôlant l’expression du LEE. Par des analyses en qRT-PCR et des immuno précipitations de la chromatine, nous avons déterminé que les régulateurs GadE et GadX sont des répresseurs indirects de l’expression du LEE. GadE active l’expression de gadX, et GadX réprime l’expression de ler, codant pour le principal activateur des opérons LEE2-5. De plus, GadE réprime aussi l’expression des opérons LEE4 et LEE5 indépendamment de Ler. En retour, Ler réprime l’expression de gadE et de gadX. Le monoxyde d’azote (NO) est un effecteur majeur de la réponse immune innée, produit en particulier par les cellules épithéliales intestinales. Il avait été montré que le NO réprime l’expression du LEE et active celle de gadE et de gadX. Notre étude a permis d’identifier le régulateur clé responsable de ces régulations, NsrR. NsrR réprime indirectement l’expression de gadE et gadX et active l’expression des opérons LEE1, LEE4 et LEE5 en se fixant sur leurs promoteurs respectifs. En présence de NO, NsrR devient inactif. Ainsi, le NO réprime directement l’expression du LEE en supprimant la fixation de NsrR aux promoteurs du LEE1, LEE4 et LEE5, et indirectement en activant l’expression de gadE et donc de gadX. Un modèle de régulation intégrant l’ensemble de ces résultats est proposé. D’autre part, nous avons identifié et caractérisé une nouvelle phosphodiestérase spécifique des EHEC les plus pathogènes, VmpA. Par son activité d’hydrolyse du di-GMPc, VmpA contrôle la mobilité bactérienne, la formation de biofilm, et probablement l’expression du LEE, mais aurait aussi un rôle plus général dans la physiologie des EHEC. / Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) is a foodborne pathogen causing hemorrhagic colitis and Hemolytic and Uremic Syndrome (HUS). After reaching the gut, EHEC adhere to the epithelial intestinal cells causing attachment/effacement lesions (A/E lesions). The locus of enterocyte effacement (LEE) encodes for a type three secretion system and several effector proteins required for A/E lesions. The LEE is composed of five main operons (LEE1-5). In this work we identified the molecular mechanisms of one of the regulatory cascades controlling LEE expression. Using qRT-PCR and chromatin immunoprécipitation we determined that GadE and GadX are two indirect repressors of LEE expression. GadE activates gadX expression, and GadX represses ler expression, the latter encoding the main activator of LEE2-5 operons. Moreover, GadE also represses LEE4 and LEE5 expression independently of Ler. In turn, Ler represses gadE and gadX expression. Nitric oxide (NO) is a crucial effector of the innate immune response, in part produced by intestinal epithelial cells. It has been shown previously that NO represses LEE and activates gadE and gadX expression. In this study we identified the key regulator responsible for these regulations: NsrR. NsrR represses indirectly gadE and gadX expression and activates LEE1, LEE4 and LEE5 expression by binding to their respective promoter. In the presence of NO, NsrR is inactivated. Thus, NO directly represses LEE expression by relieving NsrR binding to the LEE1, LEE4 and LEE5 promoters, and indirectly by activating gadE and gadX expression. A regulatory model is proposed based on these results.In addition, we identified and characterized a new phosphodiesterase which is specific for the most virulent EHEC strains: VmpA. By degrading c-di-GMPc, VmpA controls motility, biofilms formation, and probably LEE expression. It would also have a global effect on EHEC physiology.
