Biocatalysis is an ever evolving field that uses enzymes or microorganisms for chemical synthesis. By utilizing enzymes that generally have evolved for specific reactions under mild conditions and temperatures, biocatalysis can be a more environmentally friendly option compared to traditional chemistry. Amide-type chemistries are important and bond formation avoiding poor atom economy is of high priority in organic chemistry. Biocatalysis could potentially be a solution but restricted substrate scope is a limitation. Esterases/lipases usually display broad substrate scope and catalytic promiscuity but are poor at hydrolyzing amides compared to amidases/proteases. The difference between the two enzyme classes is hypothesized to reside in one key hydrogen bond present in amidases, which facilitates the transition state for nitrogen inversion during catalysis. In this thesis the work has been focused on introducing a stabilizing hydrogen bond acceptor in esterases, mimicking that found in amidases, to develop better enzymatic catalysts for amide-based chemistries. By two strategies, side-chain or water interaction, variants were created in three esterases that displayed up to 210-times increased relative amidase specificity compared to the wild type. The best variant displayed reduced activation enthalpy corresponding to a weak hydrogen bond. The results show an estimated lower limit on how much the hydrogen bond can be worth to catalysis. MsAcT catalyze kinetically controlled N-acylations in water. An enzymatic one-pot one-step cascade was developed for the formation of amides from aldehydes in water that gave 97% conversion. In addition, engineered variants of MsAcT with increased substrate scope could synthesize an amide in water with 81% conversion, where the wild type gave no conversion. Moreover, variants of MsAcT displayed up to 32-fold change in specificity towards amide synthesis and a switch in reaction preference favoring amide over ester synthesis. / <p>QC 20161125</p>

Orientador: Hermione Elly Melara de Campos Bicudo / Banca: Lílian Castiglioni / Banca: Marcelo Ferreira Lourenço / Banca: Eduardo Alves de Almeida / Banca: Lilian Madi Ravazzi / Resumo: Os padrões de esterases de 19 linhagens de 10 espécies do grupo saltans foram analisados usando eletroforese em gel de poliacrilamida e α e β-naftil acetatos como substratos. Cinqüenta e uma bandas esterásicas foram detectadas e classificadas como 31 α-esterases, 18 β-esterases e duas α/β-esterases. Com base nos padrões de inibição usando Malathion e sulfato de eserina, 34 bandas foram classificadas como carboxilesterases, 14 como acetilesterases e três como colinesterases. Dez loci gênicos foram tentativamente estabelecidos com base nos dados de posição da banda no gel, preferência ao substrato e padrões de inibição. Vinte bandas foram espécie-específicas, as restantes foram compartilhadas por espécie de um mesmo ou diferentes subgrupos. Sete bandas α-esterásicas foram observadas exclusivamente em machos. Bandas com diferentes freqüências ou grau de expressão entre os sexos também foram detectadas. Nos géis preparados para análise da expressão dos genes nas partes do corpo (cabeça, tórax e abdome), o grau de expressão das β- esterases foi alto no tórax, enquanto as α-esterases expressaram-se predominantemente no abdome e tórax. Uma visão global dos dados, atualmente disponíveis, quanto às esterases das espécies do grupo saltans é apresentada neste trabalho. As hipóteses filogenéticas geradas à partir dos dados deste estudo foram comparadas com filogenias anteriores baseadas na morfologia, bioquímica e características moleculares. / Abstract: The esterase patterns of 19 strains from 10 species in the saltans group were analyzed using polyacrylamide gel electrophoresis and α- and β-naphthyl acetates as substrates. Fifty-one esterase bands were detected and classified as 31 α-esterases, 18 β-esterases and two α/β- esterases. On the basis of the inhibition patterns using Malathion and eserine sulfate, 34 bands were classified as carboxylesterases, 14 as acethylesterases and three as cholinesterases. Ten gene loci were