The correct development of multicellular organisms is tightly regulated by intrinsic and extrinsic factors at specific time points. Disturbance on any level of these multiple processes may result in drastic phenotypes or eventually death of the organism. The midbrain-hindbrain boundary (also termed isthmic organizer) is a region of high interest as well in early as also in later development. The isthmic region carries organizer identity by the expression and subsequent release of FGF8. False patterning events of this region in early developmental stages would therefore display dramatic results over time. As it has been shown that the midbrain-hindbrain boundary (mhb) in the zebrafish is a compartment (or lineage restriction) boundary I tried to understand the underlying molecular mechanism for its correct establishment. In this work I focused both on embryological, molecular and genetic means to characterize involved molecules and mechanisms. In the first part of the thesis I followed in vivo cell transplantation assays, having started with an unbiased one. Cells of either side the mhb were challenged with this boundary by bringing them into direct cell contact with their ectopic counterpart. In a biased approach, cells overexpressing mRNA of specific candidate genes were transplanted and their clonal distribution in host embryos was analyzed. In the second part of the thesis I started interfering with specific candidate genes by transiently knocking down their protein translation. The adhesion molecules of the Eph/ephrin class had been shown to restrict cell mixing and thereby creating compartment boundaries in other tissues, such as the hindbrain, in the zebrafish and other organisms. Additionally, we generated several stable genetic mutant lines in cooperation with the Tilling facility at the Max-Planck-Institute. The only acquired potential null mutant ephrinB2bhu2971 was analyzed and characterized further. I observed that a knock down or knock out of only one of the ephrinB2 ligands does not seem to be sufficient for a loss of compartment boundary formation. The combinatory approach of blocking translation of EphrinB2a in ephrinB2bhu2971 mutants gave very complex and interesting phenotypes, which need to be investigated further.

O fator derivado do epitélio pigmentado (PEDF) é um fator neurotrófico que possui um grande potencial trófico nos neurônios motores da medula espinal, bem como é capaz de modular o microambiente da lesão. Desta forma, analisamos a capacidade do tratamento com PEDF em promover a neuroplasticidade da medula espinal após lesão isquêmica. Ratos Wistar adultos foram submetidos à lesão medular isquêmica do tipo fototrombótica, segundo o método de Rose Bengal, na altura do 11° segmento torácico e foram imediatamente tratados com inoculação local de PEDF (grupo PEDF) ou solvente (grupo Salina). Ratos submetidos à cirurgia simulada (grupo Sham) receberam a injeção do solvente. Ao término do procedimento cirúrgico, os ratos foram submetidos a testes neurofuncionais durante 6 semanas. Após esse período, os animais sofreram eutanásia e o tecido medular foi dividido entre as técnicas de imunoistoquímica, western blot e PCR em tempo real. Foi analisada na região lombar anterior da medula espinal a modulação das CSPGs, a expressão dos fatores neurotróficos NT-3, GDNF, BDNF e FGF-2, bem como os níveis das moléculas associadas à angiogênese e apoptose (laminina e Bcl-2), das proteínas relacionadas à neuroplasticidade (MAP-2, GAP-43 e sinaptofisina) e do sistema Eph/efrina e a RhoA, que são capazes de modular o crescimento de fibras. Os resultados mostraram uma recuperação parcial e espontânea do comportamento sensório-motor dos animais que foram submetidos à lesão fototrombótica, onde o tratamento com PEDF foi capaz de potencializar alguns desses parâmetros. A análise da região lombar anterior da medula espinal, caudal à lesão, mostrou uma diminuição das CSPGs nos dois grupos lesados, o que pode ter favorecido os eventos de neuroplasticidade. O tratamento com PEDF foi capaz de promover a regulação dos fatores neurotróficos NT-3 e GDNF, diminuir a angiogênese local (diminuição da laminina) e potencializar o processo de neuroplasticidade (aumento da MAP-2) nessa região. A lesão medular isquêmica foi capaz de modular a expressão do receptor EphA4 e da efrina-B1 e o tratamento com PEDF possivelmente regulou o estado de ativação da efrina-A2 e da efrina-B3 e certamente modulou a ativação da efrina-B2. Ainda, os receptores Eph e as efrinas foram observados diferentemente nos neurônios e astrócitos. Nossos resultados confirmam a capacidade plástica da medula espinal após lesão e mostra que o tratamento com PEDF foi capaz de potencializar esse processo / The pigment epithelium derived factor (PEDF) is a neurotrophic factor that has a great trophic potential in the motor neurons of the spinal cord, and is able to modulate the lesion microenvironment. We analyzed the capacity of the treatment with PEDF to promote the neuroplasticity after ischemic spinal cord injury. Adult male Wistar rats were underwent to photothrombotic ischemic spinal cord injury, according to the Rose Bengal method, at the level of 11° thoracic segment, and were immediately treated with local injection of PEDF (PEDF group) or solvent (Saline group). Rats underwent to a sham surgery (Sham group) received solvent injection. At the end of surgery, the rats were submitted to neurofunctional tests during 6 weeks. After this period, the animals were euthanized, and the anterior lumbar region of the spinal cord tissue was submitted to immunohistochemistry, western blot and real-time PCR analyses. The inhibitory response of CSPGs, the expression of neurotrophic factors (NT-3, GDNF, BDNF and FGF-2), the molecules associated with angiogenisis and apoptosis (laminin and Bcl-2), the proteins related to neuroplasticity (MAP-2, GAP-43 and synaptophysin), as well the Eph/ephrin system and the RhoA, which is able to modulate the fibers growth, were evaluated. The results showed a spontaneous, and parcial, recovery of the sensory motor behavior of the animals that were underwent to a photothrombotic injury, and the treatment with PEDF was able to potentiate some of these parameters. The analysis of the anterior lumbar region of the spinal cord, caudally to the lesion, showed a decrease of CSPGs, which may have favored the neuroplasticity events. The treatment with PEDF was able to promote the regulation of NT-3 and GDNF, as well the reduction of laminin and the increase of MAP-2 in that region. In relation to the Eph/ephrin system, the ischemic spinal cord injury was able to modulate the EphA4 receptor and ephrin-B1 expression, and the treatment with PEDF possibly regulated the activation state of ephrin-A2 and ephrin-B3 and certainly modulated the ephrin-B2 activation. Eph receptors and ephrins have been found specifically in neurons and astrocytes. Our results confirmed the plastic capacity of the spinal cord after injury and showed that the treatment with PEDF was able to enhance this process

