A ecteinascidina-743 (ET-743) é um alcalóide marinho que tem apresentado potente atividade antitumoral contra uma variedade de tumores humanos, incluindo sarcomas, câncer de mama e de ovário. Em resposta aos resultados promissores que a ET-743 tem mostrado na clínica, o seu mecanismo de ação vem sendo amplamente investigado. Sabe-se que a ET-743 se liga na volta menor do DNA e influencia a dinâmica da hélice. Neste trabalho, o mecanismo de ação da ET-743 foi estudado em modelos eucarióticos de células da levedura Saccharomyces cerevisiae e em células de mamíferos, incluindo linhagens tumorais humanas. A utilização do modelo de levedura revelou que o sistema de reparação por excisão de bases está envolvido com o mecanismo de citotoxicidade da ET-743. Além disso, o emprego de mutantes de levedura permitiram explicar como ocorre a tolerância e a reparação dos danos gerados pela ET-743 nas linhagens que são resistentes à ação da droga. Além do mecanismo molecular proposto, este trabalho proporcionou uma possível explicação para a especificidade da ET-743 em tumores do tipo sarcomas. Considerando que a resistência dos sarcomas à maioria das drogas clássicas seja devido a superexpressão de APE1, entre outros fatores, e que a ausência desta proteína torna as células eucarióticas resistentes à ET-743, os resultados obtidos nesta tese contribuem para explicar por que sarcomas, tumores que superexpressam esta proteína, são sensíveis ao tratamento com ET-743. Além dos dados envolvendo o BER, este estudo permitiu explicar como ocorre o processamento da lesão gerada pela ET-743 no DNA. A utilização de linhagens celulares de mamíferos com deficiências em proteínas específicas combinado a técnicas bioquímicas e moleculares revelaram que a ET-743 forma adutos no DNA que são convertidos em uma lesão secundária durante a replicação do DNA. Pela primeira vez foi mostrado que a ET-743 induz a formação de quebras duplas dependentes de replicação e que o sistema de recombinação homóloga é responsável pela reparação destes danos. Os dados obtidos neste trabalho indicam que a funcionalidade das vias de reparação de DNA é uma ferramenta útil para predizer a resposta clínica da droga e, dessa forma, contribuir na seleção de pacientes que mais podem se beneficiar do tratamento. / Ecteinascidin 743 is a marine alkaloid that has shown potent antitumor activity against several human tumor types, including soft tissue sarcomas, breast and ovarian cancer. Because of these promising data, there is a strong interest in evaluating its mechanism of action. ET-743 binds to the minor groove of DNA and induces helix unwinding. Here, we studied its mechanism of action in both yeast Saccharomyces cerevisiae and mammalian cells, including human tumor cell lines. Using the yeast model, we have demonstrated that the base excision repair pathway is strongly involved in ET-743 cytotoxicity. Moreover, this work clarified how ET-743-induced DNA damages can be tolerated and repaired in yeast resistant cell lines. In addition to the molecular model we have suggested to explain the mechanism of action of ET-743, this work brings new insights to explain the specificity of ET-743 towards soft tissue sarcomas. Indeed, sarcomas, while resistant to most of the chemotherapeutic agents, over-express APE1. Thus, the involvement of APE1 in cell killing, could explain why sarcomas, as well as tumors expressing high levels of APE1, are sensitive to the treatment with ET-743. This work was extended to mammalian cells in order to better understand the processing of the ET-743-induced DNA damage. Molecular and biochemical experiments were combined and revealed that the primary ET-743 DNA-adducts is transformed in DNA double strand breaks, a secondary type of more toxic DNA lesion. This formation is entirely dependent on the progression of the DNA replication fork. The use of mammalian cell lines, deficient in specific repair proteins, demonstrated for the first time that these lesions were uniquely processed by the homologous recombination repair pathway. Thus, our data establish a new rational, based on the measure of the expression levels of selected repair fa ctors, both to predict clinical response and to facilitate the selection of the patients particularly likely, or not, to benefit from the treatment with ET-743.