tentatively established on the basis of data on band position in the gel, substrate preference and inhibition pattern. Twenty bands were species-specific, the remaining being shared by species from the same or different subgroups. Seven α-esterase bands were observed exclusively in males. Bands with a different frequency or degree of expression between sexes were also detected. In the gels prepared for analysis of gene expression in the body parts (head, thorax and abdomen), the degree of expression of the β- esterases was higher in the thorax, while the α-esterases were expressed predominantly in the abdomen and thorax. A global view of the data available at present on the esterases of species from the saltans group is presented. Phylogenetic hypotheses generated from data in this study are compared with prior phylogenies based on morphological, biochemical and molecular characteristics. / Doutor

Seis isolados esporulantes (H-22, H0, H-1, H0 82/1, HOCB, HOC) e quatro não esporulantes (H0 889/3, IAC HO, HOP1, H-23) de Helminthosporium oryzae (Cochliobulus miyabeanus), agente causal da mancha parda em arroz foram comparados a nível nutricional fontes de carbono: L-sorbose, D-frutose, L-arabinose, sacarose, D-maltose e amido, fontes de nitrogênio: neopeptona, caseína, L-asparagina, cloreto de amônio, sulfato de amônio e ureia; e uma mistura de aminoácidos) e a nível isoenzimático (esterases). De maneira geral, observou-se que os isolados não esporulantes exibiram maior velocidade de crescimento que os esporulantes na maioria dos meios de cultivo. Os carboidratos, com exceção da L(-) sorbose, permitiram excelente crescimento micelial, enquanto que todos os isolados de H.oryzae foram capazes de metabolizar as diferentes fontes de nitrogênio orgânico e inorgânico testadas, mas sulfato de amônio e cloreto de amônio mostraram-se como fontes inadequadas de nitrogênio, proporcionando menor crescimento. As fontes de carbono e nitrogênio influenciaram de maneira variada a esporulação dos isolados, sendo que não foi possível apontar a melhor delas para a produção de conídios. No caso dos isolados não esporulantes, estes mantiveram tal condição frente às diferentes fontes nutricionais. As comparações dos perfis isoenzimáticos de esterases permitiram visualizar diferenças entre os isolados, onde os não esporulantes exibiram uma maior variabilidade no número de bandas e posição no gel de poliacrilamida, enquanto que os esporulantes apresentaram um padrão mais homogêneo. Assim, os isolados de Helminthosporium oryzae não foram diferenciados através das comparações auxanográficas estudadas, o que foi possível através do padrão isoenzimático de esterases. / not available

La ghréline est un peptide de 28 acides aminés, produit principalement par l’estomac et caractérisé par la présence d’un groupement octanoyl sur la sérine en position 3 (Kojima et al. 1999). La ghréline stimule la libération de l’hormone de croissance (GH) et régule la prise alimentaire et le métabolisme énergétique (Gualillo et al. 2003). Ces activités biologiques sont principalement médiées par le « growth hormone secretagogue receptor » (GHS-R). Deux sous-types de GHS-R, produits par épissage alternatif d’un même gène, ont été clonés : le GHS-R 1a, dont l’activation entraîne une libération de calcium via la formation d’inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3), et le GHS-R 1b, qui ne semble pas lié à une activité biologique (Howard et al. 1996). La première partie de mon travail de thèse consistait en l’étude de la dégradation de la ghréline. La ghréline circule dans le sang principalement sous forme de des-acyl ghréline, une forme de ghréline dépourvue du groupement octanoyl qui ne se lie pas au GHS-R 1a. Peu d’études ont été réalisées sur le catabolisme de la ghréline. Les enzymes impliquées dans la dégradation de la ghréline étant des régulateurs importants de son activité biologique, le but de cette étude était d’identifier les sites de clivage et les enzymes impliquées dans la dégradation de la ghréline par du sérum, des sous-fractions plasmatiques et des homogénats de tissus. Nous avons montré qu’au contact de