Over the last decade, Scotland has witnessed a rising incidence in squamous cell carcinomas of the head and neck (HNSCC), a phenomenon thought to be linked to infection with high-risk Human Papillomavirus (HPV). HPV-associated HNSCC are a distinct disease presenting unique epidemiological, biological and clinical challenges. However, establishing HPV-related disease is impaired by non-standardised testing protocols and lack of a consensus on the efficacy of existing biomarkers such as p16. This is further complicated by the absence of additional biological markers and a dearth in our understanding of the molecular mechanisms underlying HPV-driven tumourigenesis. While HPV positivity is more commonly detected in the oropharynx, its prevalence and clinical impact in other head and neck subsites remains largely unexplored. The research presented in this thesis was undertaken to determine the prevalence of high-risk HPV in a heterogeneous cohort of 293 HNSCC patients from Tayside and to evaluate the validity of EBP50, a scaffolding protein involved in cell polarity which is targeted by high-risk HPV, as a potential marker for HPV-driven HNSCC. The p16 status of the patients in the cohort was already known and tissue specimens were genotyped for HPV using PCR. HPV infection, defined as p16 positivity and a positive HPV DNA status, was identified in 14% of the cohort. The majority (83%) of the HPV-positive tumours involved the oropharynx while the oral cavity, pharynx and the nasal cavity (17%) were involved to a much smaller extent. High-risk HPV type 16 was the most prevalent HPV type. Patients with HPV-positive tumours had significantly improved overall survival (OS) (2 year OS, 77% vs 57%) and recurrence free survival rates (RFS) (2 year RFS, 92% vs 77%) compared to patients with HPV-negative tumours. A positive tumour HPV status was found to be an independent prognostic indicator (HR 0.216; 95% CI 0.06 – 0.771) and so, given the high morbidity and debilitating physical and psychological problems associated with prevailing aggressive treatment regimens, it is imperative that this knowledge is harnessed to develop and improve treatment strategies. EBP50 expression was evaluated, by immunohistochemical analysis, first in normal oral mucosa and followed up in a smaller subset of 156 HNSCC patients from the main cohort. In the normal tissue EBP50 expression was predominantly membranous. In the tumour samples four distinct EBP50 expression patterns were observed and, of these, weak/ negligible cytoplasmic EBP50 expression showed a strong correlation, only marginally lower than p16 overexpression, with HPV DNA status and was observed largely in patients with tumours of the oropharynx and no history of smoking. Absence of EBP50 expression in the plasma membranes of tumour cells was a recurring pattern in a majority of the tumour samples. The scale of this study, comprising a Tayside cohort of unprecedented size, will undoubtedly contribute to the existing knowledge of HPV incidence in head and neck cancer in Scotland. Furthermore, this study presents compelling preliminary evidence for further researching weak/negligible cytoplasmic EBP50 expression as being a potential indicator of HPV-positivity in HNSCC.