Au sein d'un organisme les cellules se divisent et assurent la croissance, la différentiation et l'homéostasie des tissus. Des travaux récents proposent qu'elles communiquent activement entre voisines au sein des organes solides pour coordonner leur propre division et la préservation de l'intégrité tissulaire. Nous proposons que la signalisation Eph-éphrine, acteur de la communication cellulaire locale, participe à cette coordination entre division cellulaire et cohésion du tissu. Au cours de ma thèse, j'ai démontré dans plusieurs modèles cellulaires que la signalisation Eph-éphrine contrôle la division cellulaire et peut induire des retards dans l'abscission et de la polyploïdie. J'ai prouvé par vidéomicrosocpie que ces défauts d'abscission dépendent du domaine catalytique du récepteur EphB2 et de l'activation de la protéine tyrosine kinase relais c-Src. En cascade, c-Src phosphoryle un régulateur clé de la stabilité du pont intercellulaire, la protéine citron kinase (CitK). J'ai également observé que CitK était anormalement localisé durant la cytocinése en aval de la voie Eph. Par des essais kinase in vitro, j'ai exclu une phosphorylation directe de CitK par le récepteur Eph et identifié c-Src comme capable de phosphoryler directement CitK. J'ai identifié les résidus tyrosines de CitK phosphorylés par c-Src, mutés deux d'entre eux et à l'aide d'analyses de sauvetage phénotypique, démontré que ces résidus étaient nécessaires et suffisants pour induire des défauts d'abscission. J'ai ensuite validé in vivo ce rôle original de la voie Eph-éphrine, dans le contexte du développement neuronal chez la souris. Plusieurs membres de la famille des Eph-éphrines sont exprimés dans les progéniteurs neuraux à l'origine des neurones corticaux et des auteurs ont montrés que CitK contrôle la cytocinèse de ces cellules. En utilisant un système Cre-lox, j'ai spécifiquement éteint la signalisation Eph dans ces progéniteurs et observé une modification de la ploïdie neuronale dans ces animaux. J'ai également observé dans les progéniteurs neuraux une co-localisation physiologique de résidus tyrosines phosphorylés et de la protéine CitK, qui adopte un enrichissement apical caractéristique. Ces résultats suggèrent notamment que la signalisation Eph-éphrine pourrait contrôler l'abscission des progéniteurs neuraux via la phosphorylation de CitK. La cytocinèse est aujourd'hui décrite comme un processus cellulaire autonome orchestré par la machinerie intracellulaire. Les résultats obtenus durant mon doctorat suggèrent que la cytocinèse est également régulée par l'environnement local de la cellule comme j'en ai fait la démonstration avec la signalisation Eph-éphrine. D'autre part, mes travaux suggèrent que la phosphorylation de CitK sert d'interrupteur moléculaire durant la progression à travers la division cellulaire et le contrôle de la ploïdie des neurones. / Cells within an organism successfully divide to ensure growth, differentiation and homeostasie. Recent work suggests that dividing cells actively communicate with neighbours thus spatially and temporally coordinating cell division while maintaining tissue cohesiveness. We hypothesized that Eph-ephrin signalling, a local cell-cell signalling pathway, could participate in coordinating cell division within a tissue. Using vertebrate and invertebrate cell culture models I showed that Eph-signalling controls cell division and induces delay in the abscission of nascent daughter cells as well as polyploidy. Using time-lapse imaging I proved that the Eph-mediated abscission failure depends on the catalytic activity of the receptor via the non receptor tyrosine kinase relay molecule c-Src. Downstream of Eph signalling c-Src phosphorylates the protein citron kinase (CitK) a well known regulator of intercellular bridge stability. I also observed that CitK was abnormally localized during cytokinesis when Eph signalling was active. Further, using in vitro kinase assays, I demonstrated that Eph does not directly phosphorylate CitK but that c-Src could do so. In addition, using Mass Spectrometry I mapped all tyrosine residues directly phosphorylated by c-Src. I mutated two of them located in the Rho binding domain of CitK and demonstrated that phosphorylation of those residues are necessary and sufficient to induce cytokinesis failure. I validated in vivo this novel role of Eph-ephrin signalling in a physiological context in the developing mouse neocortex. Members of the Eph/ephrin family are expressed in neural progenitors that give rise to neurons of the cortex upon neurogenic division. Importantly, CitK has been shown by others to control cytokinesis of these progenitor cells. Using the Cre-lox system, I specifically turned off Eph forward signalling in neural progenitor cells and observed an alteration of neuronal ploidy in these mutant animals. Further, I also observed that CitK which adopts a particular apical localisation in neural progenitors physiologically co-localized with phosphorylated tyrosine residues. Altogether, these results suggest that Eph-ephrin signalling controls abscission of neural progenitors by promoting phosphorylation of CitK. The textbook view of cytokinesis is that it is a cell autonomous event orchestrated by the intracellular machinery. Data obtained during my PhD suggest that cytokinesis is also regulated by local environment, here Eph/ephrin signalling, and that phosphorylation of CitK may represent a molecular switch in the normal progression of cell division and in the control of neuronal ploidy.

The correct development of multicellular organisms is tightly regulated by intrinsic and extrinsic factors at specific time points. Disturbance on any level of these multiple processes may result in drastic phenotypes or eventually death of the organism. The midbrain-hindbrain boundary (also termed isthmic organizer) is a region of high interest as well in early as also in later development. The isthmic region carries organizer identity by the expression and subsequent release of FGF8. False patterning events of this region in early developmental stages would therefore display dramatic results over time. As it has been shown that the midbrain-hindbrain boundary (mhb) in the zebrafish is a compartment (or lineage restriction) boundary I tried to understand the underlying molecular mechanism for its correct establishment. In this work I focused both on embryological, molecular and genetic means to characterize involved molecules and mechanisms. In the first part of the thesis I followed in vivo cell transplantation assays, having started with an unbiased one. Cells of either side the mhb were challenged with this boundary by bringing them into direct cell contact with their ectopic counterpart. In a biased approach, cells overexpressing mRNA of specific candidate genes were transplanted and their clonal distribution in host embryos was analyzed. In the second part of the thesis I started interfering with specific candidate genes by transiently knocking down their protein translation. The adhesion molecules of the Eph/ephrin class had been shown to restrict cell mixing and thereby creating compartment boundaries in other tissues, such as the hindbrain, in the zebrafish and other organisms. Additionally, we generated several stable genetic mutant lines in cooperation with the Tilling facility at the Max-Planck-Institute. The only acquired potential null mutant ephrinB2bhu2971 was analyzed and characterized further. I observed that a knock down or knock out of only one of the ephrinB2 ligands does not seem to be sufficient for a loss of compartment boundary formation. The combinatory approach of blocking translation of EphrinB2a in ephrinB2bhu2971 mutants gave very complex and interesting phenotypes, which need to be investigated further.