sérum humain et de rat, la ghréline est désoctanoylée, sans protéolyse. Dans le sérum humain, nous avons montré que la butyrylcholinestérase et la « platelet-activating factor acetylhydrolase » (PAF-AH), une phospholipase associée aux lipoprotéines de basse densité (LDL), sont impliquées dans ce phénomène (articles n°1 et n°2). En parallèle, nous avons montré que la ghréline peut être transportée dans la circulation sanguine par les lipoprotéines riches en triglycérides (TRL), les LDL, et les lipoprotéines de haute et de très haute densité (HDL et VHDL) (article n°2). Dans le sérum de rat, la désoctanoylation de la ghréline implique une carboxylestérase (article n°1). Au contact d’homogénats de tissus, la ghréline est dégradée à la fois par désoctanoylation et protéolyse N-terminale, suggérant la participation d’estérases et d’aminopeptidases. Nous avons identifié cinq sites de clivage dans la ghréline : entre les résidus Ser2-(acyl)Ser3 (dans l’estomac et le foie), (acyl ?)Ser3-Phe4 (dans l’estomac, le foie et le rein), Phe4-Leu5 (dans l’estomac et le rein), Leu5-Ser6 et Pro7-Glu8 (dans le rein) (article n°1). La deuxième partie de mon travail de thèse consistait à étudier l’expression et la production de ghréline par différentes lignées leucémiques (HEL, HL-60, THP-1, SupT1), par des leucocytes poly- et mononucléés et par des plaquettes sanguines, et à étudier l’effet de la ghréline sur la prolifération cellulaire. Pour cela, nous avons mis au point des dosages radioimmunologiques (RIA) permettant de quantifier et de distinguer les formes octanoylées et non octanoylées de la ghréline, et nous avons caractérisé en détail les anticorps SB801 et SB969 obtenus. Par HPLC en phase inverse suivie des RIAs, nous avons mis en évidence la présence de ghrélines octanoylée et non octanoylée dans chaque population de cellules. Plus de 80 % de la ghréline produite est octanoylée dans les cellules HEL, les leucocytes et les plaquettes. Nous avons montré que la ghréline endogène stimule la prolifération des cellules HEL de façon autocrine impliquant un récepteur encore non identifié, distinct du GHS-R 1a (article n°3). La ghréline et la des-acyl ghréline inhibent la prolifération des leucocytes mononucléés mais sont dépourvues d’effet sur les cellules HL-60, THP-1 et SupT1. Malgré la présence du GHS-R 1a dans les leucocytes mononucléés, cet effet pourrait être médié par un récepteur différent puisque la des-acyl ghréline exerce le même effet que la ghréline sur la prolifération (article n°4).

Highly infectious pathogenic strains of bacteria are becoming increasingly resistant to the current clinical antibiotics which have created a dire need for the development of novel antibiotics. O-Acetylpeptidoglycan esterase 1 (Ape1) is a periplasmic esterase present in several peptidoglycan (PG) O-acetylating pathogenic species of Gram-positive and all Gram-negative bacteria that perform this modification to this essential cell wall polymer. Inhibition of this growth-limiting enzyme may prove the principle that Ape1 has the potential to be the target for the development of a novel class of antibiotics. Ape1 plays a crucial role in bacterial growth by regulating PG turnover through catalytic removal of the C-6 acetyl group from O-acetylPG. This activity is required for the continued metabolism of PG because the major autolytic enzymes involved, the lytic transglycosylases, require a free C-6 hydroxyl group to produce their reaction product, 1,6-anhydromuramic acid. Several of the compounds that have been identified to effectively inhibit Ape1, were re-evaluated by determining their kinetic parameters. Work presented in this thesis explored the inhibitory potential of these compounds, belonging to the anthraquinone (alizarin, quinizarin, quinalizarin, emodin, sennoside A) or tannin (ellagic acid) families of compounds, both in vitro and in vivo, among species of bacteria that are known to O-acetylate their PG. Of the inhibitory compounds tested, ellagic acid was found to be most effective in vitro, with an IC50 value of 0.91 µM ± 0.06, Ki 1.18 ± 0.04 and in vivo it was shown to reduce bacterial growth.

