Zugl.: Giessen, Universiẗat, Diss., 2008.

Thesis (Ph.D.)--Ohio University, November, 2004. / Includes bibliographical references (p. 137-159)

Thesis (M.S.)--University of Michigan, 2005. / Includes bibliographical references.

Thesis (Ph.D.)--Ohio University, November, 2004. / Title from PDF t.p. Includes bibliographical references (p. 137-159)

Thesis (M.Sc.)--York University, 2004. Graduate Programme in Biology. / Typescript. Includes bibliographical references. Also available on the Internet. MODE OF ACCESS via web browser by entering the following URL: http://gateway.proquest.com/openurl?url%5Fver=Z39.88-2004&res%5Fdat=xri:pqdiss &rft_val_fmt=info:ofi/fmt:kev:mtx:dissertation&rft_dat=xri:pqdiss:MR11866

Thesis (M.S.)--University of Missouri-Columbia, 2006. / "December 2006" The entire dissertation/thesis text is included in the research.pdf file; the official abstract appears in the short.pdf file (which also appears in the research.pdf); a non-technical general description, or public abstract, appears in the public.pdf file. Includes bibliographical references.

Freie Universiẗat, Diss., 2005--Berlin. / Dateiformat: zip, Dateien im PDF-Format. Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2005.

Thesis (M.S. in animal science)--Washington State University, May 2007. / Includes bibliographical references.

