La sobre expressió de les hidrofilines STF2 i SIP18 en soques de laboratori, tenen un efecte positiu en la tolerància a la deshidratació i rehidratació. A més, la sobre expressió de SIP18 en quatre soques comercials de llevat industrial mostra el mateix fenotip que les soques de laboratori sense alterar els paràmetres de la fermentació. Aquests resultats ens permeten proposar la sobre expressió de SIP18 com una possible forma de millorar la viabilitat en el llevat sec actiu (LSA) i obtenir així un inòcul d'alta qualitat per les empreses alimentàries. A més es disminuirien els costos d'emmagatzematge i transport. La sobre expressió de la hidrofilina SIP18 "preadapta" les cèl·lules incrementant la capacitat de tolerància a la deshidratació i posterior rehidratació degut tan a l'acumulació intracel·lular de SIP18 com als canvis d'expressió proteica que la sobre expressió de SIP18 comporta. Nosaltres hem mostrat l'expressió diferencial de 45 proteïnes que incrementen la seva abundància i 27 que disminueixen durant l'estrès com a conseqüència de la sobre expressió de SIP18. Algunes d'aquestes proteïnes han estat identificades en el procés d'assecat i rehidratació per primera vegada. Hem identificat altres molècules involucrades en aquest procés d'estrès mitjançant una anàlisi de QTL de dos soques de llevat comercials. Entre els onze gens caracteritzats que van mostrar diferències en la seqüència d'aminoàcids, només la sobre expressió de cinc d'ells mostra un canvi en la viabilitat després de la imposició a l'estrès en els dos contextos genètics analitzats. Aquests resultats mostren que la tolerància a la deshidratació no només depèn de l'activació o inhibició de determinats gens implicats en el procés d'estrès estudiat, sinó també de la seqüència aminoacídica dels al·lels. Els resultats presentats en aquesta tesi doctoral aprofundeixen en el coneixement dels mecanismes moleculars i els metabòlits involucrats en la tolerància a la deshidratació per a la producció adequada de LSA. No obstant això, també serveix com a model per a futures recerques en l'emmagatzematge de teixits en condicions de deshidratació. / La sobre expresión de las hidrofilinas STF2 y SIP18 en cepas de laboratorio, tienen un efecto positivo en la tolerancia a la deshidratación y rehidratación. Además, la sobre expresión de SIP18 en cuatro cepas comerciales de levadura industrial muestra el mismo fenotipo que las cepas de laboratorio sin alterar el proceso fermentativo. Estos resultados nos permiten proponer la sobre expresión de SIP18 como una posible forma de mejorar la viabilidad en la levadura seca activa (LSA) y obtener así un inóculo de alta calidad para las industrías alimentarias. Además se disminuirían los costes de almacenamiento y transporte. La sobre expresión de la hidrofilina SIP18 "preadapta" las células incrementando la capacidad de tolerancia a la deshidratación y posterior rehidratación debido no sólo a la acumulación intracelular de SIP18, sino también a los cambios de expresión proteica que la sobre expresión de SIP18 conlleva. Nosotros hemos mostrado la expresión diferencial de 45 proteínas que incrementan su abundancia y 27 que disminuyen durante el estrés como consecuencia de la sobre expresión de SIP18. Algunas de éstas proteínas han sido identificadas en el proceso de secado y rehidratación por primera vez. Hemos identificado otras moléculas involucradas en este proceso de estrés mediante un análisis de QTL de dos cepas de levadura comerciales. Entre los once genes caracterizados que mostraron diferencias en la secuencia aminopeptídica, sólo la sobre expresión de cinco de ellos muestra un cambio en la viabilidad después de la imposición al estrés en los dos contextos genéticos analizados. Estos resultados muestran que la tolerancia a la deshidratación no sólo depende de la activación o inhibición de determinados genes implicados en el proceso de estrés estudiado, sino también de la secuencia de los alelos. Los resultados presentados en ésta tesis doctoral profundizan en el conocimiento de los mecanismos moleculares y los metabolitos involucrados en la tolerancia a la deshidratación para la producción adecuada de LSA. Sin embargo, también sirve como modelo para futuras investigaciones en el almacenamiento de tejidos en condiciones de deshidratación. / Over expression of STF2 and SIP18 hydrophilin in laboratory has a positive effect on desiccation tolerance. Moreover, over expression of SIP18 in four commercial wine yeast strains produced the same desiccation phenotype as in the laboratory strain without altering fermentative performance. These common results lead us to propose the over expression of SIP18 as a possible way of improving the viability in Active Dried Wine Yeast (ADWY) formulations resulting in savings in transport and storage costs and some extend develope a high-quality inoculum for the food industry. Over-expression of the SIP18 hydrophilin ‘preadapts’ cells by increasing their capacity to overcome and enhance dehydration and rehydration stress. This cell preadaptation is due both to SIP18 accumulation and to changes in the expression of the membrane’s proteomic profile as a consequence of SIP18 accumulation. We shown that 45 proteins increased in numbers after stress imposition and 27 were found to be down regulated, some of which were identified for the first time in this study. Other molecules playin a leading role in enhancing dehydration tolerance were identified using QTL analysis in two commercial wine yeast strains. Characterization of genes with sequence changes between alleles showed that only over expression of five out of eleven genes had different viability for both genetic backgrounds. These results led us to suggest that dehydration tolerance is not gene induced but rather depends on the specific amino acid sequence of each allele in conjunction with other genes activating or inhibiting their function. The results present in this doctoral thesis not only deepen our understanding of the molecular mechanisms and metabolites involved in desiccation tolerance for the production of ADWY, but also serve as a model for future research in tissue storage without the need for a hydric solution.

