L'efficacité des matériaux utilisés pour favoriser la régénération osseuse dépend entre autres de leur capacité d'interaction avec le tissu environnant. Ainsi, des peptides d'adhésion contenant la séquence Arginine-Glycine-Acide aspartique (RGD) sont parmi les plus utilisés pour favoriser 1'attachement des cellules osseuses au matériau. Les facteurs de croissance, dont les protéines morphogénétiques osseuses (BMPs), jouent également un rôle clé dans le processus de différenciation et de fonctionnement des cellules osseuses. La BMP-2 approuvée par la Food and Drug Administration aux États-Unis dans le cadre d'un système de libération est déjà actuellement utilisée cliniquement pour accroître la régénération osseuse. De plus, la BMP-9 a récemment suscité un grand intérêt en raison de son potentiel ostéogénique supérieur à celui de la BMP-2. Néanmoins, peu d'études se sont intéressées à l'influence des peptides d'adhésion sur la réponse cellulaire aux BMPs. Le principal objectif de ce travail de doctorat a donc été de fonctionnaliser un polymère par des peptides d'adhésion et de déterminer son impact sur la capacité de préostéoblastes de souris MC3T3-E1 à répondre à la BMP-2 et à la BMP-9. Cette étude s'est tout d'abord intéressée à la synthèse et à la caractérisàtion d'un film de polycaprolactone (PCL) fonctionnalisé par un peptide dérivé de la sialoprotéine osseuse qui contient 15 acides aminés dont la séquence RGD (pRGD). La fonctionnalisation a consisté en une hydrolyse alcaline du film PCL suivie d'un greffage covalent du pRGD. Les films PCL hydrolysés ont adsorbé des protéines sériques adhésives fibronectine et vitronectine mais sans favoriser l'étalement des préostéoblastes MC3T3-E1. En absence de sérum, les films PCL-pRGD ont permis un étalement plus important des préostéoblastes MC3T3-E1 par rapport au PCL fonctionnalisé par le pRGE (peptide négatif) ou au PCL hydrolysé. Le PCL-pRGD a augmenté le niveau de phosphorylation de la FAK (Tyr 397 ), évènement nécessaire chez les préostéoblastes murins pour permettre leur différenciation en ostéoblastes matures. Ainsi, seules les cellules adhérant au PCL-pRGD ont répondu à la BMP-2 via une activation de la voie canonique des Smads. Dans un deuxième temps, la stimulation des préostéoblastes par la BMP-2 et/ou BMP-9 a été déterminée sur PCL-pRGD. L'EC50 pour chacune des BMPs a tout d'abord été évaluée afin de choisir la concentration optimale à utiliser lors de la combinaison des BMP-2/BMP-9. Tandis que la BMP-2 a induit une phosphorylation des Smad1/5/8 dès 30 min, la BMP-9 a engendré un retard d'activation à 4 h. Cette observation était concomitante avec une diminution de la ?-caténine. Par contre, aucune différence n'a été observée avec la BMP-2 et la BMP-9 en termes d'activation des MAPKinases. Néanmoins, tant la BMP-2 que la BMP-9 ont été capables d'induire la différenciation des préostéoblastes MC3T3-E1 sur PCL-pRGD telle que mis en évidence par la synthèse d' ARNm codant pour Dlx5, Ostérix ou l'ostéocalcine et l'augmentation de l'activité de l'alcaline phosphatase à 72h. Mais l'utilisation d'une combinaison de la BMP-2 avec la BMP-9 stabilisant la ?-caténine n'a pas permis d'obtenir un effet additif sur la différenciation, des activations semblables à celles de la BMP-2 utilisée seule ayant été alors observées. En résumé, l'utilisation de BMP-2 ou de BMP-9 en combinaison avec une surface fonctionnalisée par des peptides d'adhésion semble être une voie prometteuse pour favoriser la différenciation cellulaire. Cependant, cette étude montre également que la BMP-2 et la BMP-9 induisent des voies d'activation antagonistes au contact du PCL-pRGD. Elle met donc l'emphase sur la nécessité de mieux comprendre l'influence de la fonctionnalisation de matériaux par des peptides d'adhésion sur la réponse aux facteurs de croissance.