A ecteinascidina-743 (ET-743) é um alcalóide marinho que tem apresentado potente atividade antitumoral contra uma variedade de tumores humanos, incluindo sarcomas, câncer de mama e de ovário. Em resposta aos resultados promissores que a ET-743 tem mostrado na clínica, o seu mecanismo de ação vem sendo amplamente investigado. Sabe-se que a ET-743 se liga na volta menor do DNA e influencia a dinâmica da hélice. Neste trabalho, o mecanismo de ação da ET-743 foi estudado em modelos eucarióticos de células da levedura Saccharomyces cerevisiae e em células de mamíferos, incluindo linhagens tumorais humanas. A utilização do modelo de levedura revelou que o sistema de reparação por excisão de bases está envolvido com o mecanismo de citotoxicidade da ET-743. Além disso, o emprego de mutantes de levedura permitiram explicar como ocorre a tolerância e a reparação dos danos gerados pela ET-743 nas linhagens que são resistentes à ação da droga. Além do mecanismo molecular proposto, este trabalho proporcionou uma possível explicação para a especificidade da ET-743 em tumores do tipo sarcomas. Considerando que a resistência dos sarcomas à maioria das drogas clássicas seja devido a superexpressão de APE1, entre outros fatores, e que a ausência desta proteína torna as células eucarióticas resistentes à ET-743, os resultados obtidos nesta tese contribuem para explicar por que sarcomas, tumores que superexpressam esta proteína, são sensíveis ao tratamento com ET-743. Além dos dados envolvendo o BER, este estudo permitiu explicar como ocorre o processamento da lesão gerada pela ET-743 no DNA. A utilização de linhagens celulares de mamíferos com deficiências em proteínas específicas combinado a técnicas bioquímicas e moleculares revelaram que a ET-743 forma adutos no DNA que são convertidos em uma lesão secundária durante a replicação do DNA. Pela primeira vez foi mostrado que a ET-743 induz a formação de quebras duplas dependentes de replicação e que o sistema de recombinação homóloga é responsável pela reparação destes danos. Os dados obtidos neste trabalho indicam que a funcionalidade das vias de reparação de DNA é uma ferramenta útil para predizer a resposta clínica da droga e, dessa forma, contribuir na seleção de pacientes que mais podem se beneficiar do tratamento. / Ecteinascidin 743 is a marine alkaloid that has shown potent antitumor activity against several human tumor types, including soft tissue sarcomas, breast and ovarian cancer. Because of these promising data, there is a strong interest in evaluating its mechanism of action. ET-743 binds to the minor groove of DNA and induces helix unwinding. Here, we studied its mechanism of action in both yeast Saccharomyces cerevisiae and mammalian cells, including human tumor cell lines. Using the yeast model, we have demonstrated that the base excision repair pathway is strongly involved in ET-743 cytotoxicity. Moreover, this work clarified how ET-743-induced DNA damages can be tolerated and repaired in yeast resistant cell lines. In addition to the molecular model we have suggested to explain the mechanism of action of ET-743, this work brings new insights to explain the specificity of ET-743 towards soft tissue sarcomas. Indeed, sarcomas, while resistant to most of the chemotherapeutic agents, over-express APE1. Thus, the involvement of APE1 in cell killing, could explain why sarcomas, as well as tumors expressing high levels of APE1, are sensitive to the treatment with ET-743. This work was extended to mammalian cells in order to better understand the processing of the ET-743-induced DNA damage. Molecular and biochemical experiments were combined and revealed that the primary ET-743 DNA-adducts is transformed in DNA double strand breaks, a secondary type of more toxic DNA lesion. This formation is entirely dependent on the progression of the DNA replication fork. The use of mammalian cell lines, deficient in specific repair proteins, demonstrated for the first time that these lesions were uniquely processed by the homologous recombination repair pathway. Thus, our data establish a new rational, based on the measure of the expression levels of selected repair fa ctors, both to predict clinical response and to facilitate the selection of the patients particularly likely, or not, to benefit from the treatment with ET-743.