La pectina va ser descoberta en 1790 quan Vauquelin va trobar primerament una substància soluble dels sucs de fruita. El científic francès Braconnot va continuar el treball de Vauquelin qui va trobar que "una substància àmpliament disponible de plantes vives i ja observada en el passat, tenia propietats gelificants quan se li afegia àcid a la seva solució". La va anomenar "pectina àcida" del grec "pectos" que significa sòlid, coagulat. (The Apple. The Pectin, Herbstreith). La pectina va ser definida per Kertesz (1951) com els àcids pectínics solubles en aigua de grau de metilació variat que són capaços de formar gels amb sucre i àcid sota condicions determinades. Aquesta definició abasta la gelificació amb calci dels àcids pectínics, definits per Kertesz (1951) o com els àcids poligalacturònicos coloidals aïllats de plantes contenint una certa proporció de grups metilèster. Per aquest motiu també el terme pectina s'usa col·lectivament per a incloure àcid pèctic, la forma de pectina completament desestirificada. Les formes de pectina són generalment reconegudes com segures per l'O.S. Food and Drug Administration (Food and Nutrition Encyclopedia, 1983). Les especificacions legals per a pectines estan enunciades internacionalment (Copenhagen Pectin) / La pectina fué descubierta en 1790 cuando Vauquelin encontró primeramente una sustancia soluble de los zumos de fruta. El científico francés Braconnot continuó el trabajo de Vauquelin y encontró que "una sustancia ampliamente disponible de plantas vivas y ya observada en el pasado, tenía propiedades gelificantes cuando se le añadía ácido a su solución". La llamó "pectina ácida" del griego "pectos" que significa sólido, coagulado. (The Apple. The Pectin, Herbstreith).La pectina fué definida por Kertesz (1951) como los ácidos pectínicos solubles en agua de grado de metilación variado que son capaces de formar geles con azúcar y ácido bajo condiciones determinadas. Esta definición abarca la gelificación con calcio de los ácidos pectínicos, definidos por Kertesz (1951) o como los ácidos poligalacturónicos coloidales aislados de plantas conteniendo una cierta proporción de grupos metiléster. De ahí que también el término pectina se usa colectivamente para incluir ácido péctico, la forma de pectina completamente desesterificada.Las formas de pectina son generalmente reconocidas como seguras por la U.S. Food and Drug Administration (Food and Nutrition Encyclopedia, 1983). Las especificaciones legales para pectinas están enunciadas internacionalmente (Copenhagen Pectin)

Teniendo en cuenta la importancia del aroma en la aceptación de los alimentos por parte del consumidor, en esta Memoria abordamos el estudio de la fracción aromática del zumo de naranja, así como las posibles alteraciones que pueda sufrir durante el procesado industrial. El análisis de componentes volátiles totales se realiza mediante la aplicación de la destilación- extracción simultánea (SDE). Esta técnica es favorable en la recuperación de componentes de menor volatilidad que el disolvente orgánico utilizado, por lo que es adecuado para el análisis de hidrocarburos terpénicos, así como aldehídos, alcoholes y ésteres de elevado peso molecular. La microextracción en fase sólida se aplica para el análisis de componentes volátiles en espacio de cabeza, empleando para ello dos recubrimientos poliméricos, uno de naturaleza apolar PDMS (polidimetil siloxano) y otro de naturaleza polar PA (poliacrilato). El estudio de la fracción aromática del zumo de naranja exprimido a mano muestra la elevada eficiencia de la microextracción en fase sólida para la determinación de los componentes volátiles frente a la destilación-extracción simultánea. En el análisis de componentes volátiles totales, treinta y seis componentes son identificados frente a los cuarenta y ocho detectados en espacio de cabeza. Estas diferencias se asocian a las pérdidas de los componentes de elevada volatilidad durante la destilación y posterior concentración. El análisis de la fracción aromática presente en el zumo de naranja exprimido a mano y el zumo pasteurizado revela la importancia de la riqueza del zumo en constituyentes de elevada volatilidad. El zumo pasteurizado presenta un perfil aromático pobre en estos componentes y una mayor abundancia en constituyentes característicos del aceite esencial de la naranja, incorporados al zumo durante el proceso de extracción industrial. Este efecto queda más remarcado cuando se emplea polidimetil siloxano que poliacrilato como recubrimiento polimérico. Se deduce la importancia del empleo de un tipo de fibra u otro dependiendo de la composición y naturaleza de la muestra a estudiar. La incidencia del procesado industrial sobre la fracción aromática muestra un efecto positivo en la disminución de la concentración de determinados componentes como decanal y terpineol que a elevadas concentraciones desarrollan aromas desagradables, frente a la pérdida de los componentes de mayor volatilidad caracterizados por conferir al zumo el aroma frutal. Se estudia la afinidad de los distintos componentes aromáticos hacia la pulpa fina y el suero, resaltando la asociación de la mayoría de los constituyentes de la fracción aromática a la pulpa. Se determina la composición aromática en la pulpa gruesa, destacando que esta podría ser utilizada como fuente para enriquecer la fracción aromática de los zumos de naranja procesados en la industria. El índice de madurez de la fruta afecta a la calidad de la fracción aromática del zumo. Se observa el incremento de la concentración de acetaldehído, etanol y acetato