Η χρήση ενδοφλέβιων καθετήρων είναι πλέον συνώνυμη με τις λοιμώξεις που προκαλούνται από στελέχη S. epidermidis. Η ικανότητα του συγκεκριμένου μικροοργανισμού να σχηματίζει βιομεμβράνες σχετίζεται άμεσα με την παθογένειά του. Ορισμένες ερευνητικές ομάδες έχουν περιγράψει κάποιους από τους μηχανισμούς σχηματισμού βιομεμβράνης καθώς και μόρια που συμμετέχουν σε αυτούς. Η ερευνητική μας ομάδα έχει απομονώσει ένα όξινο, θειωμένο πολυσακχαρίτη (20-kDa PS ή PS) ο οποίος φαίνεται να είναι ο κύριος αντιγονικός καθοριστής της εξωκυττάριας βλεννώδους στιβάδας του S. epidermidis. Αντισώματα έναντι αυτού του πολυσακχαρίτη έχει δειχθεί ότι προστατεύουν από σταφυλοκοκκική κερατίτιδα, από νεογνική βακτηριαιμία ενώ ταυτόχρονα διαχωρίζουν τα στελέχη S. epidermidis από τους υπόλοιπους πηκτάση-αρνητικούς σταφυλοκόκκους. Ένας από τους κύριους στόχους της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση του ρόλου του PS στην προσκόλληση του S. epidermidis σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκαν ένα πρότυπο στέλεχος S. epidermidis που παράγει τον PS (ΑΤCC35983) και ένα κλινικό στέλεχος το οποίο έχει δειχθεί ότι δεν παράγει τον συγκεκριμένο πολυσακχαρίτη. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν δείχνουν ότι ο PS διευκολύνει την προσκόλληση του S. epidermidis στα ενδοθηλιακά κύτταρα με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Παρά το γεγονός ότι ο ακριβής μηχανισμός προσκόλλησης δεν έχει βρεθεί, εντούτοις μπορεί να συσχετισθεί με το μηχανισμό πρόσδεσης των σταφυλοκόκκων μέσω των αλυσίδων γλυκοσαμινογλυκανών στα στελέχη που παράγουν τον πολυσακχαρίτη. Σε ό,τι αφορά τα στελέχη που δεν παράγουν τον PS ο προαναφερόμενος μηχανισμός συμμετέχει μερικώς στην προσκόλληση του S. epidermidis. Ο δεύτερος στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί κατά πόσο μεταβάλλεται η έκφραση ορισμένων μακρομορίων του εξωκυττάριου χώρου διότι είναι γνωστό ότι οι πρωτεογλυκάνες της κυτταρικής επιφάνειας συμμετέχουν στην προσκόλληση του S. epidermidis σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν τέσσερα στελέχη S. epidermidis που διέφεραν τόσο ως προς το φαινότυπο όσο και ως προς τον γονότυπο. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν έδειξαν ότι δεν υπάρχουν σημαντικές μεταβολές στην έκφραση των δύο κύριων πρωτεογλυκανών των ενδοθηλιακών κυττάρων, συνδεκάνης-1 και γλυπικάνης-1, σε κανένα από τα χρονικά διαστήματα που χρησιμοποιήθηκαν. Εντούτοις, τα αποτελέσματα δεν μπορούν να αποκλείσουν τη λειτουργία των πρωτεογλυκανων 202 ως γέφυρες που διευκολύνουν την πρόσδεση και τη μετέπειτα είσοδο του S. epidermidis στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Έχει δειχθεί ότι το ενδοθήλιο διαδραματίζει σημαντικό ρόλο σε περιπτώσεις λοιμώξεων καθώς πραγματοποιείται ενεργοποίηση της έκφρασης ενός ευρέως φάσματος μορίων προσκόλλησης και εξωκυττάριου χώρου. Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκαν και αξιολογήθηκαν τα ειδικά προφίλ έκφρασης τέτοιων μορίων μέσω Real-Time PCR, ELISA, ανοσοφθορισμού και ζυμογραφίας. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν δείχνουν ότι αν και η γενική απόκριση των ενδοθηλιακών κυττάρων σε περιπτώσεις λοιμώξεων με στελέχη S. epidermidis είναι να αποικοδομήσουν τον εξωκυττάριο χώρο, τα γονίδια που ενεργοποιούνται είναι διαφορετικά και έχουν σχέση με τα στελέχη που χρησιμοποιούνται. Φαίνεται ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα προσπαθούν να μειώσουν τη συνοχή του εξωκυττάριου χώρου έτσι ώστε να διευκολύνουν την μετακίνηση ουδετεροφίλων στο σημείο της λοίμωξης. Μελλοντικές μελέτες στις οποίες θα χρησιμοποιηθούν γενετικά τροποποιημένα βακτηριακά στελέχη σε συν-καλλιέργειες ενδοθηλιακών κυττάρων με μακροφάγα ή μονοκύτταρα θα διευκρινήσουν τις αλληλεπιδράσεις που πραγματοποιούνται in vivo. / The use of intravenous catheters and other medical implanted devices is synonymous to Staphylococcus epidermidis infections. The ability of the specific microorganism to cause infections is directly related to its ability to form biofilms. Some of the mechanisms and molecules participating in the formation of biofilm have been elucidated. Our research group has isolated an acidic, sulfated polysaccharide (20-kDa PS or PS) that appear to be the main antigenic component of S. epidermidis extracellular mucous layer. Antibodies against this polysaccharide protect from staphylococcal keratitis, neonate bacteremia and discriminate S. epidermidis strains from other CoNS. In the present dissertation one of the major goals was to evaluate the role of PS in S. epidermidis’ adherence to human endothelial cells. A PS reference strain (ATCC35983) and a non-PS producing clinical strain were used. Results obtained showed that PS facilitates S. epidermidis’ adherence to endothelial cells in a dose dependent manner. Although the fine mechanism for such a binding is not as yet clear, it may be correlated with the staphylococcal binding through glycasaminoglycan chains at least for the strains that produce this polysaccharide. As long as the non-PS producing strains are concerned the involvement of the above mentioned mechanism has partial contribution to S. epidermidis adherence. Considering that cell surface proteoglycans are involved in S. epidermidis adherence to endothelial cells, the second major goal of this study was to examine whether gene expression of certain matrix biomacromolecules is modified in S. epidermidis infected endothelial cells as compared to non-infected ones. Four different phenotypically and genotypically strains were used. Results show no significant difference in expression of two main cell-surface proteoglycans, syndecan-1 and glypican-1, in all time points and for all strains used. These results, however, cannot exclude that proteoglycans may be the bridge facilitating S. epidermidis adherence and subsequently invasion to endothelial cells. It has been established that endothelium plays a crucial role in inflammation. This is achieved by the consequent expression of a wide variety of adhesion and extracellular matrix molecules. In the present study, the specific expression profile of such molecules was also evaluated using Real-Time PCR, ELISA, immunofluorescence and zymography. Obtained results indicate that, even though the general reaction of endothelial cells is to disintegrate the structure of the extracellular matrix, the genes activated are different with respect to the 204 strains that were used. It seems that the endothelial cells’ effort to decrease the extracellular matrix cohesion is a way to facilitate migration of macrophages at the site of infection. Future studies using genetically modified bacterial strains in cocultures of endothelial cells with macrophages or monocytes will elucidate the interactions that actually happen in vivo.