Le gliome infiltrant du tronc cérébral (en anglais “diffuse intrinsic pontine glioma”, DIPG) est une tumeur pédiatrique rare et très agressive. La durée moyenne de survie après diagnostic est inférieure à un an. Une caractéristique génétique majeure des DIPG est la mutation de l’histone H3 (H3K27M). L’évolution des connaissances en épigénétique a permis de concevoir des inhibiteurs de régulateurs épigénétiques capables de modifier, voire de contrebalancer, l’effet de cette mutation. Ainsi, le panobinostat (PS), un inhibiteur des histone-désacétylases, diminue la croissance cellulaire et conduit à la mort des cellules de DIPG in vitro et in vivo. Son efficacité est en cours d'évaluation dans des essais cliniques. Mon projet de thèse avait pour objectif de déterminer le rôle d’EBP50 et d’IRSp53, deux protéines spécifiquement dérégulées dans les lignées de DIPG après traitement des cellules par le PS. EBP50 est connue pour intervenir dans la progression tumorale mais sa dualité de fonction, à la fois oncogène et suppresseur de tumeur, nous a conduits à étudier plus précisément son rôle dans les cellules de DIPG. IRSp53 a été peu étudiée dans les cancers solides, bien qu'elle semble jouer un rôle important dans la motilité cellulaire et l’invasion. La diminution de l’expression d’IRSp53 et d’EBP50 par ARN interférence dans des lignées DIPG induit la mort des cellules par apoptose et bloque leur croissance ainsi que leur motilité cellulaire, ce qui suggérerait que ces deux protéines sont oncogéniques dans ce modèle. De plus, la localisation cytoplasmique et nucléaire d’EBP50 semble en accord avec son rôle pro-oncogénique dans les cellules de DIPG. En étudiant in vitro l’effet d’un traitement combinatoire du PS avec des inhibiteurs de l’expression d’EBP50 ou d’IRSp53, j’ai mis en évidence une augmentation de la sensibilité des cellules de DIPG au traitement par le PS. Enfin, j’ai validé le traitement ciblant EBP50 in vivo dans un modèle préclinique d’embryon de poulet. En conclusion, ces deux protéines constituent de nouvelles cibles thérapeutiques dans les DIPG et un moyen d’augmenter l’efficacité du PS. / Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG), is a rare and highly aggressive pediatric tumor. The average survival time after diagnosis is less than one year. A major genetic characteristic of this disease is the mutation of histone H3 (H3K27M). The evolution of knowledge in epigenetics has made it possible to design epigenetic regulatory inhibitors able to modify, or even offset, the effect of this mutation. For example, panobinostat (PS), a histone deacetylase inhibitor, reduces cell growth and induces DIPG cell death, both in vitro and in vivo. Its effectiveness is currently being evaluated in clinical trials. My thesis project aimed at determining the role of two proteins, EBP50 and IRSp53, deregulated in different DIPG cell lines after treatment with PS. EBP50 has already been described as involved in tumor progression but its dual function, both oncogenic and tumor suppressor, has led us to further investigate its role in the DIPG cells. IRSp53 has been poorly studied in solid cancers, though it plays an important role in cell motility and invasion. Down-regulation by RNA silencing of these two proteins in DIPG cell lines induces apoptosis, decreases cell growth and motility, leading us to the hypothesis that these two proteins are oncogenic proteins. In addition, the cytoplasmic and nuclear localization of the EBP50 protein is consistent with its oncogenic role in DIPG cells. Then, I investigated the effect of combinatorial therapy that associates PS with EBP50 or IRSp53 expression inhibitors. My results show an increase in the antitumor effect in vitro for both proteins but also in vivo for EBP50, in a preclinical model, the chicken embryo. In conclusion, these two proteins could be the targets of new treatments for DIPG tumors in combination with PS to enhance its efficacy.

ABCB4/MDR3 est le transporteur canaliculaire de la phosphatidylcholine. Il est exprimé à la membrane canaliculaire des hépatocytes et est essentiel à la sécrétion biliaire. Un défaut d’ABCB4 entraîne des pathologies hépatobiliaires, dont la PFIC3 (cholestase intrahépatique familiale progressive de type 3), caractérisée par une cholestase précoce qui progresse vers la cirrhose et l’insuffisance hépatique avant l’âge adulte. Dans la majorité des cas, la seule thérapie efficace est la transplantation hépatique. Cette thèse s’intéresse aux rôles de l’extrémité C-terminale dans la régulation de la stabilité et l’expression de ce transporteur au canalicule biliaire. Nous avons délété le motif Q-N-L de cette extrémité et montré que cette délétion affecte la stabilité d’ABCB4/MDR3 en augmentant son endocytose. Son interaction avec des protéines à domaines PDZ est alors étudiée. Nous avons montré une interaction par le motif Q-N-L avec la protéine à domaines PDZ, EBP50. Cette interaction est nécessaire pour l’expression canaliculaire et la stabilité du transporteur. / ABCB4 is a phosphatidylcholine translocator specifically expressed at the bile canalicular membrane of hepatocytes. Mutations of the ABCB4 gene cause progressive familial intrahepatic cholestasis type 3 (PFIC3), a rare genetic disease characterized by early onset of cholestasis and evolution to cirrhosis and liver failure before adulthood. Little is known regarding the molecular mechanisms which control the canalicular expression and membrane stabilization of ABCB4 in hepatocytes. The aim of this work was to study the role of the C-terminal domain of ABCB4 for its expression and stability. potential interaction with EBP50, a PDZ protein highly expressed in hepatocytes. The experimental approach consisted in the deletion of the QNL motif at the C-terminus of ABCB4. The truncation of the QNL motif leds to a reduction of ABCB4 stability by increasing its endocytosis. ABCB4 co-precipitated with EBP50, an interaction that required the QNL motif. This interaction plays a critical role in the canalicular expression and stabilization of ABCB4.