de etilo, componentes definitorios de la calidad de la fruta fresca, y la disminución de los aldehidos característicos del aceite esencial de la naranja, valeraldehído, octanal, nonanal, decanal y neral, frente a un aumento de la concentración de carvona, considerada como índice de degradación de la fracción aromática del zumo. / The importance of the aroma in food is known because of the acceptance by the consumer. For this reason, in this work we study the aromatic fraction present in orange juice, as well as, the changes that could happen during the industrial processing. In the analysis of volatile compounds we used steam-distillation-extraction (SDE) device. This technique is suitable for the determination of components with lower volatility than the solvent used. Solid phase-microextraction (SPME) has been chosen for the analysis of the head-space in orange juice. Two polymeric fibers coatings were used: Polidymeti1xilosane (PDMS) y Polyacrilate (PA). The study of volatile components in hand-squeezed orange juice by SPME shows the high efficiency of this device. 48 components were isolated, while 36 by SDE. These differences are associated with the leaks which happened during the distillation and the subsequent concentration step. The comparative analysis between hand-squeezed and pasteurised orange juice shows the importance of the components with high volatility in the juice aroma. Pasteurised orange juice presents a poor profile in these components and a high concentration in charactetistic essential oil components, these are incorporated during the extraction process. These differences were more indicated when PDMS was applied This highlights the importance of the polymeric coating in the analysis of volatile components. The influence of the industrial processing on the aromatic fraction shows a positive effect, since it is favourable in the decrease of the concentration of certain compounds like decanal and -terpineol When these components are present in a high concentration, they develop a typical of fflavour. However, there is a big loss in the presence of components with high volatility, which are characterised to produce the delicate fresh orange juice flavour. Another parameter studied is the distribution of voIatile compounds between the pulp and the serum, and most of them are associated with the pulp.The aromatic fraction isolated from the thick pulp, confirm that these products can be used as a source of volatile components to improve the aroma in the processed orange juice. The ripening ratio in fue fruit describes the aroma quality of the fruit juice, in this way, we observed an increase in the concentration of acetaldehyde, ethanol and ethyl acetate (components which define the fresh fruit quality). However, a decrease in the characteristics components of the essential oil, like valeraldehyde, octanal, nonanal y decana! was determined. Carvona increases its concentration. This compound has been considered as a degradation index of fue aromatic fraction.

Antecedents: L'aparell digestiu del nounat és ràpidament colonitzat després del naixement. El tipus d'alimentació podria influïr aquest procés. Les fórmules infantils tracten d'imitar l'efecte bifidogènic de la llet humana mitjançant l'addició de prebiòtics. Encara que estudis previs han avaluat els efectes dels prebiòtics en nounats, cap d'ells, va estudiar l'efecte de Orafti Synergy1 (inulina enriquida amb oligofructosa) durant els primers 4 mesos de vida. Objectiu: Demostrar l'eficàcia, seguretat i tolerància d'una fórmula infantil suplementada amb 0,8 g/dl de SYN1 durant els primers 4 mesos de vida. Mètodes: Diseny a doble cec, prospectiu, aleatoritzat i paral·lel amb 2 grupos de neonats alimentats amb fórmula infantil amb o sense (control) suplementació (0.8 g/100ml SYN1) durant 4 mesos. En paral·lel, també s'ha fet el seguiment d'un grup de nens alimentats amb llet materna (LM). Es va avaluar: antropometria, balanç hídric, paràmetres sanguinis, ingesta i acceptació de la fórmula, símptomes digestius, efectes adverses, comportament del nen, malalties, dermatitis atòpica, freqüència i consistència de les deposicions i microbiota fecal. Resultats: 252 nounats van ser assignats al grup control o grup suplementat (124 controls i 128 SYN1) i 131 al grup LM. Els nadons del grup suplementat (SYN1) van mostrar una composició de la microbiota més propera a la dels nadons amb LM, amb una tendència a un major recompte de Bifidobacteries. Les deposicions van ser més toves i la freqüència de deposicions va ser més alta en comparació amb els controls. No hi va haver diferències entre les fórmules en qualsevol dels paràmetres de seguretat i tolerància. Conclusió: Una fórmula infantil suplementada amb SYN1 0.8 g/dL durant els primers 4 mesos de vida és ben tolerada, segura i eficaç. / Antecedentes: El aparato digestivo del recién nacido es rápidamente colonizado después del nacimiento. El tipo de alimentación podría influir este proceso. Las fórmulas infantiles tratan de imitar el efecto bifidogénico de la leche materna mediante la adición de prebióticos. Aunque estudios previos han evaluado los efectos de los prebióticos en recién nacidos, ninguno de ellos, estudió el efecto de Orafti Synergy1 (inulina enriquecida con oligofructosa) durante los primeros 4 meses de vida. Objetivo: Demostrar la eficacia, seguridad y tolerancia de una fórmula infantil suplementada con 0,8 g/dl de SYN1 durante los primeros 4 meses de vida. Métodos: Diseño a doble ciego, prospectivo, aleatorizado y paralelo con 2 grupos de neonatos alimentados con fórmula