Transforming growth factor-β1 (TGF-β1), an abundant growth factor in bone matrix, has been shown to be involved in bone formation and fracture healing. The mechanism of action of the osteogenic effect of TGF-β1 is not clearly understood. In this study, we found that the addition of TGF-β1 to murine osteoblastic MC3T3-E1 cells induced vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA production. VEGF mRNA levels reached a plateau within 2 h after the addition of TGF-β1. The induction was superinduced by cycloheximide and blocked by actinomycin D. Ro 31-8220, a protein kinase C inhibitor, abrogated the induction. In addition, curcumin, an inhibitor for transcription factor AP-1, also blocked the induction. Electrophoretic mobility shift assay revealed an enhanced binding of transcription factors AP-1 and NF-κB. Transient transfection experiment showed that VEGF promoter activity increased 3.6-fold upon TGF-β1 stimulation. Immunoblot analysis showed that the amount of secreted VEGF was elevated in the medium 4 h after TGF-β1 stimulation. Our results therefore suggest that at least part of the osteogenic activity of TGF-β1 may be attributed to the production of VEGF.

Tumor necrosis factor α (TNF-α) is a proinflammatory cytokine that induces apoptosis in a number of cell systems, including osteoblasts. Transforming growth factor β1 (TGF-β1) is an abundant growth factor that is known to stimulate bone formation. This study was designed to examine the role of TGF-β1 on TNF-α-induced apoptosis in murine osteoblastic MC3T3-E1 cells. Total RNA was extracted from MC3T3-E1 cells treated with 20 ng/ml of TNF-α, 10 ng/ml of TGF-β1, or combination, for 6 h. TNF-α exerted a variety of effects on the apoptotic gene expression in osteoblasts. Ribonuclease protection assays (RPA) revealed that TNF-α upregulated the mRNA levels of caspase-1, -7, -11, -12, and FAS. Western blot analysis showed enhanced processing of caspase-1, -7, -11, and -12, with the appearance of their activated enzymes 24 h after TNF-α treatment. In addition, caspase-3-like activity was significantly activated following TNF-α treatment. Levels of cleaved poly(ADP-ribose) polymerase and FAS protein were also elevated by TNF-α. Finally, Hoechst staining, terminal deoxynucleotidyl-transferase nick-end labeling (TUNEL) assay, and oligonucleosome ELISA all indicated that TNF-α induced apoptosis. In contrast, the addition of TGF-β1 attenuated all of the aforementioned effects of TNF-α. Our results demonstrate that TGF-β1 can decrease TNF-α-induced apoptosis in murine osteoblasts at least in part by attenuating TNF-α-induced caspase gene expression.

In this thesis, we used Effective Field Theory (EFT) to calculate the radiative �� capture on 12C . This reaction is considered the “holy grail” in nuclear astrophysics because it determines the relevant abundance of 16O and 12C . We considered the E1 transition from initial �� wave at energy around the Gamow energy ���� =0.3MeV.The theoretical formula for the cross section is obtained by fitting the EFT parameters to the phase shift and S-factor data. We find the Effective Range Expansion (ERE) parameters describing the ��-wave phase shift are fine tuned. The shallow bound state and the resonance ��-wave states are also described.

No description available.

