Dans les sols, les champignons ectomycorhiziens (ECM) forment une symbiose très répandue avec les racines des arbres et contribuent ainsi à leur croissance et à leur santé. Des études antérieures ont montré que certaines bactéries pouvaient influencer positivement la symbiose entre les ECM et les arbres, appelées BAM pour Bactéries Auxiliaires de la Mycorhization. Les mécanismes de l’effet auxiliaire des BAM sont encore peu connus. En amont de cette thèse, il avait été montré in vitro que la BAM Pseudomonas fluorescens BBc6 formait des structures similaires à des biofilms sur les hyphes de l'ECM Laccaria bicolor. Dans ce contexte, afin d'enrichir les connaissances concernant les interactions entre les ECM et les BAM, cette thèse a porté sur l'interaction physique entre ces deux organismes. L'étude a en partie été réalisée via une méthode d'analyse par microscopie confocale, développée durant cette thèse. Les résultats obtenus ont montré que cette bactérie formait des biofilms localisés préférentiellement sur la région apicale des colonies de l'ECM ce qui pourrait indiquer une interaction trophique. L'existence d'une telle interaction a d'ailleurs par la suite été confirmée. Les résultats ont également montré que l'interaction physique entre Laccaria bicolor et BBc6 n'est pas spécifique puisque l'ensemble des treize autres souches bactériennes testées a formé des biofilms sur les hyphes de Laccaria bicolor. En revanche, BBc6 s'est montrée incapable de former des biofilms sur certains champignons appartenant aux Ascomycètes, suggérant des mécanismes d'inhibition. De plus, l'étude de la matrice des biofilms formés par BBc6 a révélé la présence de réseaux de filaments constitués d'ADN qui semblent structurer ces biofilms et qui ont aussi été observés chez l'ensemble des souches bactériennes testées. Ces résultats révèlent un rôle structural de la molécule d'ADN qui, bien qu'il semble répandu, n'a que peu été reporté jusqu'à présent. Enfin, il a été montré que des mutants de BBc6 qui ont perdu leur effet auxiliaire forment des biofilms différents de la souche sauvage sur une surface abiotique suggérant un lien potentiel entre l'effet auxiliaire et la formation de biofilms / In soil ecosystems, ectomycorrhizal fungi (ECM) form a widespread symbiosis with roots of trees, contributing to tree growth and health. It has been shown that some bacteria, called mycorrhization helper bacteria (MHB), stimulate mycorrhizal symbiosis. The mechanisms of this helper effect are poorly understood. Previous studies have shown that the MHB Pseudomonas fluorescens BBc6 formed biofilm-like structures around the hyphae of the ECM Laccaria bicolor during their in vitro interaction. In this context, in order to increase knowledge concerning MHB/ECM interactions, the work presented here focuses on the physical interaction between these two organisms. To this purpose, a method of analysis based on confocal microscopy was developed. The results showed that the bacteria formed biofilms preferentially localized on the apical region of the ECM colonies, which could indicate a trophic interaction. Such an interaction has been subsequently confirmed. The results also showed that the physical interaction between L. bicolor and BBc6 is not specific since all thirteen other bacterial strains tested formed biofilms on the hyphae of L. bicolor. On the other hand, BBc6 was unable to form biofilms on some fungi belonging to Ascomycetes, suggesting the existence of inhibition mechanisms. Moreover, the study of the BBc6 biofilm matrix revealed networks of DNA-containing filaments which seem to structure these biofilms and which have also been observed in all the bacterial strains tested. These results reveal a structural role of the DNA molecule, a role that has been rarely reported so far despite its probable high occurrence. Finally, it has been shown that BBc6 mutants having lost their helper effect presented a modified phenotype concerning their biofilm formation on abiotic surface, suggesting a potential link between the helper effect and the biofilms formation