EINLEITUNG Das maligne Melanom stellt aufgrund seiner frühen Metastasierung und der Resistenz gegenüber den bisher bekannten Therapieansätzen eine der aggressivsten Tumorentitäten dar. Allerdings handelt es sich beim Melanom um einen antigenen und immunogenen Tumor. Dies schürt die Hoffnung, dass durch das bessere Verständnis der Mechanismen, die der Metastasierung, aber auch der Dysregulation des Immunsystems zugrunde liegen, Rückschlüsse auf neue Therapieansätze, beispielsweise unter Einbeziehung der Immunabwehr, gezogen werden können. Darüber hinaus würde die Entwicklung von Radiotracern, die eine frühzeitige Diagnose und möglicherweise auch die Auswahl von Patienten für eine personalisierte Tumortherapie ermöglichen, die Heilungschancen des malignen Melanoms wesentlich verbessern. Das Eph-Ephrin-System wiederum stellt ein vielfältiges Zellkommunikations-System dar, das sowohl in lebenswichtige als auch in pathologische Prozesse involviert ist. Beispielsweise nehmen Eph-Rezeptoren und Ephrine Einfluss auf die gerichtete Bewegung von neuronalen, endothelialen und inflammatorischen Zellen. Zudem beeinflussen sie die Bewegung von Tumorzellen und tragen so zur Tumorprogression bei. Ausgehend von diesem Hintergrund wurde die Hypothese formuliert, dass die Eph-Ephrin-vermittelte Interaktion von Melanomzellen und Tumor-assoziierten inflammatorischen Zellen die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms beeinflusst. Im Speziellen sollte im Rahmen der vorliegenden Arbeit geprüft werden, ob die Rezeptor-Tyrosinkinase EphB4 im Zusammenspiel mit seinem Liganden EphrinB2 die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms fördert. Darüber hinaus sollte getestet werden, ob der Rezeptor EphB6, der ebenfalls zur Bindung von EphrinB2 fähig ist, aber über eine mutierte und damit funktionsunfähige Kinasedomäne verfügt, eine regulative Rolle übernimmt und antitumorigen wirkt. Aufbauend auf den Erkenntnissen zur Bedeutung von EphB4, EphB6 und EphrinB2 beim malignen Melanom sollten zudem verschiedene Ansätze zur Bildgebung der oben genannten Eph-Rezeptoren und Ephrine mittels PET etabliert und geprüft werden. ERGEBNISSE UND DISKUSSION Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig gezeigt, dass die Membranproteine EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei den ausgewählten humanen Melanomzellen und den inflammatorischen Zellen exprimiert werden und somit potentielle Interaktionsmöglichkeiten dieser Zellen darstellen. Infolge der Kokultur mit HL-60(M)-Zellen, die als Modell für Tumor-assoziierte Makrophagen dienten, kam es zu einer verminderten Adhäsion und/oder Migration der Melanomzellen sowie im Falle der A375- und A2058-Melanomzellen zu einer verstärkten Sekretion des proinflammatorischen Zytokins IL-6. Aufgrund der breiten Wirkung von IL-6 ergeben sich daraus vielfältige Einflussmöglichkeiten auf das Tumormikromilieu. Diese wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit jedoch nicht näher charakterisiert, da erste Ergebnisse eine Beteiligung des Eph-Ephrin-Systems ausschlossen. Während die Überexpression von EphB6 keinen Einfluss auf die Metastasierungs-relevanten Eigenschaften der A375-Melanomzellen hatte, führte die erhöhte Proteinbiosynthese von EphB4 zu einer verminderten Migration der Zellen im intakten Zellverband. Des Weiteren bewirkte EphB4 eine verstärkte Adhäsion der A375-Zellen an das Extrazellularmatrix-Protein Fibronektin, wodurch die Migration dieser Melanomzellen, im Sinne einer Metastasierung, zusätzlich beeinträchtigt wird. Die erhöhte mRNA-Expression des Liganden EphrinB2 in den A375-Melanomzellen führte zu einer verminderten chemotaktischen Migration der Zellen. Um den Einfluss von EphB4 auf die Tumorprogression und Tumorangiogenese beim malignen Melanom in vivo untersuchen zu können, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein murines Xenograft-Modell mit subkutanen A375 pIRES- bzw. A375 EphB4-Tumoren etabliert. Die Auswertung der Tumorvolumina sowie der [18F]FDG-, [18F]FMISO- und Hoechst 33342-Anreicherung in den Tumoren ergab, dass die erhöhte EphB4-Proteinbiosynthese zu tendenziell kleineren Tumoren führte. Diese waren zudem signifikant schwächer perfundiert und wiesen im Inneren größere hypoxische Areale auf als die A375 pIRES-Tumoren. Somit zeigte EphB4 neben seiner antimetastasischen Wirkung in vitro auch eine antitumorigene Wirkung in vivo, wobei letztere möglicherweise auf eine Störung der Gefäßbildung zurückzuführen ist. Da eine adäquate Blutversorgung der Tumoren für die Metastasierung von Tumorzellen von Bedeutung ist, könnte dies auch auf eine antimetastatische Wirkung in vivo hinweisen. Des Weiteren wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein neuer, 18F-markierter EphB4 Kinaseinhibitor (Verbindung [18F]2) getestet. Dieser zeigte im A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell eine geringe Tumoranreicherung, die von der EphB4-Proteinbiosynthese in den Tumoren unabhängig war. Darüber hinaus kam es zur schnellen hepatobiliären Ausscheidung von Verbindung [18F]2, was deren radiopharmazeutischer Anwendung im Wege steht. SCHLUSSFOLGERUNG UND AUSBLICK Insbesondere die erhöhte Proteinbiosynthese von EphB4 hatte im Falle der untersuchten A375-Melanomzellen zu einer verminderten Migration und zu einer erhöhten Adhäsion der Zellen geführt. Somit konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass EphB4 die Metastasierungs-relevanten Eigenschaften dieser Zellen in vitro beeinträchtigt. Darüber