A ecteinascidina-743 (ET-743) é um alcalóide marinho que tem apresentado potente atividade antitumoral contra uma variedade de tumores humanos, incluindo sarcomas, câncer de mama e de ovário. Em resposta aos resultados promissores que a ET-743 tem mostrado na clínica, o seu mecanismo de ação vem sendo amplamente investigado. Sabe-se que a ET-743 se liga na volta menor do DNA e influencia a dinâmica da hélice. Neste trabalho, o mecanismo de ação da ET-743 foi estudado em modelos eucarióticos de células da levedura Saccharomyces cerevisiae e em células de mamíferos, incluindo linhagens tumorais humanas. A utilização do modelo de levedura revelou que o sistema de reparação por excisão de bases está envolvido com o mecanismo de citotoxicidade da ET-743. Além disso, o emprego de mutantes de levedura permitiram explicar como ocorre a tolerância e a reparação dos danos gerados pela ET-743 nas linhagens que são resistentes à ação da droga. Além do mecanismo molecular proposto, este trabalho proporcionou uma possível explicação para a especificidade da ET-743 em tumores do tipo sarcomas. Considerando que a resistência dos sarcomas à maioria das drogas clássicas seja devido a superexpressão de APE1, entre outros fatores, e que a ausência desta proteína torna as células eucarióticas resistentes à ET-743, os resultados obtidos nesta tese contribuem para explicar por que sarcomas, tumores que superexpressam esta proteína, são sensíveis ao tratamento com ET-743. Além dos dados envolvendo o BER, este estudo permitiu explicar como ocorre o processamento da lesão gerada pela ET-743 no DNA. A utilização de linhagens celulares de mamíferos com deficiências em proteínas específicas combinado a técnicas bioquímicas e moleculares revelaram que a ET-743 forma adutos no DNA que são convertidos em uma lesão secundária durante a replicação do DNA. Pela primeira vez foi mostrado que a ET-743 induz a formação de quebras duplas dependentes de replicação e que o sistema de recombinação homóloga é responsável pela reparação destes danos. Os dados obtidos neste trabalho indicam que a funcionalidade das vias de reparação de DNA é uma ferramenta útil para predizer a resposta clínica da droga e, dessa forma, contribuir na seleção de pacientes que mais podem se beneficiar do tratamento. / Ecteinascidin 743 is a marine alkaloid that has shown potent antitumor activity against several human tumor types, including soft tissue sarcomas, breast and ovarian cancer. Because of these promising data, there is a strong interest in evaluating its mechanism of action. ET-743 binds to the minor groove of DNA and induces helix unwinding. Here, we studied its mechanism of action in both yeast Saccharomyces cerevisiae and mammalian cells, including human tumor cell lines. Using the yeast model, we have demonstrated that the base excision repair pathway is strongly involved in ET-743 cytotoxicity. Moreover, this work clarified how ET-743-induced DNA damages can be tolerated and repaired in yeast resistant cell lines. In addition to the molecular model we have suggested to explain the mechanism of action of ET-743, this work brings new insights to explain the specificity of ET-743 towards soft tissue sarcomas. Indeed, sarcomas, while resistant to most of the chemotherapeutic agents, over-express APE1. Thus, the involvement of APE1 in cell killing, could explain why sarcomas, as well as tumors expressing high levels of APE1, are sensitive to the treatment with ET-743. This work was extended to mammalian cells in order to better understand the processing of the ET-743-induced DNA damage. Molecular and biochemical experiments were combined and revealed that the primary ET-743 DNA-adducts is transformed in DNA double strand breaks, a secondary type of more toxic DNA lesion. This formation is entirely dependent on the progression of the DNA replication fork. The use of mammalian cell lines, deficient in specific repair proteins, demonstrated for the first time that these lesions were uniquely processed by the homologous recombination repair pathway. Thus, our data establish a new rational, based on the measure of the expression levels of selected repair fa ctors, both to predict clinical response and to facilitate the selection of the patients particularly likely, or not, to benefit from the treatment with ET-743.