La Truffe noire (Tuber melanosporum Vittad.) est un champignon ectomycorhizien spontanément présent dans les groupements végétaux ouverts en cours de reforestation. Alors que ces milieux ont fortement régressé au XXème siècle dans la zone méditerranéenne, 80 % de la production actuelle provient de boisements artificiels où des arbres inoculés par la Truffe sont plantés. Malgré un grand corpus de connaissances empiriques, la production reste souvent aléatoire et les connaissances fondamentales d'écologie et de biologie de la Truffe restent fragmentaires. Dans ce travail, nous avons d'abord étudié la distribution de la diversité fongique ectomycorhizienne sur les différents hôtes présents dans les garrigues pré-forestières à Truffe. Nous avons ensuite testé les interactions entre la Truffe et les plantes endo- ou non-mycorhiziennes, qui se matérialisent par la création d'un brûlé, où la flore est localement affectée. Dans un troisième volet, nous avons cherché à mieux comprendre la diversité génétique des populations de Truffes, et plus spécifiquement l'appariement sexuel et la dispersion de cette espèce à vie végétative haploïde et à fructification hypogée. Par une approche comparative entre truffières plantées et spontanées, nous avons finalement évalué les modifications liées au processus de proto-domestication en cours. Ainsi, en combinant écologie des communautés, expériences en conditions contrôlées et génétique des populations, nous avons montré qu'en région méditerranéenne :1) La Truffe est présente de façon fugace dans des communautés ectomycorhiziennes riches, avec de nombreuses espèces multi-hôtes, mais où la Truffe montre une préférence d'hôte marquée pour le chêne vert (Q. ilex). 2) Certaines plantes endo- ou non-mycorhiziennes, dont l'effet positif sur la Truffe a empiriquement été observé par les trufficulteurs, favorisent le développement du mycélium de Truffe dans le sol, agissant indirectement sur les interactions plante-plante (chêne – plantes endomycorhiziennes). L'effet inhibiteur de la Truffe observé sur la germination des graines peut-être une des causes précoces du brûlé. Par ailleurs, la Truffe semble effectivement coloniser les racines de plantes herbacées non-ectomycorhiziennes.3) Les flux de gènes sont limités à l'échelle de la truffière, l'appariement sexuel réunit des individus proches génétiquement et physiquement, et bien que la Truffe soit probablement hermaphrodite, les parents paternels sont peu détectables, probablement de taille plus réduite que les parents maternels (formant la gléba). Les pratiques culturales pourraient entraîner un brassage génétique plus important en plantation, mais à l'échelle régionale, aucune différence de diversité génétique n'a été détectée entre populations spontanées et cultivées. Ce travail montre la richesse des interactions biotiques impliquant la Truffe et les diversités végétale et fongique des truffières artificielles et spontanées de la région méditerranéenne. Les résultats acquis contribuent à lever le voile sur sa biologie reproductive, et jalonnent le chemin pour des pratiques intégratrices de la diversité biologique des truffières, ainsi que pour le développement de futures expérimentations in situ. Mots clés : appariement sexuel, Arbutus unedo, Cistus albidus, domestication, écologie des communautés, forêts méditerranéennes, génétique des populations, isolement par la distance, ITS, microsatellites, mésocosmes, mycorhizes, pratiques empiriques, qPCR, Quercus coccifera, Quercus ilex, successions secondaires / The Black Truffle (Tuber melanosporum Vittad.) is an ectomycorrhizal fungus spontaneously growing in open woodlands before canopy closure. Such open landscapes drastically regressed during the last century in the Mediterranean regions, and nowadays 80% of the production comes from man-made plantations where the Truffle is inoculated. Despite a large corpus of local knowledge and empirical practices, the production remains largely sporadic and unpredictable, and our knowledge of the biology and ecology of the Truffle is still fragmentary. In this work, we first analyzed the distribution of the ectomycorrhizal fungal diversity among host plants co-existing in the shrub-dominated landscapes where Truffle naturally occurs. We then analyzed the interactions between the Truffle and endo- or non-mycorrhizal plants, as they typically occur in the so-called brûlés, zones with scarce vegetation. A third part aimed at better understanding the genetic diversity of Truffle populations, with special focus on fertilization and dispersal process of this fungus with haploid lifecycle and hypogeous fruiting. In a multi-scale approach combining community ecology, experimentation and population genetics, we found that in the Mediterranean region:1) The Truffle is transiently present in rich ectomycorrhizal communities, showing a significant host preference for Q. ilex, in assemblies made of numerous multi-host fungal species. 