hinaus deuteten Untersuchungen am A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell auf eine antitumorigene Wirkung des EphB4-Rezeptors in vivo hin. Aufgrund dessen muss der anfänglich formulierten Hypothese, dass EphB4 im Zusammenspiel mit seinem Liganden EphrinB2 die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms fördert, widersprochen werden. Eine regulative Beteiligung des Kinase-defizienten Rezeptors EphB6, der ebenfalls zur Bindung von EphrinB2 fähig ist, konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht sicher nachgewiesen werden. Allerdings ergeben sich aufgrund der Expression der Rezeptoren EphB4 und EphB6 sowie deren Ligand EphrinB2 sowohl auf den untersuchten Melanomzellen als auch auf den verschiedenen Tumor-assoziierten inflammatorischen Zellen interessante Interaktionsmöglichkeiten dieser Zellen. Deren Einfluss auf die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms sollte in weiterführenden Experimenten untersucht werden. Das im Rahmen der vorliegenden Arbeit etablierte A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell ermöglicht die In vivo-Charakterisierung von Radiotracer, die gegen Rezeptor-Tyrosinkinasen im Allgemeinen oder aber selektiv gegen EphB4 gerichtet sind. Da Verbindung [18F]2 eine ungünstige Pharmakokinetik zeigte, was wahrscheinlich auf die hohe Lipophilie des Radiotracers zurückzuführen ist, sollten sich zukünftige Untersuchungen mit der chemischen Modifikation dieser Verbindung beschäftigen, mit dem Ziel die Lipophilie und damit die biologische Halbwertszeit des Radiotracers zu verbessern. Zusätzlich sollte die Entwicklung von Radiotracern auf der Basis von löslichen Eph-Rezeptoren und Ephrinen (sEph bzw. sEphrin) weiter vorangetrieben werden.:1 EINLEITUNG 1.1 Die Bedeutung des Tumor-Mikromilieus bei der Entstehung des malignen Melanoms 1.2 Die Metastasierung des malignen Melanoms als limitierender Einflussfaktor auf die Tumortherapie 1.3 Die Rolle des Eph-Ephrin-Systems bei der Tumorprogression und Metastasierung 1.4 Zielstellung 2 MATERIAL UND METHODEN 2.1 Material 2.1.1 Eukaryotische Zellen 2.1.2 Prokaryotische Zellen 2.1.3 Versuchstiere 2.1.4 Plasmide 2.1.5 Kits 2.1.6 Antikörper 2.1.7 Verbrauchsmaterialien 2.1.8 Chemikalien, Medien und Enzyme 2.1.9 Puffer und Lösungen 2.1.10 Geräte 2.2 Molekularbiologische Methoden 2.2.1 RNA-Isolierung aus Zellen 2.2.2 DNase-Behandlung 2.2.3 Quantitative Echtzeit RT-PCR (qRT-PCR) 2.2.4 Klonierung von humanem EphB4, EphB6 und EphrinB2 in den eukaryotischen Expressionsvektor pIRES2-AcGFP1 2.2.4.1 Prinzip 2.2.4.2 Restriktionshydrolyse 2.2.4.3 Dephosphorylierung und Glättung der cDNA mittels Alkalischer Phosphatase und Klenow-Fragment 2.2.4.4 Agarose-Gelelektrophorese 2.2.4.5 Gelextraktion 2.2.4.6 Ligation 2.2.4.7 Herstellung Transformations-kompetenter E. coli 2.2.4.8 Transformation kompetenter E. coli 2.2.4.9 Plasmid-Isolierung 2.2.5 Klonierung von humanem sEphB4, sEphB6 und sEphrinB2 in den eukaryotischen Expressionsvektor pSecTag2B 2.2.5.1 Prinzip 2.2.5.2 PCR zur Gewinnung der cDNA für sEphrinB2, sEphB4 und sEphB6 2.2.5.3 Agarose-Gelelektrophorese und Gelextraktion 2.2.5.4 TOPO-TA-Klonierung, Transformation und Plasmid-Isolierung 2.2.5.5 Restriktionshydrolyse, Ligation, Transformation und Plasmid-Isolierung 2.3 Zellbiologische Methoden 2.3.1 Kultivierung eukaryotischer Zellen 2.3.2 Kontrolle von Zellkulturen auf Mykoplasmen-Kontamination 2.3.3 Kryokonservierung und Rekultivierung von Zellen 2.3.4 Transfektion und Antibiotikaselektion von COS-7-Zellen 2.3.5 Transfektion und Antibiotika-Selektion von A375-Zellen 2.3.6 Fluoreszenz-aktivierte Zellanalyse und -sortierung (FACS) von transfizierten A375-Zellen 2.3.7 Fluoreszenzmikroskopie von transfizierten A375-Zellen 2.3.8 Bestimmung der Zellproliferation und Zellvitalität mittels Wachstumskurve 2.3.9 Differenzierung humaner THP-1-Leukämiezellen zu Makrophagen-artigen Zellen (THP-1(M)) 2.3.10 Differenzierung humaner HL-60-Leukämiezellen zu Makrophagen-artigen (HL-60(M)) und Granulozyten-artigen (HL-60(G)) Zellen 2.3.11 Kokultivierung humaner Melanomzellen mit HL-60(M) und anschließende Trennung mittels Magnet-aktivierter Zell Separierung (MACS) 2.3.12 Adhäsionsassay 2.3.12.1 Adhäsion an Fibronektin 2.3.12.2 Adhäsion an HL-60(M)-Zellen 2.3.13 Migrationsassay 2.3.13.1 Boyden-Kammer-Assay 2.3.13.2 Wundheilungsassay 2.4 Proteinbiochemische Methoden 2.4.1 Proteinisolierung aus Zellkulturen 2.4.2 Proteinisolierung aus Gewebeproben 2.4.3 Proteinbestimmung 2.4.4 SDS-PAGE 2.4.5 Western Blotting und Immundetektion 2.4.6 Enzym-gekoppelter Immunadsorptionsassay (ELISA) 2.4.6.1 IL-6-ELISA 2.4.6.2 pEphB4-ELISA 2.4.7 Gewinnung und Reinigung der rekombinanten, löslichen Eph Rezeptoren sEphB4 und sEphB6 2.4.7.1 Gewinnung von COS-7-Zellkulturüberständen 2.4.7.2 Reinigung von sEphB4 und sEphB6 aus den COS-7-Zellkulturüberständen mittels Ni2+-Affinitätschromatographie 2.4.7.3 Regeneration der Ni2+-NTA-Agarose 2.4.7.4 Entfernung von Salzen und Imidazol mittels Schneller Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC) 2.4.7.5 Entfernung von Salzen und Imidazol mit Hilfe von Zentrifugalkonzentratoren 2.4.7.6 Gefriertrocknung 2.5 Tierexperimentelle Arbeiten 2.5.1 Etablierung eines murinen Tumor-Xenograft-Modells mit subkutanen A375-pIRES/EphB4-Tumoren 2.5.2 Fluoreszenz-Bildgebung 2.5.3 Magnet-Resonanz-Tomographie 2.5.4 Untersuchung der Tumorperfusion mittels Hoechst 33342 2.6 Radiochemische und Radiopharmakologische Methoden 2.6.1 Darstellung und