Ecteinascidina 743 (ET-743) é uma nova droga isolada de um tunicado marinho, a Ecteinascidia turbinata, que está na fase III dos estudos clínicos por sua marcada atividade anticâncer. Apesar de seu mecanismo de ação não estar completamente elucidado, tem sido demonstrado que a ET-743 se liga ao DNA formando adutos covalentes com o N2 da guanina. Além disso, a ET-743 tem sido relatada como potente inibidora da transcrição. No presente estudo, utilizou-se como modelo para a investigação dos efeitos antiproliferativos deste composto a linhagem celular derivada de glioblastoma humano, U-251 MG. Uma vez que o foco principal de atenção nos estudos sobre o mecanismo de ação da ET-743 esteja concentrado em suas interações com o DNA, a autora buscou avaliar outros aspectos de sua atividade antiproliferativa, quais sejam, o seu efeito sobre a distribuição das células no ciclo celular, sobre a atividade de enzimas associadas ao processo de apoptose, bem como sobre o conteúdo celular da proteína Hsp70. Em incubações de 0,5 nM por 48 h, a ET-743 causou um significante acúmulo das células na fase G2M do ciclo celular, o mesmo ocorrendo com doses mais elevadas (1,0 e 1,5) e incubações mais prolongadas (72 h). A ET-743 induziu morte celular dose-dependente e este efeito foi significativamente prevenido pelo inibidor de caspases z-VAD-fmk. Contudo, não foi observado aumento significativo nos níveis de Hsp70 após tratamento com ET-743. Considerando que alta expressão de Hsp70 é um dos principais mecanismos de proteção das células em condições de estresse, incluindo-se o tratamento com drogas citotóxicas, a não elevação de seus níveis na presença da ET-374 pode estar, ao menos em parte, relacionada à citotoxicidade produzida por este agente na linhagem estudada.

Neste trabalho usamos simulações de Dinâmica Molecular para analisarmos interações e alterações estruturais em complexos não covalentes e covalentes entre o fármaco Ecteinascidina (ET743) e o DNA (modelado como dodecâmeros). De acordo com a literatura, a Ecteinascidina forma primeiro um complexo nãocovalente, determinado por ligações de hidrogênio, com um segmento do DNA, sendo que ocorre uma posterior alquilação de uma guanina, levando a um complexo covalente ET743-DNA. Dependendo da seqüência de DNA, constata-se a existência de diferentes reatividades frente à ET743. Assim, foram escolhidas para a formação dos complexos duas seqüências de alta interação com o fármaco, duas de baixa interação e uma de interação moderada. A interação do fármaco induz uma torção estrutural do DNA em direção ao sulco maior, impedido a ação do sistema de reparo celular, levando a morte da célula. Em simulações envolvendo DNA e ligantes, é fundamental a boa parametrização e descrição das interações eletrostáticas e a caracterização dos parâmetros estruturais, bem como de suas flutuações. As simulações confirmaram a interação entre a ET743 e as seqüências escolhidas, sendo constatada a permanência do fármaco no sítio de interação por um longo período de tempo e uma forte distorção dos oligonucleotídeos. A análise das ligações de hidrogênio confirmou algumas das ligações previstas e também algumas não antes reportadas. Não foi constatada nenhuma correlação significativa entre a interação induzida e a reatividade das seqüencias, embora em um caso tenha sido constatada a migração da ET743 em direção a um sítio de interação de maior reatividade. A análise termodinâmica foi realizada calculando-se as energias de interação em complexos não-covalentes e, após, afastando gradualmente os mesmos em relação ao DNA e monitorando os diversos termos energéticos até a convergência. Apesar da estabilidade do complexo, a análise termodinâmica, obtida mediante simulações de afastamento da ET743, mostrou que a formação do complexo não covalente é endotérmica. A simulação dos complexos covalentes destes oligonucleotídeos com o ligante também mostrou fortes distorções induzidas. / In this work we used molecular dynamics simulations to analyse the interactions and induced structural changes in non-covalent and covalent complexes between Ecteinascidin (ET743) and DNA dodecamers. According to the literature, the interaction between Ecteinascidin and DNA involves the formation of a non-covalent complex characterized by several hydrogen bonds with a DNA segment. Further, there is an alkylation of a guanine, leading to a covalent complex between ET743 and DNA. Depending on the base pair sequence, ET743 displays different reactivities. In this work, two sequences of high reactivity, two sequences of low reactivity and one sequence of moderate reactivity were chosen. The interaction between the Ecteinascidin and DNA leads to a bending of the DNA towards the major groove, blocking the cell repair system and leading to cell´s death. In simulations with DNA and ligands the detailed description of the structural parameters as well as a carefull parameterization, especially in the description of the electrostatic interactions, are fundamental. The simulations confirmed the strong interaction between Ecteinascidin and the chosen sequences, with a high residence time of the drug in the site of interaction and a strong distortion of the oligonucleotides. The analysis of the hydrogen bonds (HBs) confirmed some of known HBs and revealed some alternative HBs. There were no significant correlation between the induced distortion and interactions and the reactivity of the sequences, although a migration of the ET743 towards a higher interaction site was found in one system. The thermodynamic analysis was carried out calculating the interaction energies of the non-covalent complexes and gradually increasing the distance between drug and interaction site, until the energetic terms converge. Despite of the stability of the complex, the thermodynamic analysis showed a endothermic enthalpy of formation for the non-covalent complex. The simulation of covalent complexes between ET743 and oligonucleotides also showed strong induced distortions.