2) Some endo- or non-mycorrhizal plants species, that were supposed to provide beneficial effect on the Truffle, can be experimentally shown to stimulate the development of T. melanosporum mycelium in soil, and indirectly trigger plant-plant interactions (between oak and endomycorrhizal plants). The early brûlé symptoms could at least partially result from a Truffle's inhibitor effect on seed germination.3) At truffle ground scale, gene flow is limited, and mating occurs between genetically and physically close parents. Despite probable hermaphroditism of the Truffle, paternal parents are poorly detectable, certainly of smaller size than maternal ones (these forming nourishing tissue of the ascocarp). Cultural practices could favor genetic mixing/diversity at brûlé scale, but at the regional scale, no difference in genetic diversity was found between spontaneous and planted compartments.This work revealed the richness of biotic interactions involving the black Truffle and the plant as well as the fungal diversity in both artificial and spontaneous truffle-ground of the Mediterranean region. These results enlighten the reproductive biology of the species, and pave the way for practices integrating the biological diversity of truffle-grounds and the development of further in situ experimentations. Key words: Arbutus unedo, Cistus albidus, community ecology, domestication, empirical practices, local knowledge, experimental approach, inbreeding, isolation by distance, ITS, Mediterranean forests, mesocosms, microsatellites, mycorrhiza, population genetics, qPCR, Quercus ilex, Q. coccifera, secondary successions.

Ectomycorrhizal (ECM) associations are important elements of forest biomes, connecting and transferring nutrients through an intricate and complex system of hyphal networks, ensuring plants of the nutrients they require, in nutrient poor soil. ECM research and particularly investigations into the diversity of the fungal partners has not received much attention in South Africa, hindering the advance of research in this field. This has been attributed to the difficulty of identifying the mycobionts involved in the symbiosis. The objectives of this study were to examine the ECM fungal diversity associating with Pinus patula, in selected forest plantations in Mpumalanga, South Africa. Both morphological and molecular techniques were used to identify specimens of both sporocarp collections and ECM root tip morphotypes. Morphological analysis of the ECM root tips involved characterisation of root morphology such as colour, branching and texture, and anatomical analysis examined hyphal arrangement in the root mantle and rhizomorphs. Molecular analysis involved sequencing of the Internal Transcribed Spacer (ITS) region and comparative BLAST analysis. Twenty-four sporocarp species were identified from 13 genera, namely: Amanita, Boletus, Clavulina, Inocybe, Lactarius, Rhizopogon, Russula, Scleroderma, Suillus, Tricholoma, Thelephora, Tomentella and Xerocomus. ECM root tip analysis led to the characterisation of 7 wild-type morphotypes identified as an Albatrellus sp., 2 Amanita species, a Rhizopogon sp., Thelephora terrestris, a Tomentella sp. and Scleroderma citrinum. A secondary objective was to determine whether fertilisation treatments within the study sites were responsible for differences in fungal species community structure. No evidence of a change in species diversity or shift in species composition was encountered. It is envisaged that these comprehensive ECM descriptions will be used as reference material to stimulate continued research in this field in South Africa.