Radiomarkierung von EphB4-Kinaseinhibitoren 2.6.2 Untersuchung des Einflusses der Verbindungen 2 auf die Zellproliferation und Zellvitalität mittels MTT-Test 2.6.3 Untersuchung der zellulären Bindung und Aufnahme der Verbindung [18F]2 2.6.4 Kleintier-Positronen-Emissions-Tomographie 2.6.5 Bioverteilung 2.6.6 Metabolitenanalyse 2.6.7 Autoradiographie 2.7 Histologische Methoden 2.7.1 Anfertigung von Gefrierschnitten 2.7.2 Nachweis von Hoechst 33342 in Gefrierschnitten 2.7.3 Anfertigung von Paraffinschnitten 2.7.4 Nachweis von EphB4 in Paraffinschnitten 2.8 Statistische Auswertung 3 ERGEBNISSE 3.1 Genexpression von EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei humanen Leukämie- und Melanomzellen 3.2 Proteinbiosynthese von EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei humanen Leukämie- und Melanomzellen 3.3 Kokultivierung humaner Melanomzellen mit HL-60(M) 3.3.1 Etablierung eines Kokultur-Modells mit anschließender Trennung der humanen Melanomzellen von den HL 60(M)-Zellen 3.3.2 Einfluss der Kokultur auf das Adhäsions- und Migrationsverhalten der humanen Melanomzellen 3.3.2.1 Adhäsionsassay 3.3.2.2 Migrationsassay 3.3.3 Einfluss der Kokultur auf die Sekretion von Interleukin-6 durch die humanen Leukämie- und Melanomzellen 3.4 Überexpression von EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei A375 Melanomzellen 3.4.1 Fluoreszenzmikroskopie und FACS 3.4.2 mRNA-Expression von EphB4, EphB6 und EphrinB2 3.4.3 Proteinbiosynthese von EphB4, EphB6 und EphrinB2 3.4.4 Proliferationsverhalten 3.5 Einfluss von EphB4, EphB6 und EphrinB2 auf das Adhäsions- und Migrationsverhalten von A375-Melanomzellen 3.5.1 Einfluss auf die Adhäsion 3.5.1.1 Adhäsion an Fibronektin 3.5.1.2 Adhäsion an HL-60(M)-Zellen 3.5.2 Einfluss auf die Migration 3.5.2.1 Boyden-Kammer-Assay 3.5.2.2 Wundheilungsassay 3.5.3 Einfluss der Kokultur mit HL-60(M)-Zellen auf das Adhäsions- und Migrationsverhalten der A375-Melanomzellen 3.6 Einfluss von EphB4, EphB6 und EphrinB2 auf das inflammatorische Potential von A375-Melanomzellen und HL 60(M)-Zellen 3.7 Charakterisierung eines murinen Tumor-Xenograft-Modells mit subkutanen A375-pIRES/EphB4-Tumoren 3.7.1 Charakterisierung des Tumorwachstums 3.7.2 Nachweis der EphB4-Proteinbiosynthese 3.7.3 Charakterisierung des Tumormetabolismus und der Tumorperfusion mit [18F]FDG 3.7.4 Charakterisierung der Tumorperfusion mit Hoechst 33342 3.7.5 Charakterisierung der CD31-Proteinbiosynthese 3.7.6 Charakterisierung hypoxischer Areale mit [18F]FMISO 3.8 Charakterisierung eines neuen, 18F-radiomarkierten EphB4-Kinaseinhibitors als Radiotracer zur Bildgebung von EphB4 mittels Kleintier-PET 3.8.1 Einfluss von Verbindung 2 auf die Zellproliferation und Zellvitalität 3.8.2 Einfluss von Verbindung 2 auf die EphB4-Phosphorylierung 3.8.3 Charakterisierung der Zellaufnahme von Verbindung [18F]2 3.8.4 Charakterisierung des In-vivo-Metabolismus von Verbindung [18F]2 im A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell 3.8.4.1 Kleintier-Positronen-Emissions-Tomographie 3.8.4.2 Autoradiographie 3.8.4.3 Bioverteilung 3.8.4.4 Metabolitenanalyse 3.9 Reinigung und Charakterisierung rekombinanter, löslicher Eph-Rezeptoren 3.9.1 Proteinbiosynthese und Sekretion von sEphB4 und sEphB6 3.9.2 Reinigung von rekombinantem sEphB4 und sEphB6 aus COS-7-Zellkulturüberständen 4 DISKUSSION 4.1 Therapiemöglichkeiten und Bedeutung von Tumor-assoziierten inflammatorischen Zellen beim malignen Melanom 4.2 Vorkommen von EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei humanen Melanomzellen und inflammatorischen Zellen 4.3 Einfluss der Kokultur von Melanomzellen mit HL-60(M) auf die metastatischen und inflammatorischen Eigenschaften der Zellen 4.4 Einfluss von EphB4 auf das Wachstum und die Vaskularisierung von A375-Tumoren in vivo 4.5 Kinaseinhibitoren als potentielle Radiotracer für die In vivo-Bildgebung von Eph-Rezeptoren 4.6 Entwicklung löslicher Eph-Rezeptoren und Ephrin-Liganden als Grundlage für die In vivo-Bildgebung des Eph-Ephrin-Systems 5 SCHLUSSFOLGERUNGEN UND AUSBLICK 6 ZUSAMMENFASSUNG 7 LITERATURVERZEICHNIS 8 DANKSAGUNG 9 VERÖFFENTLICHUNGEN UND KONFERENZBEITRÄGE

Die Eph-Familie, welche die Eph-Rezeptoren und die ephrin-Liganden umfasst, repräsentiert die größte Subgruppe der Rezeptortyrosinkinasen. Sowohl die Eph-Rezeptoren als auch die ephrin-Liganden sind Membran-assoziierte Proteine, deren Interaktion einen Typ der Zellkontakt-vermittelten Kommunikation darstellt und vielfältigste zelluläre Funktionen beeinflusst. Die aktuellen Eph/ephrin-bezogenen Forschungsschwerpunkte liegen vor allem im Bereich der Entwicklungs- und Tumorbiologie, wie z.B. dem Einfluss der Eph-Familie auf Angiogenese und Axonaussprossung. Die Rolle des Eph/ephrin-Systems in der Entwicklung der Atherosklerose und bei Reparaturmechanismen wie der Reendothelialisierung ist jedoch noch weitgehend unerforscht. Die vorliegende Arbeit befasst sich anhand von in vitro Experimenten mit HUVEC und HUAEC mit dem Einfluss des Liganden ephrin-A1 und des Rezeptors EphA2 auf die endotheliale Proliferation und Migration als elementare Mechanismen der Reendothelialisierung.:INHALTSVERZEICHNIS I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS V ABBILDUNGSVERZEICHNIS IX TABELLENVERZEICHNIS XI 1 EINLEITUNG 1 1.1 Die Rolle des Endothels in der Atherosklerose 1 1.2 Die Migration von Endothelzellen 6 1.3 Die Eph-Familie 9 1.4 Potentielle Funktionen der Eph-Familie in der endothelialen Proliferation und Migration 14 1.5 Zielstellung