Neste trabalho usamos simulações de Dinâmica Molecular para analisarmos interações e alterações estruturais em complexos não covalentes e covalentes entre o fármaco Ecteinascidina (ET743) e o DNA (modelado como dodecâmeros). De acordo com a literatura, a Ecteinascidina forma primeiro um complexo nãocovalente, determinado por ligações de hidrogênio, com um segmento do DNA, sendo que ocorre uma posterior alquilação de uma guanina, levando a um complexo covalente ET743-DNA. Dependendo da seqüência de DNA, constata-se a existência de diferentes reatividades frente à ET743. Assim, foram escolhidas para a formação dos complexos duas seqüências de alta interação com o fármaco, duas de baixa interação e uma de interação moderada. A interação do fármaco induz uma torção estrutural do DNA em direção ao sulco maior, impedido a ação do sistema de reparo celular, levando a morte da célula. Em simulações envolvendo DNA e ligantes, é fundamental a boa parametrização e descrição das interações eletrostáticas e a caracterização dos parâmetros estruturais, bem como de suas flutuações. As simulações confirmaram a interação entre a ET743 e as seqüências escolhidas, sendo constatada a permanência do fármaco no sítio de interação por um longo período de tempo e uma forte distorção dos oligonucleotídeos. A análise das ligações de hidrogênio confirmou algumas das ligações previstas e também algumas não antes reportadas. Não foi constatada nenhuma correlação significativa entre a interação induzida e a reatividade das seqüencias, embora em um caso tenha sido constatada a migração da ET743 em direção a um sítio de interação de maior reatividade. A análise termodinâmica foi realizada calculando-se as energias de interação em complexos não-covalentes e, após, afastando gradualmente os mesmos em relação ao DNA e monitorando os diversos termos energéticos até a convergência. Apesar da estabilidade do complexo, a análise termodinâmica, obtida mediante simulações de afastamento da ET743, mostrou que a formação do complexo não covalente é endotérmica. A simulação dos complexos covalentes destes oligonucleotídeos com o ligante também mostrou fortes distorções induzidas. / In this work we used molecular dynamics simulations to analyse the interactions and induced structural changes in non-covalent and covalent complexes between Ecteinascidin (ET743) and DNA dodecamers. According to the literature, the interaction between Ecteinascidin and DNA involves the formation of a non-covalent complex characterized by several hydrogen bonds with a DNA segment. Further, there is an alkylation of a guanine, leading to a covalent complex between ET743 and DNA. Depending on the base pair sequence, ET743 displays different reactivities. In this work, two sequences of high reactivity, two sequences of low reactivity and one sequence of moderate reactivity were chosen. The interaction between the Ecteinascidin and DNA leads to a bending of the DNA towards the major groove, blocking the cell repair system and leading to cell´s death. In simulations with DNA and ligands the detailed description of the structural parameters as well as a carefull parameterization, especially in the description of the electrostatic interactions, are fundamental. The simulations confirmed the strong interaction between Ecteinascidin and the chosen sequences, with a high residence time of the drug in the site of interaction and a strong distortion of the oligonucleotides. The analysis of the hydrogen bonds (HBs) confirmed some of known HBs and revealed some alternative HBs. There were no significant correlation between the induced distortion and interactions and the reactivity of the sequences, although a migration of the ET743 towards a higher interaction site was found in one system. The thermodynamic analysis was carried out calculating the interaction energies of the non-covalent complexes and gradually increasing the distance between drug and interaction site, until the energetic terms converge. Despite of the stability of the complex, the thermodynamic analysis showed a endothermic enthalpy of formation for the non-covalent complex. The simulation of covalent complexes between ET743 and oligonucleotides also showed strong induced distortions.