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En Europe, le bois est la première source d’énergie renouvelable. La transition énergétique se traduit par une intensification de l’exploitation des forêts. L’effet de ces pratiques sylvicoles sur les communautés microbiennes du sol est encore peu étudié. Au cours de ma thèse, j’ai évalué les conséquences d’une manipulation artificielle de matière organique en forêt tempérée sur la diversité fonctionnelle et taxonomique des communautés bactériennes et fongiques telluriques dans six sites expérimentaux (réseau expérimental MOS). Parallèlement, une caractérisation fonctionnelle des communautés microbiennes a également été réalisée dans un contexte proche des réalités de l’intensification des pratiques sylvicoles sous climat tropical en plantation d’Eucalyptus. Si certains descripteurs fonctionnels de la dégradation de la matière organique sont particulièrement informatifs, les activités microbiennes de dégradation de la chitine, polymère azoté des arthropodes et champignons, sont apparues très sensibles au retrait de matière organique. C’est pourquoi, par des approches de génomiques comparatives, nous avons cherché à estimer le potentiel chitinolytique des différentes guildes fongiques des sols. En conditions contrôlées, nous avons ensuite quantifié les capacités potentielles de mobilisation et de transfert du carbone et de l’azote, à partir d’une matière organique microbienne riche en chitine, par un champignon ectomycorhizien en symbiose avec son hôte. Enfin, la généricité des fonctions chitinolytiques d’un plus large spectre d’espèces fongiques ectomycorhiziennes a été évaluée par le couplage d’approches enzymatiques et isotopiques. L’ensemble de nos résultats met en lumière le rôle significatif des champignons ectomycorhiziens dans la mobilisation du carbone et de l’azote à partir de certaines formes de matière organique, et la nécessité de prendre en compte le compartiment microbien dans les études d’impact des pratiques sylvicoles / One of the main usages of wood in Europe is renewable energy supply that implies intensification of forest management to respond to this increasing demand. However, the impact of intense forestry practices on soil microbial communities remains poorly investigated. In the frame of my PhD thesis, I evaluated effects of artificial organic matter removal on functional and taxonomical diversity of soil bacterial and fungal communities in temperate forest, using six experimental sites across France (INRA MOS experimental network). In parallel, I also characterised impact of intensified forest management practices on functional microbial communities in tropical plantation of Eucalyptus trees. This work permitted to identify several sensitive functional indicators of organic matter degradation. Notably, the degradation of chitin – a nitrogen polymer main component of arthropods and fungal cell walls – was revealed to be particularly sensitive to organic matter removal. Genomics and enzymatic approaches were then used to estimate chitinolytic potentials of the different genera of soil fungi. In controlled conditions, we were able to quantify ectomycorrhizal fungus carbon and nitrogen mobilisation and transfer capacities from chitin enriched organic matter to its host during symbiotic interaction. Finally, we evaluated chitinolytic functions of ectomycorrhizal fungi at large scale by combining enzymatic and isotopic approaches. Taken together, the results acquired in the frame of my PhD thesis, illustrate the significant role of ectomycorrhizal fungi in carbon and nitrogen mobilisation from organic matter. We particularly highlight that microbial compartment in soil must be considered in studies of forest management practices

Thesis (MScFor (Forest and Wood Science))--University of Stellenbosch, 2007. / The study was undertaken to determine the potential physiological benefits to plants provided by the double colonisation of host plant roots by endomycorrhizal (AM) and ectomycorrhizal (ECM) fungi, when growing under normal and under salt stress conditions. Plants of the Eucalyptus grandis x E. camaldulensis clone were grown in a sterile soil with 0 and 75 mM NaCl and with or without infection with the fungi Glomus etunicatum (an AM fungus) and Pisolithus tinctorius (an ECM fungus). The Eucalyptus clone formed both ECM and AM in single and double inoculation. The mycorrhizal symbiosis did not provide any nutritional benefits to the hosts. The double colonisation had no effect on plant growth under normal growth conditions while single colonisations of AM and ECM reduced growth. Double colonisation reduced host plant specific leaf mass by 12% and increased total leaf area by 43% compared with the control under these growth conditions. This colonisation also reduced photosynthesis per leaf area by 29% compared with the control. The reduced photosynthesis of the double colonisation did not result in reduced plant growth because these plants may have had a high total plant photosynthesis because of their large total leaf area. The double symbiosis however did not reduce salt stress when host plants were exposed to 75 mM NaCl, while the AM fungus increased plant dry weight by 13% compared to the control. AM and ECM colonisation in the double colonised roots under salt stress was decreased by 18 and 43% compared to that in plants under normal growth. The reduced colonisation may have reduced the fungi’s abilities to be beneficial to the host plant. The double symbiosis is recommended based on the documented positive effects of this symbiosis to plant growth and the considered possible long-term benefits to host plants growing in saline soils.