infantil con o sin (control) suplementación. En paralelo, también se ha hecho el seguimiento de un grupo de niños alimentados con leche materna (LM). Se evaluó: antropometría, balance hídrico, parámetros sanguíneos, ingesta y aceptación de la fórmula, síntomas digestivos, efectos adversos, comportamiento del niño, enfermedades, dermatitis atópica, frecuencia y consistencia de las deposiciones y microbiota fecal. Resultados: 252 recién nacidos fueron asignados al grupo control o grupo suplementado (124 controles y 128 SYN1) y 131 al grupo LM. Los bebés del grupo suplementado (SYN1) mostraron una composición de la microbiota más parecida a la de los bebés con LM, con una tendencia a un mayor recuento de bifidobacterias. Las deposiciones fueron más blandas y la frecuencia de deposiciones fue más alta en comparación con el grupo control. No hubo diferencias entre las fórmulas en cualquiera de los parámetros de seguridad y tolerancia. Conclusión: Una fórmula infantil suplementada con SYN1 0.8 g/dL durante los primeros 4 meses de vida es bien tolerada, segura y eficaz. / Background: The newborn digestive tract is rapidly colonized after birth. Feeding type could influence this process. Infant formulas try to mimic the bifidogenic effect of human milk by addition of prebiotics. Although previous studies assessed the effects of prebiotics in newborns, none of these, to our knowledge, studied the effect of Orafti Synergy1 (oligofructose-enriched inulin) during the firsts 4 months of life. Aim: To demonstrate the efficacy, safety and tolerance of a 0.8 g/dL SYN1 supplemented infant formula during the firsts 4 months of life. Methods: In a double-blind, randomized, placebo-controlled and parallel trial, formula fed healthy term newborns were randomized to receive a control (controls) or SYN1 supplemented infant formula (SYN1). Breastfed newborns (BF) were also followed up for comparison. Anthropometry, water balance, blood parameters, formula intake and acceptance, digestive symptoms, adverse events, child’s behaviour, infant’s illnesses, atopic dermatitis, stools frequency and characteristics and faecal microbiota were assessed. Results: A total of 252 formula fed infants were randomized at birth (124 controls, 128 SYN1) and 131 BF infants were recruited; after 4 months 68 controls, 63 SYN1 and 57 BF completed the study. SYN1 infants showed a microbiota composition closer to that of BF infants, with a trend towards higher Bifidobacterium cell counts, softer stools and a higher deposition frequency compared to controls. There were no differences between formulas in any of the safety parameters such as growth, relevant adverse events, water balance or blood parameters. Conclusion: A 0.8 g/dL SYN1-supplemented infant formula during the first 4 months of life is well tolerated, safe and effective, promoting a gut microbiota closer to that promoted by breastfeeding.

Alcoholic fermentation is a complex microbial process that is characterized by a succession of different species of yeasts. Yeasts with low fermentation activity, such as Candida spp., Hanseniaspora spp., Pichia spp., Rhodotorula spp. and Kluyveromyces spp., are predominant in grape musts and during the early stages of fermentation. Subsequently, Saccharomyces cerevisiae proliferates, dominates and completes the wine fermentation. Non-Saccharomyces spp. can contribute to the aroma properties and chemical composition of the resulting wine. However, they can be both beneficial and harmful. For a good control of the wine making process, cellars need fast, simple and reliable methods for identifying and typing yeasts as well as for detecting and enumerating yeasts.The objectives of this thesis were: (i) to develop molecular techniques for characterization, identification and quantification of wine yeasts, (ii) to evaluate the usefulness of these techniques to identify and quantify yeasts isolated from natural samples of wine fermentation. For this purpose, we used the oligonucleotides based on the repetitive extragenic palindromic (REP) and enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC) elements described in bacteria to characterize reference yeast strains. We also evaluated the usefulness of the complementary primers to ISS (intron splice site) for the same objective. We also developed real-time, or quantitative, PCR (QPCR) to rapidly detect and quantify the total number of yeasts, Saccharomyces spp. and Hanseniaspora spp. in wine without culturing and we also performed a reverse transcriptase QPCR (RT-QPCR) assay from rRNA for total viable yeast quantification. We later validated all these techniques with natural samples of wine.We characterized 41 reference strains belonging to 15 species by three PCR methods: PCR-ISS, ERIC-PCR and REP-PCR. We demonstrated the reproducibility of the techniques, but some problems of reproducibility were sometimes detected with the REP-PCR. The REP-PCR amplification patterns from strains of the same species were identical and some polymorphism was detected by PCR-ISS and ERIC-PCR in strains of the same species. In spite of this intraspecific variability, the strains of the same species showed enough species-specific bands to enable yeast identification. Therefore, all three techniques are useful for rapid, simple and relatively cheap yeast identification. Afterwards, we proved the usefulness of these PCR techniques to monitor yeast diversity during industrial wine fermentation. We evaluated how the growth dynamics of non-Saccharomyces yeasts is affected by new winemaking practice of cold maceration, and by