Ecteinascidina 743 (ET-743) é uma nova droga isolada de um tunicado marinho, a Ecteinascidia turbinata, que está na fase III dos estudos clínicos por sua marcada atividade anticâncer. Apesar de seu mecanismo de ação não estar completamente elucidado, tem sido demonstrado que a ET-743 se liga ao DNA formando adutos covalentes com o N2 da guanina. Além disso, a ET-743 tem sido relatada como potente inibidora da transcrição. No presente estudo, utilizou-se como modelo para a investigação dos efeitos antiproliferativos deste composto a linhagem celular derivada de glioblastoma humano, U-251 MG. Uma vez que o foco principal de atenção nos estudos sobre o mecanismo de ação da ET-743 esteja concentrado em suas interações com o DNA, a autora buscou avaliar outros aspectos de sua atividade antiproliferativa, quais sejam, o seu efeito sobre a distribuição das células no ciclo celular, sobre a atividade de enzimas associadas ao processo de apoptose, bem como sobre o conteúdo celular da proteína Hsp70. Em incubações de 0,5 nM por 48 h, a ET-743 causou um significante acúmulo das células na fase G2M do ciclo celular, o mesmo ocorrendo com doses mais elevadas (1,0 e 1,5) e incubações mais prolongadas (72 h). A ET-743 induziu morte celular dose-dependente e este efeito foi significativamente prevenido pelo inibidor de caspases z-VAD-fmk. Contudo, não foi observado aumento significativo nos níveis de Hsp70 após tratamento com ET-743. Considerando que alta expressão de Hsp70 é um dos principais mecanismos de proteção das células em condições de estresse, incluindo-se o tratamento com drogas citotóxicas, a não elevação de seus níveis na presença da ET-374 pode estar, ao menos em parte, relacionada à citotoxicidade produzida por este agente na linhagem estudada.

Ecteinascidina 743 (ET-743) é uma nova droga isolada de um tunicado marinho, a Ecteinascidia turbinata, que está na fase III dos estudos clínicos por sua marcada atividade anticâncer. Apesar de seu mecanismo de ação não estar completamente elucidado, tem sido demonstrado que a ET-743 se liga ao DNA formando adutos covalentes com o N2 da guanina. Além disso, a ET-743 tem sido relatada como potente inibidora da transcrição. No presente estudo, utilizou-se como modelo para a investigação dos efeitos antiproliferativos deste composto a linhagem celular derivada de glioblastoma humano, U-251 MG. Uma vez que o foco principal de atenção nos estudos sobre o mecanismo de ação da ET-743 esteja concentrado em suas interações com o DNA, a autora buscou avaliar outros aspectos de sua atividade antiproliferativa, quais sejam, o seu efeito sobre a distribuição das células no ciclo celular, sobre a atividade de enzimas associadas ao processo de apoptose, bem como sobre o conteúdo celular da proteína Hsp70. Em incubações de 0,5 nM por 48 h, a ET-743 causou um significante acúmulo das células na fase G2M do ciclo celular, o mesmo ocorrendo com doses mais elevadas (1,0 e 1,5) e incubações mais prolongadas (72 h). A ET-743 induziu morte celular dose-dependente e este efeito foi significativamente prevenido pelo inibidor de caspases z-VAD-fmk. Contudo, não foi observado aumento significativo nos níveis de Hsp70 após tratamento com ET-743. Considerando que alta expressão de Hsp70 é um dos principais mecanismos de proteção das células em condições de estresse, incluindo-se o tratamento com drogas citotóxicas, a não elevação de seus níveis na presença da ET-374 pode estar, ao menos em parte, relacionada à citotoxicidade produzida por este agente na linhagem estudada.