Le stress oxydatif peut conduire à la sénescence, à l'apoptose et à la mutagenèse. Les cellules cancéreuses peuvent développer un avantage prolifératif sur les cellules normales dans un environnement de stress oxydatif, qui de ce fait, participe à la progression tumorale. Nous émettons l'hypothèse que MK2, une cible directe de la p38 MAPK, pourrait conférer aux cellules de cancer du foie une résistance au stress oxydatif. Dans quatre lignées cellulaires tumorales hépatobiliaires, l'inhibition pharmacologique de MK2, MK2i, augmente la mort cellulaire induite par le stress oxydatif par une diminution de l'activité de Hsp27 et une augmentation du niveau du suppresseur de tumeur p53. MK2 favorise la survie cellulaire via l'activation de la réponse anti-oxydante Nrf2 et de la voie d'HB-EGF/EGFR. MK2 est également responsable de la production d'Il-8 induite par le stress oxydatif. Cette augmentation semble dépendre de Hsp27. De plus, nous avons identifié la protéine d'échafaudage EBP50 comme une nouvelle protéine de liaison de MK2. Dans les cellules cancéreuses hépatobiliaires, EBP50 contribue à la régulation de la voie MK2/Hsp27. La déplétion d'EBP50 provoque une diminution de la phosphorylation de Hsp27, de la survie cellulaire ainsi qu'une baisse des taux d'ARNm de HB-EGF et d'IL-8. Dans les échantillons de tissus humains, l'expression de MK2, de Hsp27 et d'EBP50 est augmentée dans le carcinome hépatocellulaire par rapport au tissu hépatique non tumoral. En résumé, ces données fournissent la preuve d'un rôle prépondérant de l'axe MK2/EBP50/Hsp27 dans la progression du cancer du foie en conférant aux cellules tumorales hépatobiliaires une résistance au stress oxydatif. / Oxidative stress leads to senescence, apoptosis and mutagenesis. Cancer cells can develop a proliferative advantage over normal cells in an environment of oxidative stress, which thereby, participates in tumor progression. We hypothesized that MK2, a direct target of p38 MAPK, could mediate the resistance of liver cancer cells to oxidative stress. In four hepatocellular and biliary cancer cell lines, pharmacological inhibition of MK2 by MK2i enhanced oxidative stress-induced cell death through a decrease in Akt and Hsp27 activity and an increase in tumor suppressor p53 level. MK2 promoted cell survival via activation of the anti-oxidant Nrf2 response and the EGFR pathway. The expression of the EGFR agonist, Hb-EGF, increased in response to oxidative stress. In turn, Hb-EGF induced Hsp27 phosphorylation that was down-regulated by MK2i in liver cancer cells, indicating that EGFR activation by Hb-EGF is a potent activator of MK2. MK2 also increased oxidative stress-induced IL-8 production that depends on Hsp27. Furthermore, we found that MK2 was a binding partner of the scaffolding protein EBP50. In liver cancer cells, EBP50 contributed to up-regulate the MK2/Akt/Hsp27 pathway. Silencing of EBP50 by siRNA in these cells caused a decrease in the phosphorylation of Akt/Hsp27 and in the mRNA levels of Hb-EGF and IL-8. In human tissue samples, MK2, Hsp27 and EBP50 expressions were found to be increased in hepatocellular carcinoma compared with the matched non-tumor liver tissue. Overall, these data provide evidence for a preponderant role of MK2/EBP50/Akt/Hsp27 axis in liver cancer progression by mediating oxidative stress resistance in liver tumor cells.