Les virus du papillome humain (VPH) sont de petits virus à ADN double brin infectant les épithéliums de la peau et des muqueuses. La réplication nécessaire au maintien de leur génome dans les cellules infectées dépend des protéines virales E1 et E2. Au cours de la réplication, E1 est recrutée à l’origine de réplication par E2 afin d’être assemblée en doubles hexamères capables de dérouler l’ADN. E1 contient un domaine C-terminal responsable de l’activité ATPase/hélicase, un domaine central de liaison à l’origine et une région N-terminale régulant la réplication in vivo. Cette région contient des signaux de localisation et d’export nucléaire qui modulent le transport intracellulaire de E1. Chez le virus du papillome bovin (VPB), il a été proposé que ce transport est régulé par la sumoylation de E1. Finalement, la région N-terminale de E1 contient un motif de liaison aux cyclines permettant son interaction avec la cycline E/A-Cdk2. La phosphorylation de E1 par cette dernière régule différemment l’export nucléaire des protéines E1 du VPB et du VPH. Dans la première partie de cette étude, nous avons démontré que bien que la protéine E1 des VPH interagit avec Ubc9, l’enzyme de conjugaison de la voie de sumoylation, cette voie n’est pas requise pour son accumulation au noyau. Dans la seconde partie, nous avons déterminé que l’accumulation nucléaire de E1 est plutôt régulée pas sa phosphorylation. En fait, nous avons démontré que l’export nucléaire de E1 est inhibé par la phosphorylation de sérines conservées de la région N-terminale de E1 par Cdk2. Puis, nous avons établi que l’export nucléaire de E1 n’est pas nécessaire à l’amplification du génome dans les kératinocytes différenciés mais qu’il est requis pour le maintien du génome dans les kératinocytes non différenciés. En particulier, nous avons découvert que l’accumulation nucléaire de E1 inhibe la prolifération cellulaire en induisant un arrêt du cycle cellulaire en phase S et que cet effet anti-prolifératif est contrecarrée par l’export de E1 au cytoplasme. Dans la troisième partie de cette étude, nous avons démontré que l’arrêt cellulaire induit par E1 dépend de sa liaison à l’ADN et à l’ATP, et qu’il est accompagné par l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN dépendante de ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated). Ces deux événements semblent toutefois distincts puisque la formation d’un complexe E1-E2 réduit l’activation de la voie de réponse aux dommages par E1 sans toutefois prévenir l’arrêt de cycle cellulaire. Finalement, nous avons démontré que la réplication transitoire de l’ADN viral peut avoir lieu dans des cellules arrêtées en phase S, indépendamment de l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN et de la kinase ATM. Globalement, nos résultats démontrent que l’export nucléaire de E1 est régulé par sa phosphorylation et non par sa sumoylation. Ils démontrent également que l’export nucléaire de E1 est essentiel au maintien du génome dans les kératinocytes, possiblement parce qu’il prévient l’inhibition de la prolifération cellulaire et l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN en limitant l’accumulation de E1 au noyau. / Human papillomaviruses (HPV) are small double-stranded DNA viruses that infect the differentiating epithelium of the skin and the mucosa. HPV rely on two viral proteins, E1 and E2, to replicate and maintain their genome in the nucleus of infected cells. During replication, the E1 helicase is recruited to the origin of replication by E2 and is assembled into a double-hexamer that unwinds DNA ahead of the replication fork. E1 is comprised of a C-terminal enzymatic domain with ATPase/helicase activity, a central origin-binding domain and a N-terminal regulatory region that is required for viral DNA replication in vivo. The latter region of E1 contains a nuclear localization signal and a nuclear export signal that regulate its shuttling between the nucleus and cytoplasm. For bovine papillomavirus (BPV) E1, this shuttling was suggested to be controlled by the sumoylation of E1. In addition to the NES and NLS, the N-terminal region of E1 contains a conserved cyclin-binding motif that is required for the interaction of E1 with cyclin E/A-Cdk2. Cdk2 phosphorylation of E1 has been reported to control the nuclear export of E1 from BPV and HPV, albeit differently. In the first part of this study, we showed that although HPV E1 interacts with Ubc9, the conjugating enzyme of the sumoylation pathway, this pathway is not required for its accumulation in the nucleus. In the second part, we found that the nuclear accumulation of E1 is, instead, regulated by phosphorylation. Specifically, we found that Cdk2-dependent phosphorylation of conserved serines in the E1 N-terminal region inhibits the nuclear export of HPV E1. Furthermore, we reported that nuclear export is not essential to amplify the viral genome in differentiating keratinocytes but that it is required for its long-term maintenance in undifferentiated keratinocytes. Importantly, we found that the nuclear accumulation of E1 induces a S-phase arrest that is detrimental to cellular proliferation and that this anti-proliferative effect can be counteracted by the export of E1 from the nucleus to the cytoplasm. In the last part of this study, we showed that this arrest is dependent on the DNA- and ATP-binding activities of E1. Furthermore, we found that the cell cycle arrest induced by E1 is accompanied by the activation of a DNA damage response (DDR) dependent on the ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) pathway. However, these two events seem to be distinct since complex formation with E2 reduces the ability of E1 to induce a DDR but does not prevent cell cycle arrest. Importantly, we demonstrated that transient viral DNA replication still occurs in S-phase arrested cells, independently of the induction of a DDR and of the ATM kinase. Collectively, these data indicate that nuclear export of E1 is regulated by phosphorylation and not by sumoylation. They also revealed that nuclear export of E1 is essential for maintenance of the viral episome in keratinocytes, at least in part to limit its nuclear accumulation and prevent its detrimental effect on cellular proliferation and induction of a DDR.