Thesis (Ph. D)--Rijksuniversiteit te Utrecht, 1983. / Summary in Dutch. Stellingen inserted. Includes bibliographical references.

Thesis (Ph. D.)--Virginia Commonwealth University, 2009. / Prepared for: Dept. of Biochemistry. Title from title-page of electronic thesis. Bibliography: leaves 153-187.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-04-26Bitstream added on 2014-06-13T20:03:27Z : No. of bitstreams: 1 bernardo_aa_dr_sjrp.pdf: 946735 bytes, checksum: 8ca5645baf7f63ca8f1850d734030e34 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os padrões de esterases de 19 linhagens de 10 espécies do grupo saltans foram analisados usando eletroforese em gel de poliacrilamida e α e β-naftil acetatos como substratos. Cinqüenta e uma bandas esterásicas foram detectadas e classificadas como 31 α-esterases, 18 β-esterases e duas α/β-esterases. Com base nos padrões de inibição usando Malathion e sulfato de eserina, 34 bandas foram classificadas como carboxilesterases, 14 como acetilesterases e três como colinesterases. Dez loci gênicos foram tentativamente estabelecidos com base nos dados de posição da banda no gel, preferência ao substrato e padrões de inibição. Vinte bandas foram espécie-específicas, as restantes foram compartilhadas por espécie de um mesmo ou diferentes subgrupos. Sete bandas α-esterásicas foram observadas exclusivamente em machos. Bandas com diferentes freqüências ou grau de expressão entre os sexos também foram detectadas. Nos géis preparados para análise da expressão dos genes nas partes do corpo (cabeça, tórax e abdome), o grau de expressão das β- esterases foi alto no tórax, enquanto as α-esterases expressaram-se predominantemente no abdome e tórax. Uma visão global dos dados, atualmente disponíveis, quanto às esterases das espécies do grupo saltans é apresentada neste trabalho. As hipóteses filogenéticas geradas à partir dos dados deste estudo foram comparadas com filogenias anteriores baseadas na morfologia, bioquímica e características moleculares. / The esterase patterns of 19 strains from 10 species in the saltans group were analyzed using polyacrylamide gel electrophoresis and α- and β-naphthyl acetates as substrates. Fifty-one esterase bands were detected and classified as 31 α-esterases, 18 β-esterases and two α/β- esterases. On the basis of the inhibition patterns using Malathion and eserine sulfate, 34 bands were classified as carboxylesterases, 14 as acethylesterases and three as cholinesterases. Ten gene loci were tentatively established on the basis of data on band position in the gel, substrate preference and inhibition pattern. Twenty bands were species-specific, the remaining being shared by species from the same or different subgroups. Seven α-esterase bands were observed exclusively in males. Bands with a different frequency or degree of expression between sexes were also detected. In the gels prepared for analysis of gene expression in the body parts (head, thorax and abdomen), the degree of expression of the β- esterases was higher in the thorax, while the α-esterases were expressed predominantly in the abdomen and thorax. A global view of the data available at present on the esterases of species from the saltans group is presented. Phylogenetic hypotheses generated from data in this study are compared with prior phylogenies based on morphological, biochemical and molecular characteristics.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-03-02Bitstream added on 2014-06-13T20:07:10Z : No. of bitstreams: 1 emerick_gl_dr_arafcf.pdf: 6421431 bytes, checksum: 0afb014cdc72c52072c05813f940629d (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Clinicamente, os sintomas da intoxicação por organofosforados (OPs) são divididos em quatro categorias: síndrome colinérgica, síndrome intermediária, transtornos neuropsiquiátricos crônicos induzidos por OPs e neuropatia retardada induzida por OPs (NRIOP). Há estudos que comprovam a ocorrência de casos de NRIOP em seres humanos após intoxicação por metamidofós, porém existe grande dificuldade de estudar esta neuropatia no modelo experimental (galinha), devido à forte crise colinérgica que ocorre após a inibição da acetilcolinesterase (AChE). Uma possível explicação para tal diferença de efeito entre a espécie humana e a galinha é o fato de que os OPs possuem centros assimétricos e, assim sendo, se apresentam sob formas enantioméricas que podem apresentar diferenças de inibição da AChE e da esterase susceptível à neuropatia (ESNp). Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar, em sangue de galinhas e de seres humanos, em cérebro de galinhas (in vitro e in vivo) e em células da linhagem SH-SY5Y de neuroblastoma humano, a neurotoxicidade de formas enantioméricas de compostos organofosforados utilizados como praguicidas, tendo o metamidofós como protótipo e utilizando a AChE, butirilcolinesterase (BChE), ESNp e a calpaína como biomarcadores. Inicialmente, foi feita a separação dos enantiômeros do metamidofós utilizando a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com emprego de fases estacionárias quirais de polissacarídeos, onde se obteve resolução de até 1,56 para os enantiômeros avaliados. A forma (+)-metamidofós apresentou maior toxicidade in vitro para a BChE em galinhas e para ESNp... / Clinically, the symptoms of organophosphorus (OP) poisoning are divided into four categories: acute cholinergic syndrome, intermediate syndrome, chronic organophosphorus-induced neuropsychiatric disorders (COPIND) and organophosphorus-induced delayed neuropathy (OPIDN). There are studies that prove the occurrence of OPIDN in humans after methamidophos poisoning, but there is great difficulty in studying this neuropathy in the experimental model (hen), due to strong cholinergic crisis that occurs after inhibition of acetylcholinesterase (AChE). One possible explanation for this difference in effect between humans and hens is the fact that the OPs have asymmetric centers and therefore, are presented as enantiomeric forms that may exhibit differences in inhibition of AChE and neuropathy target esterase (NTE). Thus, the objective of this study was to evaluate, in the blood of hens and humans, in the brains of chickens (in vitro and in vivo) and in the SH-SY5Y human neuroblastoma cells, the neurotoxicity of enantiomeric forms of OPs used as pesticides, having methamidophos as the prototype and using AChE, butyrylcholinesterase (BChE), NTE and calpain as biomarkers. Initially, the complete separation of the methamidophos enantiomers was obtained applying the technique of high performance liquid chromatography (HPLC) and using polysaccharide chiral stationary phases. A maximum resolution of 1.56 was gotten for the enantiomers evaluated. The form (+)-methamidophos presented higher in vitro toxicity than that of the (-)-methamidophos for BChE of hens and NTE of hens and humans... (Complete abstract click electronic access below)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Tecnologias Química e Biológica, 2018. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-10T20:31:43Z No. of bitstreams: 1 2018_DanielDavidNoriegaVásquez.pdf: 3129944 bytes, checksum: 6cdc13424d333feff42c269e22257479 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-14T18:54:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_DanielDavidNoriegaVásquez.pdf: 3129944 bytes, checksum: 6cdc13424d333feff42c269e22257479 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-14T18:54:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_DanielDavidNoriegaVásquez.pdf: 3129944 bytes, checksum: 6cdc13424d333feff42c269e22257479 (MD5) Previous issue date: 2018-07-10 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / A cana-de-açúcar é uma das culturas mais importantes no Brasil para a produção tanto de açúcar quanto de etanol de segunda geração. Os ataques dos insetos-praga, broca-da-cana (Diatraea Saccharalis, Fabricius 1770) e broca-gigante da cana (Telchin licus licus, Drury 1770), reduzem a produtividade nas lavouras gerando perdas de milhões de dólares por ano para a indústria canavieira no país. Os métodos de controle utilizados atualmente têm se mostrado insuficientes para evitar os prejuízos produzidos por essas pragas. A