der Arbeit 16 2 MATERIAL 17 2.1 Geräte 17 2.2 Zellkulturmaterial 18 2.3 Verwendete Kulturmedien 18 2.4 Verwendete Zelllinien und E. coli Stämme 19 2.5 Verwendete Kit-Systeme 19 2.6 Verwendete Oligonukleotide 20 2.7 Verwendete Plasmide 21 2.8 Konstruierte Plasmide 23 2.9 Chemikalien 23 2.10 Puffer, Gele, Lösungen 23 3 METHODEN 24 3.1 Zellbiologische Methoden 24 3.2 Proteinbiochemische Methoden 28 3.3 Molekularbiologische und gentechnische Methoden 32 3.4 Scratch Assay 44 3.5 Beurteilung der Zellproliferation mittels BrdU-Inkorporation 44 3.6 Wundheilungsassay 45 3.7 Migrationsassay 48 3.8 Baculovirale Talin-RFP- und Aktin-GFP-Expression 49 3.9 Datenanalyse und statistische Auswertung 49 4 ERGEBNISSE 50 4.1 Molekularbiologische und proteinbiochemische Charakterisierung verschiedener Eph/ephrine in proliferierenden Endothelzellen 50 4.2 Molekularbiologische Charakterisierung von ephrin-A1, EphA2 und EphA4 unter Kontaktinhibition in HUVEC 56 4.3 Einfluss eines Zellzyklusarrests auf die Expression verschiedener ephrin-Liganden und Eph-Rezeptoren in Endothelzellen 58 4.4 Hemmung von ephrin-A1 und EphA2 mittels siRNA 63 4.5 Einfluss einer siRNA-vermittelten Hemmung von ephrin-A1 und EphA2 auf die Proliferation von HUVEC 65 4.6 Überexpression von ephrin-A1 mittels eines adenoviralen Vektors 67 4.7 Einfluss einer Überexpression von ephrin-A1 auf die Proliferation von HUVEC 68 4.8 Reinitiation von Proliferation und Migration in HUVEC mittels Scratch Assay 69 4.9 Einfluss der Modulation des ephrin-A1- sowie EphA2-Gehaltes auf das Wundheilungsverhalten von HUVEC 73 4.10 Charakterisierung des Migrationsverhaltens von HUVEC unter veränderter ephrin-A1-Expression mittels live cell imaging 75 4.11 Einfluss einer veränderten ephrin-A1-Expression auf den EphA2-Phosphorylierungsstatus 78 4.12 Grenzzonenverhalten von HUVEC an ephrin-A1-beschichteten Oberflächen 80 4.13 Fluoreszenzmikroskopische Charakterisierung fokaler Adhäsionen und des Aktin-Zytoskelettes unter modulierter ephrin A1 Expression 81 5 DISKUSSION 84 5.1 Die Eph-Familie im Kontext der Reendothelialisierung 84 5.2 Einfluss des Eph/ephrin Systems auf das Proliferationsverhalten von Zellen 86 5.3 Auswirkungen einer ephrin-A1-EphA2-Wechselwirkung auf die Proliferation 90 5.4 Einfluss der Eph-Familie auf die zelluläre Migration und Wundheilung 93 5.5 Zusammenfassende Betrachtung und Ausblick 106 6 ZUSAMMENFASSUNG 109 6.1 In deutscher Sprache 109 6.2 In englischer Sprache 111 7 LITERATURVERZEICHNIS 113 8 DANKSAGUNG 133 9 ANHANG 134 10 ERKLÄRUNGEN 138 10.1 Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 138 10.2 Erklärung über die Einhaltung der aktuellen gesetzlichen Vorgaben im Rahmen der Dissertation 140 / The Eph-family represents the largest subgroup of tyrosine kinase receptors. Both the Eph-receptors and the ephrin-ligands are membrane-associated proteins whose interaction is a way of contact-dependent communication that influences a wide variety of cellular functions. In scientific research the Eph-family is known for its impact on developmental and tumour-biology, whereas the role of Eph-receptors and ephrin-ligands in atherosclerosis and repair mechanisms is still not well understood. The aim of the present study was to examine the influence of the ligand ephrin-A1 and its interaction with its receptor EphA2 on endothelial proliferation and migration by performing cellcultural experimentation using HUVEC and HUAEC.:INHALTSVERZEICHNIS I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS V ABBILDUNGSVERZEICHNIS IX TABELLENVERZEICHNIS XI 1 EINLEITUNG 1 1.1 Die Rolle des Endothels in der Atherosklerose 1 1.2 Die Migration von Endothelzellen 6 1.3 Die Eph-Familie 9 1.4 Potentielle Funktionen der Eph-Familie in der endothelialen Proliferation und Migration 14 1.5 Zielstellung der Arbeit 16 2 MATERIAL 17 2.1 Geräte 17 2.2 Zellkulturmaterial 18 2.3 Verwendete Kulturmedien 18 2.4 Verwendete Zelllinien und E. coli Stämme 19 2.5 Verwendete Kit-Systeme 19 2.6 Verwendete Oligonukleotide 20 2.7 Verwendete Plasmide 21 2.8 Konstruierte Plasmide 23 2.9 Chemikalien 23 2.10 Puffer, Gele, Lösungen 23 3 METHODEN 24 3.1 Zellbiologische Methoden 24 3.2 Proteinbiochemische Methoden 28 3.3 Molekularbiologische und gentechnische Methoden 32 3.4 Scratch Assay 44 3.5 Beurteilung der Zellproliferation mittels BrdU-Inkorporation 44 3.6 Wundheilungsassay 45 3.7 Migrationsassay 48 3.8 Baculovirale Talin-RFP- und Aktin-GFP-Expression 49 3.9 Datenanalyse und statistische Auswertung 49 4 ERGEBNISSE 50 4.1 Molekularbiologische und proteinbiochemische Charakterisierung verschiedener Eph/ephrine in proliferierenden Endothelzellen 50 4.2 Molekularbiologische Charakterisierung von ephrin-A1, EphA2 und EphA4 unter Kontaktinhibition in HUVEC 56 4.3 Einfluss eines Zellzyklusarrests auf die Expression verschiedener ephrin-Liganden und Eph-Rezeptoren in Endothelzellen 58 4.4 Hemmung von ephrin-A1 und EphA2 mittels siRNA 63 4.5 Einfluss einer siRNA-vermittelten Hemmung von ephrin-A1 und EphA2 auf die Proliferation von HUVEC 65 4.6 Überexpression von ephrin-A1 mittels eines adenoviralen Vektors 67 4.7 Einfluss einer Überexpression von ephrin-A1 auf die Proliferation von HUVEC 68 4.8 Reinitiation von Proliferation und Migration in HUVEC mittels Scratch Assay 69 4.9 Einfluss der Modulation des ephrin-A1- sowie EphA2-Gehaltes auf das Wundheilungsverhalten von HUVEC 73 4.10 Charakterisierung des Migrationsverhaltens von HUVEC unter veränderter ephrin-A1-Expression mittels live cell