grape maturity. Half of the isolates were ascribed to Candida stellata, Hanseniaspora uvarum and H. osmophila. The other isolates we identified were identified as minor species. As general conclusions we could indicate that the higher the degree of ripeness, the higher the proportion of C. stellata in the grape must. Also, it seemed that cold maceration favored the presence of H. osmophila, C. tropicalis and Z. bisporus. We also developed a QPCR assay for detecting and quantifying the total yeast population, Saccharomyces spp. and Hanseniaspora spp. in a sample of wine. The QPCR assays were first conducted on reference yeast strains from pure cultures to detect the specificity of the primers. We later validated this technique with artificially contaminated and natural samples of wine and compared the results with those obtained from plating to determine effectiveness of QPCR. We obtained a very good correlation between the predicted number of cells determined by QPCR and by plating. The detection of RNA by reverse transcriptase PCR (RT-PCR) is considered to be a better indicator of cell viability than the detection of DNA. We compared total yeast quantification by plating and by QPCR using DNA as template with Saccharomyces cerevisiae quantification using RNA. The counts obtained by the three methods were similar. / La fermentació alcohòlica és un procés microbià complex que es caracteritza per una successió de diferents espècies de llevats. Llevats amb una baixa activitat fermentativa, com són Candida spp., Hanseniaspora spp., Pichia spp., Rhodotorula spp. i Kluyveromyces spp., són predominants en el most i durant els primers dies de fermentació. Posteriorment, Saccharomyces cerevisiae prolifera, domina i completa la fermentació alcohòlica. Els llevats anomenats no-Saccharomyces spp. poden contribuir a les propietats aromàtiques i composició química del vi resultant. No obstant, aquests llevats poden ser tant beneficiosos com perjudicials. Per a un bon control del procés de vinificació, els cellers necessiten mètodes ràpids, senzills i fiables per a la identificació i tipificació de llevats a l'igual que per detectar i enumerar llevats.Els objectius d'aquesta tesi eren: (i) desenvolupar tècniques moleculars per a la caracterització, identificació i quantificació llevats vínics, (ii) avaluar la utilitat d'aquestes tècniques per identificar i quantificar llevats aïllats de mostres reals de fermentacions alcohòliques. Amb aquesta finalitat, vam utilitzar els oligonucleòtids basats en repeticions d'elements palindròmics extragèniques (REP) i repeticions d'elements consensus entobacterials intergènics (ERIC) descrits en bacteris per caracteritzar soques de llevats de referència. També vam avaluar la utilitat dels primers complementaris a ISS (intron splice site) amb el mateix objectiu. També vam desenvolupar la PCR a temps real o PCR quantitativa (QPCR) per detectar i quantificar de manera ràpida el nombre total de llevats, Saccharomyces spp. i Hanseniaspora spp. en vi sense cultiu en placa i també vam realitzar la reacció de la transcriptasa inversa i posteriorment QPCR (RT-QPCR) a partir de rRNA per a la quantificació de llevats totals viables. Posteriorment, vam validar totes aquestes tècniques amb mostres reals de vi.Vam caracteritzar 41 soques de referència pertanyents a 15 espècies amb tres tècniques: PCR-ISS, ERIC-PCR i REP-PCR. Vam demostrar la reproduïbilitat de les tècniques, però amb la tècnica REP-PCR vam detectar alguns problemes de reproduïbilitat. Els patrons d'amplificació REP-PCR de soques de la mateixa espècie eren idèntics i amb la PCR-ISS i ERIC-PCR vam detectar alguns polimorfismes en soques de la mateixa espècie. Malgrat aquesta variabilitat intraespecífica, les soques de la mateixa espècie mostraven força bandes espècie-específiques que permetien la identificació del llevat. Per tant, les tres tècniques són útils per a una ràpida, senzilla i relativament barata identificació de llevats.Posteriorment, demostràrem la utilitat d'aquestes tècniques per monitoritzar la diversitat de llevats durant una vinificació industrial. Vam avaluar com la dinàmica de creixement dels llevats no-Saccharomyces spp. podia veure's afectada per la pràctica de la maceració en fred, i per el grau de maduresa del raïm. La meitat dels aïllats eren Candida stellata. Hanseniaspora uvarum i H. osmophila. Els altres aïllats eren identificats com a espècies minoritàries. Com a conclusions generals, podem indicar quecom més alt el grau de maduresa, més alta la proporció de C. stellata en el most. També, sembla que la maceració en fred afavoreix la presència de H. osmophila, C. tropicalis i Z. bisporus.També vam desenvolupar la tècnica de la QPCR per detectar i quantificar la població total de llevats, Saccharomyces spp. i Hanseniaspora spp. en una mostra de vi. Els assaigs de QPCR eren conduits primer sobre cultius purs de soques de llevats de referència per tal de detectar l'especificitat dels primers. Més tard, validàrem aquesta tècnica amb vi contaminat artificialment i amb mostres reals de vi i comparàrem els resultats obtinguts amb aquells obtinguts per cultiu en placa per determinar l'eficàcia de la QPCR. Vam obtenir una bona correlació entre el número predit de UFC per QPCR i per plaqueig. La detecció de RNA mitjançant PCR prèvia reacció de la transcriptasa inversa (RT-PCR), es considera un millor indicador de viabilitat que la detecció de DNA. Vam comparar la quantificació dels llevats totals per plaqueig i per QPCR utilitzant DNA i utilitzant RNA. El recompte obtingut amb els tres mètodes fou similar.