Este estudo in vitro teve como objetivo avaliar os efeitos moleculares do TGF-β1, com diferentes períodos de suplementação, sobre a formação do fenótipo osteogênico das células MC3T3-E1, comparando-os com células tratadas com AA+β-GP suplementados com Dex e/ou TGF-β1, sem e com a neutralização dos receptores de TGF-β1. A expressão gênica do próprio TGF-β1 e Smad3 foram analisadas, bem como, a diferenciação das células osteogênicas e a biomineralização. As células tratadas com TGF-β1 sem neutralização de receptores apresentam efeito inibitório nos estágios mais avançados da diferenciação dos osteoblastos e da biomineralização in vitro, mas expressarem alguns marcadores importantes envolvidos na mineralização. Observaram-se nódulos de mineral em todos os tratamentos das células que tiveram os receptores de TGF-β1 neutralizados, mas houve uma diminuição na expressão de alguns genes. Os resultados confirmam a complexidade da via de sinalização do TGF-β1, mostrando que existem lacunas para que seja entendido o mecanismo dessa molécula na biologia osteoblástica. / This in vitro study aimed to evaluate the molecular effects of TGF-β1, with different supplementation time periods on the establishment of MC3T3-E1 cells, comparing with cells treated with AA+β-GP supplemented with Dex and/or TGF-β1, without or with neutralization of TGF-β1 receptors. The gene expression of the TGF-β1 and Smad3 were analyzed, as well as the osteoblast differentiation and biomineralization. The cells treated with TGF-β1 without neutralization of receptors have had inhibitory effect on some important stages of osteoblast differentiation and biomineralization in vitro, but expressed some important mineralization markers. Mineral nodules were observed in all treatments of cells with their TGF-β1 receptors neutralized, but there was a decrease in the expression of some important genes. The results confirm the complexity of the pathway signaling of TGF-β1, showing that there are gaps for understand the mechanisms of this molecule in the biology of osteoblasts.

No description available.

Les virus du papillome humain (VPH) sont de petits virus à ADN double brin infectant les épithéliums de la peau et des muqueuses. La réplication nécessaire au maintien de leur génome dans les cellules infectées dépend des protéines virales E1 et E2. Au cours de la réplication, E1 est recrutée à l’origine de réplication par E2 afin d’être assemblée en doubles hexamères capables de dérouler l’ADN. E1 contient un domaine C-terminal responsable de l’activité ATPase/hélicase, un domaine central de liaison à l’origine et une région N-terminale régulant la réplication in vivo. Cette région contient des signaux de localisation et d’export nucléaire qui modulent le transport intracellulaire de E1. Chez le virus du papillome bovin (VPB), il a été proposé que ce transport est régulé par la sumoylation de E1. Finalement, la région N-terminale de E1 contient un motif de liaison aux cyclines permettant son interaction avec la cycline E/A-Cdk2. La phosphorylation de E1 par cette dernière régule différemment l’export nucléaire des protéines E1 du VPB et du VPH. Dans la première partie de cette étude, nous avons démontré que bien que la protéine E1 des VPH interagit avec Ubc9, l’enzyme de conjugaison de la voie de sumoylation, cette voie n’est pas requise pour son accumulation au noyau. Dans la seconde partie, nous avons déterminé que l’accumulation nucléaire de E1 est plutôt régulée pas sa phosphorylation. En fait, nous avons démontré que l’export nucléaire de E1 est inhibé par la phosphorylation de sérines conservées de la région N-terminale de E1 par Cdk2. Puis, nous avons établi que l’export nucléaire de E1 n’est pas nécessaire à l’amplification du génome dans les kératinocytes différenciés mais qu’il est requis pour le maintien du génome dans les kératinocytes non différenciés. En particulier, nous avons découvert que l’accumulation nucléaire de E1 inhibe la prolifération cellulaire en induisant un arrêt du cycle cellulaire en phase S et que cet effet anti-prolifératif est contrecarrée par l’export de E1 au cytoplasme. Dans la troisième partie de cette étude, nous avons démontré que l’arrêt cellulaire induit par E1 dépend de sa liaison à l’ADN et à l’ATP, et qu’il est accompagné par l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN dépendante de ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated). Ces deux événements semblent toutefois distincts puisque la formation d’un complexe E1-E2 réduit l’activation de la voie de réponse aux dommages par E1 sans toutefois prévenir l’arrêt de cycle cellulaire. Finalement, nous avons démontré que la réplication transitoire de l’ADN viral peut avoir lieu dans des cellules arrêtées en phase S, indépendamment de l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN et de la kinase ATM. Globalement, nos résultats démontrent que l’export nucléaire de E1 est régulé par sa phosphorylation et non par sa sumoylation. Ils démontrent également que l’export nucléaire de E1 est essentiel au maintien du génome dans les kératinocytes, possiblement parce qu’il prévient l’inhibition de la prolifération cellulaire et l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN en limitant l’accumulation de E1 au noyau. / Human papillomaviruses (HPV) are small double-stranded DNA viruses that infect the differentiating epithelium of the skin and the mucosa. HPV rely on two viral proteins, E1 and E2, to replicate and maintain their genome in the nucleus of infected cells. During replication, the E1 helicase is recruited to the origin of replication by E2 and is assembled into a double-hexamer that unwinds DNA ahead of the replication fork. E1 is comprised of a C-terminal enzymatic domain with ATPase/helicase activity, a central origin-binding domain and a N-terminal regulatory region that is required for viral DNA replication in vivo. The latter region of E1 contains a nuclear localization signal and a nuclear export signal that regulate its shuttling between the nucleus and cytoplasm. For bovine papillomavirus (BPV) E1, this shuttling was suggested to be controlled by the sumoylation of E1. In addition to the NES and NLS, the N-terminal region of E1 contains a conserved cyclin-binding motif that is required for the interaction of E1 with cyclin E/A-Cdk2. Cdk2 phosphorylation of E1 has been reported to control the nuclear export of E1 from BPV and HPV, albeit differently. In the first part of this study, we showed that although HPV E1 interacts with Ubc9, the conjugating enzyme of the sumoylation pathway, this pathway is not required for its accumulation in the nucleus. In the second part, we found that the nuclear accumulation of E1 is, instead, regulated by phosphorylation. Specifically, we found that Cdk2-dependent phosphorylation of conserved serines in the E1 N-terminal region inhibits the nuclear export of HPV E1. Furthermore, we reported that nuclear export is not essential to amplify the viral genome in differentiating keratinocytes but that it is required for its long-term maintenance in undifferentiated keratinocytes. Importantly, we found that the nuclear accumulation of E1 induces a S-phase arrest that is detrimental to cellular proliferation and that this anti-proliferative effect can be counteracted by the export of E1 from the nucleus to the cytoplasm. In the last part of this study, we showed that this arrest is dependent on the DNA- and ATP-binding activities of E1. Furthermore, we found that the cell cycle arrest induced by E1 is accompanied by the activation of a DNA damage response (DDR) dependent on the ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) pathway. However, these two events seem to be distinct since complex formation with E2 reduces the ability of E1 to induce a DDR but does not prevent cell cycle arrest. Importantly, we demonstrated that transient viral DNA replication still occurs in S-phase arrested cells, independently of the induction of a DDR and of the ATM kinase. Collectively, these data indicate that nuclear export of E1 is regulated by phosphorylation and not by sumoylation. They also revealed that nuclear export of E1 is essential for maintenance of the viral episome in keratinocytes, at least in part to limit its nuclear accumulation and prevent its detrimental effect on cellular proliferation and induction of a DDR.