Before the arrival of Euro-Americans, the inland Pacific Northwest was settled by native people whose frequent intentional burning of the landscape promoted open stands dominated by large fire-resistant ponderosa pine. Fire suppression for nearly a century, livestock grazing, and logging of the largest trees has resulted in forests characterized by increased densities of small trees with closed canopies and unusually high fuel loads. Such structural changes to the forest ecosystem are particularly evident in the Blue Mountains of Oregon and Washington where forest managers are applying prescribed fire and thinning to reduce the risk of stand-replacing wildfire and reestablish stand structure characteristics seen prior to Euro-American settlement. Aboveground ecosystem recovery after disturbance is directly linked to the survival of ectomycorrhizal fungi (EMF) that form an obligate symbiosis with roots of tree species in the Pinaceae. EMF are critical for the uptake of nutrients by the tree host. The research comprising this dissertation explores the response of the EMF community structure and composition, live fine root biomass, and duff (decaying material) levels to (i) seasonal burning (fall vs. spring) and (ii) alternative fuel reducing restoration treatments (thinned only, prescribed burned only, thinned and prescribed burned). In both studies, treatments significantly reducing duff depth (e.g. fall burning and both restoration burning treatments) negatively impacted EMF species richness and live fine root biomass. The EMF community is characterized by a large number of species scattered at low frequencies across the sites. The frequent occurrence of a few species (e.g. Rhizopogon salebrosus and Wilcoxina rehmii), in both studies before and after treatment applications, demonstrates that some EMF species survive or rapidly reestablish after disturbance. The initial reduction of EMF species richness, fine root biomass, and duff levels after prescribed fire has important implications for whether managers can achieve the desired future condition of stands with large-tree retention and low fuel loads. The impacts of prescribed fire on the soil microbial community, along with the recovery potential of a site and the impending risk of stand-replacing wildfire in stands differing in structure from historic conditions, bear consideration when developing restoration prescriptions. / Graduation date: 2005

Au sein des sols forestiers, la richesse taxonomique et le rôle des microorganismes eucaryotes (en grande partie des champignons) restent encore largement méconnus. L’espèce d’arbre est un des facteurs qui structurent les communautés de ces microorganismes. Nous avons étudié l’impact de l’essence forestière (hêtre et épicéa) sur la diversité taxonomique et fonctionnelle de ces communautés par une approche métatranscriptomique et une approche biochimique (focalisée sur les champignons ectomycorhiziens). Nous avons montré un effet de la séquence étudiée (ADNr 18S, ADNc) sur la distribution taxonomique des communautés et développé un nouveau marqueur moléculaire mitochondrial pour l’étude des communautés de champignons métaboliquement actifs. L’identification de gènes d’intérêt écologique et industriel par séquençage systématique des banques métatranscriptomiques ainsi que l’identification fonctionnelle d’une nouvelle famille de transporteursmembranaires montrent l’intérêt de l’approche métatranscriptomique. L’approche biochimique a consisté en un dosage à haut débit, sur des extrémités racinaires ectomycorhizés, d’activités enzymatiques liées à la dégradation de la matière organique et à la mobilisation de l’azote et du phosphore du sol. L’ensemble de ces