Las bacterias acéticas (BA) son microorganismos Gram-negativas, elipsoidales y poseen un metabolismo aeróbico estricto, suelen utilizar sustratos como la glucosa y etanol, como fuentes de energía.En general, no hay muchos antecedentes del comportamiento de las bacterias acéticas (BA) en ambientes naturales o industriales. Éstas son consideradas microorganismos fastidiosos, bebido a la falta de cultivabilidad en medios sólidos idóneos. La correcta aplicación de las técnicas independiente de cultivo depende principalmente de una buena extracción del DNA de las BA en matrices complejas (vino y vinagre) tanto desde un punto de vista cuantitativo como cualitativo para su cultivo. Se utilizaron métodos rápidos y fiables para la identificación de BA como RFLPs-PCR 16S rRNA, RFLPs-PCR ITS 16S-23S rRNA y la utilización de los métodos independientes de cultivo como DGGE-PCR, qPCR general y qPCR específica con sondas TaqMan-MGB, fueron de gran ayuda para mejorar nuestro conocimiento acerca de las BA. / Acetic acid bacteria (AAB) are Gram-negative, ellipsoidal that have an obligatory aerobic metabolism. They can use such substrates as glucose y ethanol as energy sources.In general, there are not many antecedents of the behavior acetic acid bacteria in natural or industrial environments. The Acetic acid Bacteria (AAB) are considered fastidious microorganisms due to their lack of good cultivability in suitable solid media. The correct application of the culture-independent methods depends mainly on a good extraction of the DNA of vinegar and wine matrices from a qualitative and quantitative point of view for their culturing. Fast and reliable methods were used to this research for identify AAB as RFLPs-PCR 16S rRNA, RFLPs-PCR ITS 16S-23S rRNA and the culture-independent methods as DGGE-PCR, general gPCR and specific gPCR with TaqMan-MGB probes. These methods were a great help to improve our knowledge of AAB.

El mejillón es una especie que, debido a sus funciones reproductivas, consume una gran cantidad de energía, suministrada en su mayor parte por el glucógeno, que el individuo ha ido acumulando en grandes cantidades durante la primera fase de su ciclo biológico; estos niveles pueden ser muy elevados según el momento del ciclo biológico de que se trate, obteniéndose un máximo del 28% de glucógeno referido a peso seco y un mínimo de 1'7%. La presencia de esta enorme cantidad de material gluciálico, que se moviliza de modo general y relativamente rápido, hace que el mejillón disponga de unos sistemas de síntesis y degradación del glucógeno muy eficaces y capaces de ser altamente regulados de un modo estacional, con el fin de utilizar la energía contenida durante la gametogénesis. Hasta el momento de realizar la presente tesis no se habían estudiado de una manera sistemática los mecanismos degradativos y biosintéticos del glucógeno en el mejillón, determinándose en cambio ampliamente los niveles, características físicas y químicas, así como la presencia de otros azúcares, solubles, en su composición. La gran variabilidad en contenido de glucógeno de las diversas clases de moluscos hace que el estudio de tales mecanismos sea complicado. Para poder iniciar nuestro trabajo, hemos seleccionado una serie de muestras de mejillones procedentes de comercialización, pertenecientes a la especie "Mytilus edulis" L., considerando dicha especie en sentido más lato, puesto que la heterogeneidad fenotípica no nos permitía circunscribir el estudio a una cepa uniforme y seleccionada. La variabilidad de las muestras fue comprobada estudiando la correlación entre diversos parámetros biométricos, tales como la longitud máxima de la concha, la anchura máxima, el grosor y el peso escurrido del animal completo. El principal inconveniente que presentaban los animales utilizados era que habían tenido que soportar el relativamente largo viaje desde los centros de producción a los lugares de consumo, a lo que debía añadirse el tiempo de almacenaje previo a la comercialización, que era variable. Durante todo este tiempo el animal mantiene la concha cerrada, conservando dentro el agua intervalvar y sufriendo un período de anoxia superior al que soporta en condiciones naturales durante la marea baja, y que tal vez puede haber afectado de alguna manera a los niveles de enzimas estudiados, aunque supusimos de un modo apriorístico que este efecto sería sólo de tipo cuantitativo y no cualitativo. Otro problema, quizás más importante que el anterior, era que estos animales debían soportar un prolongado periodo de hambre, desde el momento en que eran extraídos del vivero y transportados a la estación depuradora, donde si bien pueden respirar son sometidos a un tiempo variable a un flujo de agua filtrada y desinfectada, por lo que durante este periodo filtran agua que carece de materiales en suspensión y de este modo se vacía el tubo digestivo, de manera que los animales sobreviven a base de sus reservas, especialmente en lo que respecta al hepatopáncreas, donde hemos podido encontrar niveles extraordinariamente variables de glúcidos solubles y de glucógeno según la vivacidad de los animales, que suponemos correlacionada con el tiempo transcurrido entre la captura y el análisis.A la hora de escoger los especímenes objeto de estudio, se desecharon todos aquellos que llegasen defectuosos (concha rota, valvas entreabiertas) y los seleccionados fueron conservados en la nevera, generalmente bajo agua de mar artificial, a unos 4ºC.