Este estudo in vitro teve como objetivo avaliar os efeitos moleculares do TGF-β1, com diferentes períodos de suplementação, sobre a formação do fenótipo osteogênico das células MC3T3-E1, comparando-os com células tratadas com AA+β-GP suplementados com Dex e/ou TGF-β1, sem e com a neutralização dos receptores de TGF-β1. A expressão gênica do próprio TGF-β1 e Smad3 foram analisadas, bem como, a diferenciação das células osteogênicas e a biomineralização. As células tratadas com TGF-β1 sem neutralização de receptores apresentam efeito inibitório nos estágios mais avançados da diferenciação dos osteoblastos e da biomineralização in vitro, mas expressarem alguns marcadores importantes envolvidos na mineralização. Observaram-se nódulos de mineral em todos os tratamentos das células que tiveram os receptores de TGF-β1 neutralizados, mas houve uma diminuição na expressão de alguns genes. Os resultados confirmam a complexidade da via de sinalização do TGF-β1, mostrando que existem lacunas para que seja entendido o mecanismo dessa molécula na biologia osteoblástica. / This in vitro study aimed to evaluate the molecular effects of TGF-β1, with different supplementation time periods on the establishment of MC3T3-E1 cells, comparing with cells treated with AA+β-GP supplemented with Dex and/or TGF-β1, without or with neutralization of TGF-β1 receptors. The gene expression of the TGF-β1 and Smad3 were analyzed, as well as the osteoblast differentiation and biomineralization. The cells treated with TGF-β1 without neutralization of receptors have had inhibitory effect on some important stages of osteoblast differentiation and biomineralization in vitro, but expressed some important mineralization markers. Mineral nodules were observed in all treatments of cells with their TGF-β1 receptors neutralized, but there was a decrease in the expression of some important genes. The results confirm the complexity of the pathway signaling of TGF-β1, showing that there are gaps for understand the mechanisms of this molecule in the biology of osteoblasts.