imaging 75 4.11 Einfluss einer veränderten ephrin-A1-Expression auf den EphA2-Phosphorylierungsstatus 78 4.12 Grenzzonenverhalten von HUVEC an ephrin-A1-beschichteten Oberflächen 80 4.13 Fluoreszenzmikroskopische Charakterisierung fokaler Adhäsionen und des Aktin-Zytoskelettes unter modulierter ephrin A1 Expression 81 5 DISKUSSION 84 5.1 Die Eph-Familie im Kontext der Reendothelialisierung 84 5.2 Einfluss des Eph/ephrin Systems auf das Proliferationsverhalten von Zellen 86 5.3 Auswirkungen einer ephrin-A1-EphA2-Wechselwirkung auf die Proliferation 90 5.4 Einfluss der Eph-Familie auf die zelluläre Migration und Wundheilung 93 5.5 Zusammenfassende Betrachtung und Ausblick 106 6 ZUSAMMENFASSUNG 109 6.1 In deutscher Sprache 109 6.2 In englischer Sprache 111 7 LITERATURVERZEICHNIS 113 8 DANKSAGUNG 133 9 ANHANG 134 10 ERKLÄRUNGEN 138 10.1 Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 138 10.2 Erklärung über die Einhaltung der aktuellen gesetzlichen Vorgaben im Rahmen der Dissertation 140

Actually, there is a strong incidence of psychiatric diseases, representing a 13% of total burden diseases and 450 million of people affected. The etiology of psychiatric diseases remains unknown. However, scientific evidences suggest a maldevelopment of nervous system (NS). The diagnosis is inaccurate, and international manuals (ICD-10 and DSM-IV) identify pathologies according to a list of symptoms but no underlying biological cause of disease. The aim of the thesis is to identify potential biomarkers -related to the development of NS- in peripheral blood of psychiatric patients diagnosed as different mental diseases, such as autism spectrum disorders (ASD), schizophrenia and bipolar disorders. It is intended to contribute with the improvement of diagnostic, prognostic and treatment of subjects. The thesis is divided into 4 chapters: 1) study of neurotrophins in ASD, where the results show the relationship of this family of molecules with the disease, 2) study of Latrophilin-3 (LPHN3) in the TEA, which was obtained in association with lower cognitive level of ASD, 3) study of the Eph-receptor A4 in the pathology of schizophrenia and bipolar disorder, results of which show no association, and finally 4) study of Ankyrin-3 (ANK3) in schizophrenia and bipolar disorder, which shown a relationship with bipolar disorder but not with schizophrenia. / Actualment, hi ha una forta incidència de les patologies psiquiàtriques, representant un 13% del total de les malalties i 450 milions de persones afectades. L’etiologia de les patologies psiquiàtriques és desconeguda. Tot i així, evidències científiques suggereixen un mal desenvolupament del sistema nerviós (SN). El diagnòstic és poc precís, i els manuals internacionals (ICD-10 i DSM-IV) identifiquen les patologies d’acord a un llistat de símptomes, però sense cap causa biològica subjacent de la patologia. L’objectiu de la tesi és la identificació de biomarcadors potencials –relacionats en el desenvolupament del SN- en sang perifèrica de pacients diagnosticats amb diferents patologies mentals, com ara els trastorns de l’espectre autista (TEA), esquizofrènia i desordres bipolars. És pretén contribuir amb la millora del diagnòstic, el pronòstic i el tractament de les persones que les pateixen. La tesi s’estructura en 4 capítols: 1) estudi de les neurotrofines en els TEA, on els resultats evidencien la relació d’aquesta família de molècules amb la patologia, 2) estudi de la Latrofilina-3 (LPHN3) en els TEA, on s’ha obtingut associació amb el nivell cognitiu més baix dels TEA, 3) estudi del receptor EPH A4 en les patologies d’esquizofrènia i desordres bipolars, resultats del qual no mostren associació i, per últim 4) estudi de la Ankirina-3 (ANK3) en l’esquizofrènia i els desordres bipolars, en el qual si que es troba una relació amb els desordres bipolars, però no amb l’esquizofrènia. / Actualmente, hay una fuerte incidencia de las patologías psiquiátricas, representando un 13% del total de las enfermedades y 450 millones de personas afectadas. La etiología de las patologías psiquiátricas es desconocida. Aún así, evidencias científicas sugieren un mal desarrollo del sistema nervioso (NS). El diagnóstico es poco preciso, y los manuales internacionales (ICD-10 y DSM-IV) identifican las patologías de acuerdo a un listado de síntomas, pero sin ninguna causa biológica subyacente de la patología. El objetivo de la tesis es la identificación de biomarcadores potenciales –relacionados con el desarrollo del SN- en sangre periférica de pacientes diagnosticados con diferentes patologías mentales, como son los trastornos del espectro autista (TEA), esquizofrenia y desordenes bipolares. Se pretende contribuir en la mejora del diagnóstico, el pronóstico i el tratamiento de las personas que las padecen. La tesis se estructura en 4 capítulos: 1) estudio de las neurotrofinas en los trastornos del espectro autista (TEA), en el cual los resultados evidencian la relación de esta familia de moléculas con la patología, 2) estudio de la Latrofilina-3 (LPHN3) en los TEA, donde se ha obtenido una asociación con el nivel cognitivo más bajo de los TEA, 3) estudio del receptor EPH A4 en las patologías de la esquizofrenia y los desordenes bipolares, resultados del cual no muestran asociación y, por último 4) estudio de la Ankirina-3 (ANK3) en la esquizofrenia y los desordenes bipolares, en el cual si que se ha encontrado una relación con los desordenes bipolares, pero no con la esquizofrenia.