La policia administrativa, una de les més clàssiques formes d'intervenció pública en l'esfera jurídica dels particulars, ha vingut caracteritzant fins a temps recents l'acció administrativa en el sector dels aliments. No obstant, les limitacions que sembla presentar aquesta forma d'intervenció davant el riscos que avui emergeixen de tal sector, i en particular de l'industria alimentària, han propiciat la construcció d´un nou i, fins a cert punt, complex sistema, caracteritzat a grans trets per la intersecció entre agents públics i privats: els sistema d´anàlisis i gestió de riscos. / As one of the most classical types of public intervention within the juridical sphere of individuals, the administrative policy has described the administrative action within the food sector, until recent times. Nevertheless, in front of the risks arising from that sector, particularly from the food industry, this form of intervention seems to evidence serious limitations, thus favouring the emergence of a new system , complex up a certain point, in outline described by the connection between public and private agents: the risk analysis and management system.

Las proantocianidinas, que son agentes hipolipidémicos, son los polifenoles mayoritarios en la dieta humana que ayudan a combatir factores de riesgo contra la obesidad y la enfermedad cardiovascular. Por otro lado, los mi(cro)RNAs participan en la regulación de genes del metabolismo lipídico y, el efecto de las proantocianidinas sobre dichos miRNAs es desconocido. Por ello, el principal objetivo de la tesis ha sido evaluar si los polifenoles, principalmente proantocianidinas, modulan miR-33 i miR-122, dos miRNAs involucrados en el metabolismo lipídico. Para ello se usaron modelos animales y celulares. Los resultados muestran que los compuestos de la dieta modulan estos miRNAs, mejorando el metabolismo lipídico, y que los polifenoles se unen directamente a miR-33 i miR-122. En conclusión, las proantocianidinas al modular los níveles de miR-33 i miR-122 pueden ser útiles para tratar enfermedades metabólicas. Además, estos resultados también sugieren que la modulación los miRNAs puede ser un mecanismo molecular usado por los componentes de la dieta por el que mejoran un perfil aterogénico / mi(cro)RNAs are becoming relevant for the epigenetic control of metabolism. miRNAs are small non-conding RNAs of approximately 19-24 nucleotides in length that regulate the expression of target genes at post-transcriptional level. Specifically, miR-33 is a critical regulator of cholesterol and fatty acid homeostasis by repressesing fatty acid oxidation, hepatic HDL biogenesis and cholesterol efflux to HDL. Furthermore, miR-122, which is liver-specific, regulates several genes that control fatty acid and triglyceride biosynthesis. On the other hand, dietary components, such polyphenols, are reported to have benefitial effects againts cardiovascular diseases, reducing triglycerides and/or cholesterol plasma levels. Hence, the main objective of this thesis was to evaluate the capacity of polyphenols, mainly proanthocyanidins, to modulate miR-33 and miR-122 in different physiological situations. Result showed that polyphenols modulate these miRNAs and their target genes in liver, suggesting that miRNAs regulation are a new molecular mechanims used by some polyphenols to modulate lipid metabolism and to improve the atherogenic profile. Moreover, NMR studies showed that polyphenols directly bind to miR-33 and miR-122, suggesting that polyphenols can modulate cell miRNAs levels by a direct interaction.