ferramenta de RNA interferente (RNAi) considera-se promissora para o controle de insetos-praga, isto, mediante a utilização de moléculas de RNA dupla fita (dsRNA) para silenciar genes essenciais para a sobrevivência do inseto. No presente trabalho, foi determinado o transcritoma das pragas da cana-de-açúcar mencionadas, visando a identificação de genes potenciais para silenciamento e validação de moléculas de dsRNA para o controle desses insetos. A partir do sequenciamento (RNA-seq) e análise in silico do transcritoma do intestino médio de larvas tratadas com diferentes dietas (cana-de-açúcar e dieta artificial), foram gerados bancos de dados com um total de 49.225 e 53.108 contigs dentre os quais 1.872 e 2.465 foram diferencialmente expressos (EdgeR), para D. saccharalis e T. l. licus, respectivamente. A análise de enriquecimento por ontologia genica (GO) permitiu a identificação de genes que estão envolvidos, principalmente, com as vias de detoxificação, de transporte de moléculas, de digestão e de regulação hormonal. Para validação das moléculas de dsRNA, foram selecionadas as sequências dos genes que codificam a esterase do hormônio juvenil (JHE). Essa enzima regula os processos de muda e metamorfose do inseto por meio da degradação controlada do hormônio juvenil. O silenciamento do gene jhe utilizando uma concentração de dsRNA de 10μg/cm3 de dieta não apresentou mortalidade em larvas de D. saccharalis, mas apresentou mortalidade de até 60% em larvas de penúltimo ínstar de broca-gigante. O presente estudo é de grande relevância, uma vez que foi possível identificar pela primeira vez a resposta de RNAi para T. l. licus e mostrar a eficiência das moléculas de dsRNA desenhadas, para o controle deste inseto praga. Finalmente, cabe destacar que os dados gerados poderão ser usados em futuros estudos para desenhar novas moléculas de dsRNA potenciais para o controle da broca da cana e da broca-gigante. / Sugarcane is one of the most important crops in Brazil, utilized for sugar and second-generation biofuel production. Damage caused by the pests, sugarcane borer (Diatraea Saccharalis, Fabricius 1770) and sugarcane giant borer (Telchin licus licus, Drury 1770), reduces crop yield that cause millions of dollars loss annually to the sugarcane industry. Currently used pest management approaches have failed to reduce the damages caused to sugarcane crops. RNA interference (RNAi) is an alternative biotechnological tool for pest management, that uses double-stranded RNA molecules (dsRNA) to knock-down essential genes required for the insect survival. In this work, transcriptomes from sugarcane borer and sugarcane giant borer were obtained, for the identification of target genes for RNAi and further validation of dsRNA molecules. Sequencing (RNA-seq) and in silico analysis of midgut transcriptome obtained from larvae treated on different diets (Sugarcane and artificial diet), generated a transcript database containing 49.225 and 53.108 contigs, amongst which 1.872 and 2.465 were differentially expressed (EdgeR), for D. saccharalis and T. l. licus, respectively. GO Enrichment analysis allowed identification of genes involved, mainly with detoxification pathways, molecular transport, digestion and hormonal regulation. In order to validate dsRNA molecules via oral delivery, gene sequences coding for juvenile hormones esterase (JHE) were selected. This enzyme regulates molting and metamorphosis process in insects, by controlled degradation of juvenile hormone (JH). Knock-down of JHE gene, using a 10 μg dosage of dsRNA, did not result in lethal effects for D. saccharalis larvae. Nevertheless, the same amount of dsRNA was lethal for penultimate instar of sugarcane giant borer larvae, achieving approximately 60% mortality rate. The current work is very significant, since it’s the first report of RNAi characterization in T. l. licus that show efficiency of specific dsRNA molecules reducing survival of this insect pest. Furthermore, the data generated here can also be used for validation of other potential dsRNA molecules for D. saccharalis and T. l. licus management.