Le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) est un pathogène d’importance dans l’industrie porcine et est responsable d’importantes pertes économiques. Il n’existe pas d’antiviral efficace contre celui-ci. Il a récemment été mis en évidence que le surnageant de culture d’Actinobacillus pleuropneumoniae, l’agent étiologique de la pleuropneumonie porcine, possédait une activité antivirale in vitro contre le VSRRP dans la lignée cellulaire SJPL. Les objectifs de mon projet sont (i) d’étudier les mécanismes cellulaires menant à l’activité antivirale causée par le surnageant de culture d’A. pleuropneumoniae, et (ii) de caractériser les molécules actives présentes dans le surnageant de culture d’A. pleuropneumoniae. Dans un premier temps, des analyses de protéome ont été effectuées et ont permis d’observer que le surnageant de culture modulait la régulation du cycle cellulaire. Dans le but d’analyser le cycle cellulaire des cellules SJPL, la cytométrie en flux a été utilisée et a permis de démontrer que le surnageant de culture induisait un arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M. Deux inhibiteurs de la phase G2/M ont alors été utilisé. Il s'est avéré que ces inhibiteurs avaient la capacité d’inhiber le VSRRP dans les cellules SJPL. Enfin, la spectrométrie de masse a été utilisée dans le but de caractériser les molécules actives présentes dans le surnageant de culture d’A. pleuropneumoniae et d’identifier deux molécules. Ce projet a permis de démontrer pour la première fois qu’A. pleuropneumoniae est capable de perturber le cycle cellulaire et que ce dernier était un élément important dans l’effet antiviral contre le VSRRP. / Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is the most important pathogen in the swine industry and causes important economic losses. No effective antiviral drugs against it exist. It was recently reported that the culture supernatant of Actinobacillus pleuropneumoniae, the causative agent of porcine pleuropneumonia, possesses an antiviral activity in vitro against PRRSV in SJPL cells. The objectives of this project were (i) to identify the mechanism behind the antiviral activity displayed by A. pleuropneumoniae, and (ii) to characterize the active molecules present in the culture supernatant. Proteomic analyses were first conducted and demonstrated the culture supernatant ability to induce modulations of the cell cycle regulation. In order to determine the SJPL cell cycle, flow cytometry analyses were performed and demonstrated that the culture supernatant induced a G2/M-phase cell cycle arrest. Two G2/M-phase cell cycle inhibitors were then used and their ability to inhibit PRRSV infection in SJPL cells was demonstrated. Finally, in order to characterize the active molecules present in the A. pleuropneumoniae culture supernatant, mass spectrometry was used and two molecules were identified. This is the first study demonstrating the A. pleuropneumoniae ability to disrupt cell cycle and the cell cycle importance to the inhibitory activity against PRRSV.

Dans les patients infectés par HBV, les thérapies avec les analogues de nucléos(t)ides (NAs) ou l'interféron α (IFNα) restent inefficaces pour éradiquer l'infection, à cause d'une forme persistante d'HBV, appelée l'ADN circulaire covalent clos (ADNccc), organisé comme un mini-chromosome. Notre but a été de revisiter l'activité anti-HBV d'un panel de cytokines in vitro en utilisant des hépatocytes non transformés, afin d'identifier de nouvelles options immunothérapeutiques. Parmi toutes les molécules testées, l'IFNβ, l'IFNγ, les IFNλ, le TNFα, l'IL-6, l'IL-1β et le ténofovir (ce dernier utilisé comme contrôle positif) ont montré un effet suppresseur sur la réplication d'HBV aussi fort et parfois plus fort que l'IFNα. La cytokine ayant l'effet le plus élevé sur l'ADN total d'HBV (EC50 ≈ 25 pg/mL), sans cytotoxicité, était l'interleukine-1β (IL-1β), qui est naturellement produite par les cellules de Kupffer (KC), les macrophages du foie. De façon importante, les ARNs totaux d'HBV et l'antigène sécrété HBeAg, mais pas HBsAg, ni l'ADNccc, sont fortement diminués par l'IL-1β. Nous avons donc émis l'hypothèse selon laquelle des promoteurs viraux spécifiques su l'ADNccc pourraient être inhibés, même si l'ADNccc n'est pas dégradé. Ensuite, nous avons étudié le mécanisme de l'activité antivirale de l'IL-1β. Nous avons montré que tous les promoteurs d'HBV sembleraient être inhibés par l'IL-1β. En parallèle, nous avons vérifié que l'IL-1β pouvait activer le promoteur de NF-κB, dont la fonction de transcription a été confirmée. Grâce à cette étude, l'IL-1β a été montré comme ayant un effet antiviral très efficace contre HBV in vitro, par l'intermédiaire de la fixation de NF-κB sur l'ADNccc / In HBV-infected patients, therapies with nucleos(t)ide analogues (NAs) or interferon α (IFNα) remain ineffective in eradicating the infection, because of a persistent form of HBV DNA, namely the covalently closed circular DNA (cccDNA), which