En los últimos años ha suscitado un gran interés la relación existente entre consumo moderado de vino y salud. Los efectos beneficiosos asociados al consumo moderado de vino se deben en gran medida a la presencia en este alimento de compuestos fenólicos. Sin embargo, no se conoce demasiado acerca del proceso de absorción, transporte sanguíneo, distribución tisular, metabolismo y excreción de los compuestos fenólicos en general (y de las procianidinas en particular) debido a una serie de problemas metodológicos existentes cuando se trabajan con este tipo de compuestos. Las procianidinas son unos compuestos oligoméricos presentes en el vino tinto en elevadas concentraciones que ejercen una serie de efectos fisiológicos beneficiosos para la salud. Sin embargo, para que estos compuestos puedan desarrollar estos efectos beneficiosos deben ser absorbidos in vivo de la dieta. Por esta razón, esta tesis doctoral se centra en la síntesis y marcaje radiactivo de oligómeros de epicatequina y en el posterior estudio de la absorción in vivo en la rata de estos compuestos sintetizados. La síntesis de los oligómeros de epicatequina se lleva a cabo simulando una serie de reacciones de polimerización que tienen lugar durante el proceso de envejecimiento del vino tinto entre las procianidinas y el acetaldehído. La simulación a escala de laboratorio de este tipo de reacciones entre la epicatequina (monómero) y acetaldehído permitió la síntesis de estructuras oligoméricas con un grado de condensación comprendido entre 2 y 10 (cuando se añadía al medio acetaldehído en defecto) y polímeros de 16 unidades de epicatequina y trímeros (cuando al medio de reacción se añadía acetaldehído en exceso). Asimismo, la utilización de acetaldehído radiactivo permitió marcar radiactivamente los oligómeros de epicatequina sintetizados. Por otra parte, se evaluó la estabilidad de estos compuestos al ser sometidos a un entorno ácido similar al existente en el estómago y a un entorno básico similar al que existe en el intestino delgado. Los resultados obtenidos indicaron que los oligómeros de epicatequina permanecían estables en un entorno ácido, mientras que no eran estables cuando se les ponía en contacto con un medio básico. Para estudiar el proceso de absorción de los oligómeros de epicatequina sintetizados, se administró una sonda intragástrica de 50 mg de oligómeros de epicatequina a ratas macho Wistar, detectándose en el plasma de estos animales de experimentación la presencia de una estructura dimérica formada por dos epicatequinas unidas mediante un puente de acetaldehído. Además, se comprobó como la concentración plasmática de este compuesto dimérico era máxima dos horas después de que los animales de experimentación hubiesen ingerido los compuestos oligoméricos. Asimismo, también se detectó la presencia de este compuesto dimérico en el hígado de estos animales, hecho que señalaba a este órgano como un órgano diana de las procianidinas a tenor de los anteriores resultados obtenidos por el grupo de investigación, que habían detectado una serie de cambios a nivel de expresión génica hepática y a nivel de metabolismo hepático. La presencia del dímero de epicatequina en el hígado es un hallazgo importante, ya que la bibliografía no describe la presencia de estos compuestos en el hígado y además, los cambios comentados anteriormente en el hígado y atribuidos a las procianidinas podrían ser debidos a la interacción directa de estos compuestos con proteínas señalizadoras y/o reguladoras presentes en este órgano. / In the last years, a great interest in the existing relation between moderate wine consumption and health has appeared. The beneficial effects associated to the moderate wine consumption are due mainly to the presence of phenolic compounds in wine. Nevertheless, the absorption, sanguineous transport, tissue distribution, metabolism and excretion of phenolic compounds in general (and procyanidins in particular) remain unknown due to methodological problems associated with this type of compounds. Procyanidins are oligomeric compounds present in red wine in high concentrations that exert beneficial physiological effects for the health. However, so that these compounds can develop these beneficial effects, they must be absorbed from the diet. Therefore, this PhD thesis is based on the synthesis and radiolabel of epicatechin oligomers and in the study of the absorption of these compounds in rats. Epicatechin oligomers synthesis is carried out simulating a series of polymerization reactions that take place during the red wine aging process between procyanidins and acetaldehyde. The simulation on laboratory scale of this type of reactions between epicatechin (monomer) and acetaldehyde allowed the synthesis of oligomeric structures with a condensation degree between 2 and 10 (when acetaldehyde in defect was added to the reaction medium) and polymers of 16 epicatechin units and trimers (when acetaldehyde in excess was added to the reaction medium). Besides, the use of radiolabelled acetaldehyde allowed to radiolabel the epicatechin oligomers with 14C. On the other hand, the stability of these compounds in acid surroundings, similar to the existing one in the stomach, and basic surroundings, similar to which exists in the small intestine, was evaluated. The obtained results indicated that epicatechin oligomers were stable in acid surroundings, whereas they were not stable in basic surroundings. In order to study the absorption in vivo in rats of the synthesized epicatechin oligomers, 50 mg of epicatechin oligomers were administered orally by direct stomach intubation to male Wistar rats. The presence of a dimeric structure formed by two epicatechins linked by an ethyl bridge was detected in the plasma of these experimentation animals. In addition, it was verified that the maximum plasma concentration of this dimeric compound was reached two hours after the administration of epicatechin oligomers to the rats. Moreover, the presence of this dimeric compound in the liver of these animals was also detected, what indicated that the liver was a target organ of procyanidins in accordance with previous results obtained by our investigation group, that had detected changes at hepatic gene expression level and hepatic metabolism level. The presence of the epicatechin dimer in the liver is an important finding, because in the bibliography is not described the presence of these compounds in the liver and, in addition, the changes in the liver previously commented and attributed to the procyanidins could have been due to the direct interaction of these compounds with signalling and/or regulatory proteins present in this organ.