approches a permis de montrer un impact de l’essence forestière sur la nature des espèces présentes plutôt que sur la richesse taxonomique et une préférence d’hôte de certains groupes fongiques ectomycorhiziens. L’approche biochimique a montré une redondance fonctionnelle importante pour certaines activités enzymatiques tandis qu’une autre activité enzymatique était spécifique d’un groupe taxonomique fongique. / In forest soils, taxonomic richness and functional diversity of eukaryotic microorganisms (mainly Fungi) remain largely unknowned. Tree species is one of the main factors that structure eukaryotic microbial communities. We have studied the impact of tree species (beech and spruce) on taxonomic and functional diversity of these communities by using a metatranscriptomic approach and a biochemical one focusing on ectomycorrhizal fungi. We showed an effet of different sequences (18S rDNA, cDNA) on taxonomic composition of eukaryotic microbial communities and we developped anew mitochondrial molecular marker for the study of metabolically active fungal communities. Identification of ecologically and industrially important genes by the shotgun sequencing of metatranscriptomic libraries and also identification of a new family of transmembrane transporter demonstrate the great potential of the metatranscriptomic approach. The biochemical approachconsisted in a multiple enzymatic test carried out on ectomycorrhizal roots, of enzyme activities linked to organic matter degradation and phosphorus and nitrogen mobilization. All these approaches revealed an impact of tree species on the microbial species composition but not on taxonomic richness and also host preference for some ectomycorrhizal taxonomic groups. The biochemical approach showed a high functional redundancy for some enzyme activities while one activity was very specific of an ectomycorrhizal taxonomic group.

農林水産研究情報センターで作成したPDFファイルを使用している。

Abstract In plants, there are at least three types of haemoglobins (Hbs): symbiotic, non-symbiotic and truncated. Symbiotic Hbs are known to participate in nitrogen fixation, but the roles of the latter two groups are more obscure. Previous reports have connected both plant non-symbiotic and truncated Hbs to the scavenging of an important signal molecule, nitric oxide (NO). The aim of the present thesis was to study the effects of a bacterial Hb of Vitreoscilla sp. (VHb) on a woody model organism, hybrid aspen (Populus tremula x tremuloides), and the role of endogenous hybrid aspen Hbs. To store the produced hybrid aspen lines, the suitability of different cryopreservation methods was also tested. VHb-expressing hybrid aspens were generated by Agrobacterium-mediated gene transfer. The effects of VHb expression were examined in standard greenhouse conditions, under elevated UV-B light as well as during culture with ectomycorrhizal fungi. Both slow cooling and vitrification methods were applied in cryostoring samples of the different genetic backgrounds. Hybrid aspen non-symbiotic and truncated Hb genes PttHb1 and PttTrHb, respectively, were also isolated. The function of the genes and corresponding proteins PttHb1 and PttTrHb were studied using non-transgenic and VHb hybrid aspen lines as well as a mutant yeast (Saccharomyces cerevisiae) defective in NO resistance. VHb expression did not improve the general growth of hybrid aspen but resulted in enhanced starch accumulation in chloroplasts, pointing to changes in energy metabolism. Of the studied cryopreservation protocols, the slow cooling of dormant in vivo buds proved to be the most feasible way of cryostoring hybrid aspen lines. The culture with the ectomycorrhizal fungus was shown to increase the