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Colonisation de la viande par Escherichia coli O157∶H7 : caractérisation moléculaire, cellulaire et tissulaire des interactions / Meat colonisation by Escherichia coli O157∶H7 : molecular, cellular and tissue characterisation of the interactionsChagnot, Caroline 02 April 2014 (has links)
Escherichia coli O157:H7 est le sérotype le plus souvent incriminé lors de toxi-infection alimentaire par les E. coli entérohémorragiques (EHEC). Il peut être associé, dans les cas les plus graves, à des colites hémorragiques mortelles et au syndrome hémolytique et urémique (SHU), touchant essentiellement les jeunes enfants. Le vecteur alimentaire le plus courant lors de ces contaminations est le boeuf haché. L’étape primaire de la contamination bactérienne se situe lors de l'abattage où les bactéries peuvent être transférées de la peau à la carcasse. Une gaine conjonctive entoure les muscles, sa composition protéique, similaire à la matrice extracellulaire (ECM), pourrait jouer un rôle dans l'adhésion bactérienne. Dans un premier temps, l’étude de l'adhésion et de la colonisation des bactéries aux protéines majeures de l’ECM musculaire, a révélé une forte influence des conditions de croissances sur l’adhésion, l'adhésion étant maximale à 25°C et pH7, en particulier aux collagènes I et III. Chez les EHEC, diverses protéines de surfaces peuvent être potentiellement impliquées dans l’adhésion à l’ECM. Le rôle d'un autotransporteur, l'antigène 43 (Ag43), dans l'autoagrégation, l'adhésion et la formation de biofilm, a été établit chez E. coli O157:H7 EDL933. Par la suite, les interactions entre E. coli O157:H7 et la viande ont été étudiées sur deux muscles modèles de types métabolique et contractile opposés (Soleus oxidatif lent et EDL, glycolytique rapide), caractérisés par microspectroscopie de fluorescence UV couplée au rayonnement synchrotron. Les différents types de fibres musculaires ainsi que l’effet d’une anoxie prolongée simulant la maturation des viandes ont été discriminés par leurs réponses spectrales après une excitation à 275 nm. Un tropisme bactérien plus élevé pour le muscle soleus que pour le muscle EDL a été clairement observé. Bien qu'E. coli O157:H7 adhère de manière similaire aux différents types de fibres musculaires, l'adhésion des bactéries se fait essentiellement au niveau de l'ECM, mettant en évidence le rôle clé de l'ECM et du tissu conjonctif musculaire dans l’adhésion des E. coli O157:H7 à la viande. Ces travaux de recherche sur l’adhésion bactérienne aux muscles squelettiques aux niveaux moléculaires, cellulaires et tissulaires fournissent les premières connaissances sur la physiologie des EHEC lors de la contamination de la viande et constituent un pré-requis indispensable au développement de pratiques et de stratégies innovantes afin de réduire le risque de contamination des viandes. / Escherichia coli O157:H7 is the most prevalent serotype involved in foodborne infection by enterohemorrhagic E. coli (EHEC). It is associated with life-threatening hemorrhagic colitis and the hemolyticuremic syndrome (HUS), which essentially affect young children. The major food vector of EHEC contamination is ground beef. The primary bacterial contamination occurs during the slaughter, essentially at dehiding stage where bacteria can be transferred from hides to carcasses. The connective tissue surrounding the muscle, highly similar to extracellular matrix (ECM) could potentially be a support for bacterial adhesion. When investigating the adhesion and colonization to the main muscle fibrous ECM proteins, the great influence of growth conditions on subsequent bacterial attachment was shown. Maximal adhesion to ECM proteins occurred at 25°C and pH 7, especially to collagens I and III. In EHEC, various surface-exposed protein determinants can be expressed and potentially involved in ECM adhesion. Investigating the autoaggregation, bacterial adhesion and biofilm formation, the involvement of Antigen 43 (Ag43), an autotransporter protein, was demonstrated in E. coli O157:H7 EDL933. Then, the attachment of E. coli O157:H7 to the meat was determined on two different model muscles, with different contractile and metabolic characteristic (Soleus oxidative, slow and EDL glycolytic, fast), previously characterized by UV microspectroscopy coupled to synchrotron radiation fluorescence. The different of muscle fiber types and the effect of a prolonged anoxia simulating maturing meat were discriminated by their spectral responses after excitation at 275 nm. It clearly appeared that bacteria displayed differential tropism as function of the muscle types, higher for the Soleus than the EDL muscles. While E. coli O157:H7 adhered similarly to the different types of muscle fibers, bacterial adherence essentially occurred at the ECM, pinpointing the key role of connective tissue for E. coli O157:H7 adhesion to meat. This first comprehensive investigation of bacterial adhesion to skeletal muscles at molecular, cellular and tissue levels provides new insight in the physiology of the colonization of meat by EHEC and constitutes a prerequisite for the development of innovative practices and strategies to minimize the risk of meat contamination.
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