is organized as a minichromosome. Our aim was to revisit the anti-HBV activity of a panel of IFNs and pro-inflammatory cytokines in vitro using nontransformed cultured hepatocytes of HBV infection, to identify new immunotherapeutic options. Amongst all molecules tested, IFNβ, IFNγ, IFNλ, TNFα, IL-6, IL-1β and tenofovir showed a suppressive effect on HBV replication at least as strong as, but sometimes stronger than IFNα. The cytokine showing the highest effect on intracellular total HBV DNA without any cytotoxicity, was interleukin-1β (IL-1β), which is naturally produced by Kupffer cells (KC), representing the macrophages of the liver. Importantly, total HBV RNAs and secreted HBeAg, but nor HBsAg, neither cccDNA, were strongly decreased. Thus, we hypothesized that even if cccDNA was not degraded, specific viral promoters on cccDNA could be silenced. Then, we investigated the mechanism of IL-1β antiviral activity. We have shown that all HBV promoters were early inhibited by IL-1β. In the meantime, we have verified that IL-1β can induce nuclear Translocation and expression of NF-κB. We also checked NF-κB functionality. Thanks to this study, IL-1β has been found to have very potent antiviral effect against HBV in vitro, through the binding of NF-κB on cccDNA

Le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) est un pathogène ayant d’énormes conséquences pour les producteurs porcins. Il est la cause d’une des maladies les plus coûteuses à l’industrie au Québec et, à ce jour, il n’y a aucun traitement efficace commercialement disponible contre le virus. Il a été précédemment démontré que le surnageant de culture de bactéries Actinobacillus pleuropneumoniae (App) - l’agent causant la pleuropneumonie porcine - possède une activité antivirale in vitro contre le VSRRP. Ces études ont déterminé que cette activité était en fait médiée par des métabolites excrétés par les bactéries d’App, résistants à la chaleur et de faible poids moléculaire. Cependant, l’identité de ces métabolites demeurait inconnue, menant ainsi aux objectifs de ce projet : (I) produire un surnageant actif d’App; (II) caractériser et identifier les métabolites actifs utilisant la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS); (III) tester et évaluer l’activité antivirale des composés purifiés. De nombreux métabolites de nucléotides de l’adénosine en haute concentration dans le surnageant d’App ont ainsi été identifiés par HRMS. Pour confirmer l’effet antiviral du surnageant et des métabolites actifs identifiés, un modèle d’infection de cellules SJPL permissives au VSRRP et de l’imagerie à immunofluorescence ont été employés. Les métabolites ont en effet montré une inhibition de la réplication du VSRRP dans les cellules et leurs mécanismes d’actions sont déjà bien répertoriés; soit l’inhibition des polymérases d’ARN cellulaire et virale par la forme de triphosphate de nucléoside, ainsi que l’arrêt de synthèse des acides nucléiques lors de la réplication virale. Cette étude propose donc de nouvelles ouvertures, basé sur les mécanismes d’actions cellulaires responsables de l’effet antiviral, pour développer des traitements préventifs contre le VSRRP / Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is one of the most devastating viruses in the swine industry. It causes major economic losses worldwide on an annual basis. To date, there has not been an effective treatment for this virus. Previous studies conducted in our group have shown that the culture supernatant of Actinobacillus pleuropneumoniae (App), the causative agent of porcine pleuropneumonia, possesses an antiviral activity in vitro against PRRSV. These studies have shown that the antiviral activity was mediated by small molecular weight, heat resistant metabolites present in the App supernatant ultrafiltrates. However, the identity of those metabolites remained unknown, which led us to the objectives of this study: (I)generate an active supernatant; (II)characterize and identify the active metabolites using high resolution mass spectrometry; (III)evaluate the antiviral activity of the purified compounds following identification. In this study we utilized a virus infection model using SJPL cells and immunofluorescence imagery to confirm the antiviral activity of the App supernatant as our first approach. Subsequently, using high resolution mass spectrometry we identified several adenosine nucleotide metabolites present in App supernatants in high concentrations. Following testing, we revealed that several adenosine nucleotide metabolites inhibit PRRSV replication in SJPL cells. Interestingly, the antiviral mechanism of action of adenosine nucleotide analogs is already known. The nucleoside triphosphate form functions by inhibiting cellular and viral RNA polymerases and during viral RNA replication, incorporates nucleoside analogs into nascent RNA chains resulting in termination of nucleic acid synthesis. This study may suggest new approaches to develop prophylactic treatment for PRRSV