Fetal growth in utero depends on nutrient and oxygen reaching the fetus through the uterine and placental microcirculations, both undergoing massive expansion during pregnancy. Aberrations of the placental vasculature are associated with Intrauterine Growth Restriction (IUGR), a common pathological outcome of pregnancy; however, the cellular components responsible for vessel formation in the placenta and the uterus remain unknown. Endothelial Progenitor Cells (EPC) are a group of morphologically and functionally varied bone marrow derived vasculogenic cell types, divided into two major subsets: (i) Circulating Angiogenic Cells (CACs), which promote vessel formation by interfering with the extracellular matrix and (ii) Endothelial Colony Forming Cells (ECFCs), which provide the source for new endothelium. This role has been demonstrated in pathophysiological studies, but not in normal physiological events in vivo. Fetal ECFCs are more proficient than their adult counterparts, but it is unclear in what specific fetal or maternal physiological situations fetal ECFCs are involved. Based upon these considerations, it was hypothesised that: (i) fetal-derived ECFCs play a role in placental vasculogenesis, (ii) these cells transmigrate the placenta and home to loci of vessel formation in the pregnant uterus, and that (iii) intrinsic alterations in their capabilities are associated with fetal growth restriction during intrauterine life. To support these hypotheses the following experiments were performed;(i) EPCs in blood from pairs of human umbilical arteries and veins were counted by flow cytometry. Numbers of EPCs in these samples showed an arterio-venous gradient suggesting their placental sequestration. Furthermore, ECFCs were isolated from human umbilical blood using established culture techniques. Labelled human fetal ECFCs were transplanted into the circulation of murine fetuses using an ultrasound-guided intra-cardiac injection. Using a fluorescent imager and microscopy these cells were shown to home to the murine placenta and participate in vasculogenesis.(ii) Male mice ubiquitously expressing eGFP were crossbred with native females, and fetal (eGFP-positive) endothelial-like cells integrated into the uterine microvasculature. Human fetal ECFCs injected into murine fetuses were shown to migrate to the maternal uterus and became functionally involved with the microvasculature. In humans, microvessels were isolated from uterine biopsies of mothers with male offspring. Copies of the male specific SRY gene (quantified by RT-QPCR) indicated that cells of fetal origin constituted 12% of the endothelium in these vessels. In cross-sections, hybridisation of the Y-chromosome demonstrated the presence of fetal cells in the maternal endothelium of the human uterus. (iii) Using flow cytometry, fewer EPCs were defined within the peripheral circulation of growth-restricted babies. Functional assays showed that ECFCs derived from these growth-restricted cases had intrinsically impaired proliferation, migration, matrix-metalloproteinase (MMP-2) production, and generated fewer blood vessels in a murine vasculogenic bioassay. These results demonstrated the vasculogenic capacity of human fetal ECFCs in vivo and established them as key players in human placental vasculogenesis and uterine vessel expansion. Notably, these results also showed a link between impaired function of fetal ECFCs and IUGR, which is associated with increased cardiovascular risk of both the fetus as an adult, and mother in later life. From these findings it could be speculated, that intrinsic changes in ECFC-biology may be the causative link between IUGR and fetal and maternal cardiovascular susceptibility. Insight into these processes may contribute to early diagnosis, prevention and treatment of IUGR and associated conditions.