expression of both PttHb1 and PttTrHb in the roots of non-transgenic lines. However, the fungi did not up-regulate the hybrid aspen Hb genes in the VHb lines. Therefore, it is hypothesized that endogenous Hbs may contribute to the growth of roots and that VHb may compensate this function. When expressed alone in the mutant yeast, the recombinant PttHb1 and PttTrHb did not protect cells against the toxicity of NO. Subsequently, a novel mRNA transcript of the heterotrophic ferredoxin NADP+ oxidoreductase gene PtthFNR was found. The absence of a plastid presequence in the transcript suggests targeting of the encoded protein into cytosol. The coexpression of PttHb1 and cytosolic PtthFNR partially rescued the mutant yeast during NO treatment, demonstrating for the first time that plant Hb1 with an applicable reductase scavenges NO in vivo at a physiologically relevant rate. This thesis extends current knowledge about plant Hbs and the effects of VHb on a phenotype of a tree. It also provides new information about plant ferredoxin reductase genes. / Tiivistelmä Kasvihemoglobiinit jaetaan symbioottisiin, ei-symbioottisiin sekä ns. katkaistuihin eli truncated-hemoglobiineihin. Symbioottisten hemoglobiinien tiedetään osallistuvan typen sitomiseen, kun taas kahden muun ryhmän toiminta tunnetaan heikosti. Aiemmissa tutkimuksissa ei-symbioottiset ja truncated-hemoglobiinit on yhdistetty tärkeän signaalimolekyylin, typpimonoksidin (NO), haitallisuuden vähentämiseen. Tämän työn tarkoituksena oli tutkia Vitreoscilla sp. -bakteerin VHb-hemoglobiinin vaikutuksia puuvartiseen mallikasviin, hybridihaapaan (Populus tremula x tremuloides), sekä hybridihaavan omien hemoglobiinien merkitystä. Lisäksi työssä kokeiltiin eri nestetyppisäilytysmenetelmiä hybridihaapalinjojen varastoimiseksi. VHb:tä ilmentävät hybridihaavat tuotettiin Agrobacterium-välitteisellä geeninsiirrolla. VHb:n vaikutuksia tutkittiin kasvihuoneolosuhteissa, kohotetussa UV-B-säteilyssä sekä sienijuurikasvatuksen aikana. Eri linjojen nestetyppisäilytykseen sovellettiin sekä hidasta että nopeaa jäähdytystä. Tutkimuksissa myös eristettiin hybridihaavan PttHb1- ja PttTrHb-hemoglobiinigeenit. Näiden geenien sekä niiden koodaamien PttHb1- ja PttTrHb-proteiinien toimintaa tutkittiin siirtogeenittömien ja VHb-hybridihaapalinjojen sekä NO-herkän hiivamutantin (Saccharomyces cerevisiae) avulla. VHb-ilmennys ei parantanut hybridihaavan kasvua, mutta lisäsi tärkkelyksen kertymistä viherhiukkasiin, mikä viittaa muutoksiin energia-aineenvaihdunnassa. Tutkituista menetelmistä parhaiten hybridihaapalinjojen nestetyppisäilytykseen soveltui lepovaiheessa olevien in vivo -silmujen hidas jäähdytys. Toisin kuin VHb-kasveissa, sienijuurikasvatus voimisti sekä PttHb1:n että PttTrHb:n ilmenemistä siirtogeenittömien hybridihaapojen juurissa. Tästä johtuen esitettiin, että hybridihaavan hemoglobiinit voivat vaikuttaa juurien kasvuun ja VHb pystyy korvaamaan tämän toiminnon. Kun PttHb1 ja PttTrHb ilmennettiin yksin mutanttihiivassa, proteiinit eivät suojanneet soluja NO:n myrkyllisyydeltä. Tämän jälkeen työssä kuvattiin heterotrofisen ferredoksiini-NADP+-oksidoreduktaasi-geenin PtthFNR:n uusi mRNA-muoto. Plastidiin ohjaavan sekvenssin puuttuminen geenituotteesta viittaa siihen, että mRNA:n koodaama proteiini sijoittuu solulimaan. PttHb1:n ja PtthFNR:n yhtäaikainen ilmentäminen mutanttihiivassa paransi solujen elossa säilymistä NO-käsittelyn aikana, mikä osoittaa ensimmäistä kertaa, että kasvin Hb1 pystyy sopivan reduktaasin kanssa vähentämään NO-pitoisuutta elävässä eliössä. Tämä työ laajentaa tietämystä kasvihemoglobiineista sekä VHb:n vaikutuksesta puiden ilmiasuun. Työ myös lisää tietoa kasvien ferredoksiinireduktaasi-geeneistä.