The Caenorhabditis elegans Eph RTK, VAB-1, has known roles in neuronal and epidermal morphogenesis as well as oocyte maturation through interaction with its ephrin ligands. In humans, Eph receptors are involved in nervous and vascular system development and have been implicated in cancer formation and progression. DAF-18, a C. elegans ortholog of the human tumour suppressor gene, PTEN, has been identified as an interacting partner with the Eph RTK, VAB-1. Mutations in human PTEN have been associated with numerous cancers and in the worm, DAF-18 is a well studied member of the DAF-2/Insulin receptor-like signaling pathway which has roles in dauer formation, thermotolerance and adult longevity. Our lab has previously shown that VAB-1/EphR binds DAF-18. To further investigate the significance of this interaction as well as offer additional function to the proteins involved, I have shown that VAB-1/EphR is a negative regulator of DAF-18/PTEN at the protein level. Western blotting reveals that endogenous expression of DAF-18/PTEN is low in wild-type animals and expression is increased in a vab-1/ephR mutant. Additionally, VAB-1/EphR and DAF-18/PTEN are expressed in head neurons, oocytes and the germline precursor cells, Z2/Z3. vab-1/ephR mutants show increases longevity and sensitivity to dauer conditions which is consistent with increased DAF-18/PTEN activity. Lastly, daf-18(ok480) is able to suppress the oocyte maturation phenotype and increased MAPK expression displayed by vab-1(dx31) animals, providing genetic evidence of an interaction. By identifying the tissues where these proteins are co-expressed and substantiating the interaction with multiple analyses, novel roles may be proposed for each: VAB-1/EphR in DAF-2/Insulin signaling and DAF-18/PTEN in oocyte maturation downstream of VAB-1/EphR signaling. This work provides further understanding of how an organism coordinates complex developmental processes and reiterates the notion that cellular signaling is a complex network of interacting players. As many signaling pathways are evolutionarily conserved, my research in C. elegans may provide a mechanism on how Eph RTKs and PTEN are regulated in more complex organisms, including humans. / Thesis (Master, Biology) -- Queen's University, 2009-02-27 17:09:10.582

The generation of a functional nervous system requires that neuronal cells and axons navigate precisely to their appropriate targets. The Eph Receptor Tyrosine Kinases (RTKs) and their ephrin ligands have emerged as one of the important guidance cues for neuronal and axon navigation. However, the molecular mechanisms of how Eph RTKs regulate these processes are still incomplete. The purpose of this work was to contribute to the understanding of how Eph receptors regulate axon guidance by identifying and characterizing components of the Caenorhabditis elegans Eph RTK (VAB-1) signaling pathway. To achieve this objective I utilized a hyper active form of the VAB-1 Eph RTK (MYR-VAB-1) that caused penetrant axon guidance defects in the PLM mechanosensory neurons, and screened for suppressors of the MYR-VAB-1 phenotype. Through a candidate gene approach, I identified the adaptor NCK-1 as a downstream effector of VAB-1. Molecular and genetic analysis revealed that the nck-1 gene encodes for two isoforms (NCK-1A and NCK-1B) that share similar expression patterns in parts of the nervous system, but also have independent expression patterns in other tissues. Genetic rescue experiments showed that both NCK-1 isoforms can function in axon guidance, but each isoform also has specific functions. In vitro binding assays showed that NCK-1 binds to VAB-1 in a kinase dependent manner. In addition to NCK-1, WSP-1/N-WASP was also identified as an effector of VAB-1 signaling. Phenotypic analysis showed that nck-1 and wsp-1 mutants had PLM axon over extension defects similar to vab-1 animals. Furthermore, VAB-1, NCK-1 and WSP-1 formed a complex in vitro. Intriguingly, protein binding assays showed that NCK-1 can also bind to the actin regulator UNC-34/Ena, but genetic experiments suggest that unc-34 is an inhibitor of nck-1 function. Through various genetic and biochemical experiments, I provide evidence that VAB-1 can disrupt the NCK-1/UNC-34 complex, and negatively regulate UNC-34. Taken together, my work provides a model of how VAB-1 RTK signaling can inhibit axon extension. I propose that activated VAB-1 can prevent axon extension by inhibiting growth cone filopodia formation. This is accomplished by inhibiting UNC-34/Ena activity, and simultaneously activating Arp2/3 through a VAB-1/NCK-1/WSP-1 complex. / Thesis (Ph.D, Biology) -- Queen's University, 2011-07-28 16:20:31.957

La medición de la desigualdad ha ocupado un papel fundamental en los estudios empíricos de las últimas décadas. Numerosos trabajos muestran la creciente desigualdad tanto a nivel mundial como en Argentina a partir de la década del 70. Hacia mediados de los 2000, autores como Atkinson miden la desigualdad del ingreso a partir de datos impositivos. La motivación de estos estudios, parten de la premisa que las encuestas de hogares generalmente no son representativas de los altos niveles de ingresos, donde por errores de muestreo pueden jugar un papel importante a la hora de realizar estimaciones. El presente trabajo consiste en medir la desigualdad de la distribución personal del ingreso utilizando datos impositivos de 1999-2007. Si bien se utilizan estadísticas del impuesto a las ganancias, estos datos complementan los usualmente utilizados de las Encuestas Permanente de Hogares.