Neste trabalho usamos simulações de Dinâmica Molecular para analisarmos interações e alterações estruturais em complexos não covalentes e covalentes entre o fármaco Ecteinascidina (ET743) e o DNA (modelado como dodecâmeros). De acordo com a literatura, a Ecteinascidina forma primeiro um complexo nãocovalente, determinado por ligações de hidrogênio, com um segmento do DNA, sendo que ocorre uma posterior alquilação de uma guanina, levando a um complexo covalente ET743-DNA. Dependendo da seqüência de DNA, constata-se a existência de diferentes reatividades frente à ET743. Assim, foram escolhidas para a formação dos complexos duas seqüências de alta interação com o fármaco, duas de baixa interação e uma de interação moderada. A interação do fármaco induz uma torção estrutural do DNA em direção ao sulco maior, impedido a ação do sistema de reparo celular, levando a morte da célula. Em simulações envolvendo DNA e ligantes, é fundamental a boa parametrização e descrição das interações eletrostáticas e a caracterização dos parâmetros estruturais, bem como de suas flutuações. As simulações confirmaram a interação entre a ET743 e as seqüências escolhidas, sendo constatada a permanência do fármaco no sítio de interação por um longo período de tempo e uma forte distorção dos oligonucleotídeos. A análise das ligações de hidrogênio confirmou algumas das ligações previstas e também algumas não antes reportadas. Não foi constatada nenhuma correlação significativa entre a interação induzida e a reatividade das seqüencias, embora em um caso tenha sido constatada a migração da ET743 em direção a um sítio de interação de maior reatividade. A análise termodinâmica foi realizada calculando-se as energias de interação em complexos não-covalentes e, após, afastando gradualmente os mesmos em relação ao DNA e monitorando os diversos termos energéticos até a convergência. Apesar da estabilidade do complexo, a análise termodinâmica, obtida mediante simulações de afastamento da ET743, mostrou que a formação do complexo não covalente é endotérmica. A simulação dos complexos covalentes destes oligonucleotídeos com o ligante também mostrou fortes distorções induzidas. / In this work we used molecular dynamics simulations to analyse the interactions and induced structural changes in non-covalent and covalent complexes between Ecteinascidin (ET743) and DNA dodecamers. According to the literature, the interaction between Ecteinascidin and DNA involves the formation of a non-covalent complex characterized by several hydrogen bonds with a DNA segment. Further, there is an alkylation of a guanine, leading to a covalent complex between ET743 and DNA. Depending on the base pair sequence, ET743 displays different reactivities. In this work, two sequences of high reactivity, two sequences of low reactivity and one sequence of moderate reactivity were chosen. The interaction between the Ecteinascidin and DNA leads to a bending of the DNA towards the major groove, blocking the cell repair system and leading to cell´s death. In simulations with DNA and ligands the detailed description of the structural parameters as well as a carefull parameterization, especially in the description of the electrostatic interactions, are fundamental. The simulations confirmed the strong interaction between Ecteinascidin and the chosen sequences, with a high residence time of the drug in the site of interaction and a strong distortion of the oligonucleotides. The analysis of the hydrogen bonds (HBs) confirmed some of known HBs and revealed some alternative HBs. There were no significant correlation between the induced distortion and interactions and the reactivity of the sequences, although a migration of the ET743 towards a higher interaction site was found in one system. The thermodynamic analysis was carried out calculating the interaction energies of the non-covalent complexes and gradually increasing the distance between drug and interaction site, until the energetic terms converge. Despite of the stability of the complex, the thermodynamic analysis showed a endothermic enthalpy of formation for the non-covalent complex. The simulation of covalent complexes between ET743 and oligonucleotides also showed strong induced distortions.

Os novos agentes alquilantes Zalypsis e o Tryptamicidin são moléculas estruturalmente relacionadas à trabectedina e possuem a habilidade de ligarem-se à volta menor do DNA. Por apresentarem potente atividade antitumoral em modelos in vitro e in vivo, estes agentes estão atualmente sendo avaliados em ensaios clínicos I e II para o tratamento de diferentes tipos de tumores sólidos e hematológicos. Por outro lado, o 3’3-ditrifluometildifenil disseneleto (DFDD) é um composto orgânico de selênio que demonstra interessantes atividades antioxidantes em modelos biológicos in vitro e in vivo e está em fase inicial de desenvolvimento. No presente trabalho, buscou-se avaliar os mecanismos de ação dos três novos agentes principalmente em relação à maquinaria macromolecular. Dentre os principais resultados encontrados, destaca-se a potente atividade citotóxica do Zalypsis e Tryptamicidin em diferentes linhagens tumorais e a capacidade de indução de quebras duplas no DNA (DSB) de maneira dependente de replicação por esses agentes. Além disso, a utilização de linhagens celulares deficientes em genes que codificam proteínas envolvidas nos sistemas de reparação por recombinação homóloga (HRR) e não-homóloga (NHEJ), permitiu a identificação do sistema HRR como a principal via implicada na reparação das lesões induzidas pelo Zalypsis e Tryptamicidin. Por outro lado, embora o NER não seja capaz de reparar as lesões induzidas pelo Tryptamicidin, este agente mostrou interferir na maquinaria do NER, impedindo a reparação de lesões induzidas pelo UV, como verificado pelo teste UDS. Considerando que linhagens tumorais resistentes a agentes platinados possuem uma alta atividade das enzimas do NER, buscou-se investigar a ação do Tryptamicidin nestas células. Como esperado, o Tryptamicidin, assim como a trabectedina, demonstrou potente atividade citotóxica nestas linhagens e ainda mostrou efeito sinérgico quando associado à cisplatina em linhagens resistentes a este agente platinado. Adicionalmente, usando linhagens celulares tumorais e extratos de ovos de Xenopus laevis, foi verificado que o Zalypsis, mesmo em baixas concentrações e curtos períodos de tratamento, também é capaz de bloquear a replicação sem causar, no entanto, parada no ciclo celular e ativação das vias clássicas de sinalização de danos no DNA (DNA damage response). Adicionalmente, foi observado pela primeira vez que o DFDD foi capaz de proteger o DNA contra os efeitos genotóxicos e mutagênicos do peróxido de hidrogênio (H2O2) em diferentes modelos biológicos. Estes resultados reforçam as atividades antioxidantes deste composto de selênio que parecem estar relacionadas à ação direta do DFDD na molécula do H2O2. Os dados apresentados nesta tese elucidaram aspectos importantes dos mecanismos de ação dos novos agentes Zalypsis, Tryptamicidin e DFDD, ressaltando a importância dessas moléculas que, como agentes únicos ou em associação, poderão contribuir para a melhoria da terapia antitumoral. / Zalypsis and Tryptamicidin are new covalent minor groove binders structurally related to trabectedin. Both compounds have shown potent antitumoral activities in vitro and in vivo tumor models and are currently under clinical phase I and II in patients with different haematological and solid tumors. 3’3- ditrifluoromethyldyphenil diselenide (DFDD) is an organic selenium compound that demonstrated interesting antioxidant activities both in vitro and in vivo and is under early phase of development. The aim of this work was evaluate the mechanism of action of these new products focusing on the macromolecular machinery. Interestingly, Zalypsis and Tryptamicidin display strong cytotoxic activities in different tumor cell lines and these drugs are able to induce replication-dependent double strand breaks (DSB). Using homologous recombination repair (HRR) and nonhomologous end-joining repair (NHEJ) deficient and proficient cell lines, it was found that the HRR is the principal pathway implicated in the repair of the DNA lesions induced by Zalypsis and Tryptamicidin. Our results also demonstrate that although Tryptamicidin is not repaired by NER, this compound is able to interfere with the NER machinery thereby attenuating the repair of specific NER substrates, as verified by UDS test. Importantly, Tryptamicidin and trabectedin show unchanged or even enhanced activity towards all four cisplatin- and oxaliplatin-resistant cell lines and combinations of these drugs and cisplatin were mostly synergistic toward both parental and cisplatin-resistant ovarian carcinoma cells. We also demonstrate for the first time that Zalypsis, even in low doses and short treatment periods, was able to block the replication in tumor cell lines and Xenopus laevis egg extracts. Interestingly, this blockage did not trigger cell cycle arrest or DNA damage response and, as a result, leads to early cell death. On the other hand, DFDD is able to protect the DNA against the genotoxicity and mutagenicity induced by hydrogen peroxide in bacteria, yeast and cultured mammalian cells. Using in vitro tests, we also illustrated that DFDD directly acts on H2O2 molecule mimicking catalase-like activity. Indeed, these results reinforce the antioxidant property of DFDD that probably play a fundamental role in the DNA protection showed by this selenium compound. Taken together, our findings elucidate important aspects of the mechanism of action of the new agents Zalypsis, Tryptamicidin and DFDD, highlighting the promising activities of these drugs which, employed as single or in association, might contribute for the antitumoral therapy.