6 Zusammenfassung In-vitro- und In-vivo-Studien zur Wirksamkeit von Eigelbantikörpern gegen Salmonella Enteritidis Michael Gürtler Institut für Lebensmittelhygiene der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Infektionen mit Salmonellen gehören weltweit zu den wichtigsten von Tieren auf den Menschen übertragbaren Erkrankungen. Anteilmäßig besitzen dabei die durch kontaminierte Lebensmittel, insbesondere Eier und Eiprodukte, hervorgerufenen Infektionen die größte Bedeutung. Dabei ist nach wie vor Salmonella Enteritidis (S. Enteritidis) in den Geflügelbeständen vorherrschend. Als Möglichkeit zur Bekämpfung von Salmonella-Infektionen bietet sich die passive Immunisierung der Legehennen durch orale Applikation von Eigelbantikörpern an. Bereits mehrfach wurde das Verfahren der Verabreichung von antikörperhaltigem Volleipulver zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionskrankheiten, vor allem bei Kälbern und Ferkeln, getestet. Untersuchungen über die Einsatz solcher Eigelbantikörper mit dem Ziel der Zurückdrängung von Salmonellen in Legehennenbeständen sind bisher nicht bekannt geworden. Ziel dieser Arbeit war es, im Rahmen von In-vitro- und In-vivo-Studien den Einfluss von Eigelbantikörpern auf Vermehrung und Vorkommen von S. Enteritidis bei Legehennen zu untersuchen. Im Versuchskomplex A wurde in vitro ermittelt, ob Anti-S. Enteritidis-Antikörper im Eidotter in der Lage sind, die Vermehrung von Salmonellen zu hemmen. Im Versuchskomplex B wurde untersucht, ob es gelingt, durch die orale Verabreichung von Anti-S. Enteritidis-Eigelbantikörpern die Kontaminationsrate der gelegten Eier mit Salmonellen bei experimentell infizierten Legehennen zu beeinflussen. Im Versuchskomplex C sollte geprüft werden, ob Eigelbantikörper die Fähigkeit besitzen, das Adhäsions- und Invasionsvermögen von Salmonellen an bzw. in Epithelzellen einer permanenten Zelllinie zu beeinflussen. Im Rahmen von Versuchskomplex A wurden Legehennen mit einem inaktivierten S. Enteritidis-Stamm parenteral hyperimmunisiert, um hohe Konzentrationen an Antikörpern im Dotter zu induzieren. Die Eidotter wurden mit zwei S. Enteritidis-Stämmen in drei verschiedenen Kontaminationsdosen beimpft und das Vermehrungsverhalten durch Keimzählung als Generationszeit ermittelt. Im Versuchskomplex B wurden in zwei Infektionsversuchen Anti-S. Enteritidis-Eigelbantikörper in Form von Volleipulver in einer Menge von 3 g pro Tier und Tag über das Futter an experimentell mit S. Enteritidis infizierte Legehennen verabreicht und die Ergebnisse mit denen einer Kontrollgruppe ohne Volleipulver verglichen. Die gelegten Eier wurden getrennt nach Eischale, Eiklar und Eigelb auf den Infektionsstamm untersucht. Im Versuchskomplex C wurden die Adhäsivität und Invasivität verschiedener Salmonella-Stämme an bzw. in Epithelzellen bei An- bzw. Abwesenheit von Anti-S. Enteritids-Eigelb- bzw. -Serumantikörpern unter Verwendung einer permanenten Dünndarmepithelzelllinie von der Ratte (IEC-6) nach Inkubation durch Keimzählung überprüft. Die Ergebnisse in Versuchskomplex A zeigten, dass Eigelbantikörper nicht in der Lage sind, im Eigelb befindliche Salmonellen in ihrer Vermehrung zu hemmen oder gar abzutöten. Die Infektionsversuche im Versuchskomplex B ergaben, dass bei einer Infektionsdosis von 2x109 koloniebildenden Einheiten (kbE)/Tier die Salmonella-Kontaminationsrate der Eier durch das antikörperhaltige Eipulver nicht gesichert verändert wird. Dagegen konnte beim Einsatz einer solchen von 2x108 kbE/Tier eine Wirkung des antikörperhaltigen Eipulvers auf die Kontamination der einzelnen Eikompartimente nachgewiesen werden. Dabei wurden in der Versuchsgruppe mit 13,3 % gesichert weniger Eier als positiv detektiert als in der Kontrollgruppe mit 29,4 % (p ≤ 0,001), wobei mindestens in einem der drei Kompartimente Eischale, Eiklar oder Eigelb Salmonellen nachweisbar waren. In der Versuchsgruppe wies jedes Salmonella-positive Ei auch Keime auf der Eischale auf. In der Kontrollgruppe waren mit 29,9 % signifikant mehr Eischalen positiv als in der Versuchsgruppe mit 13,3 % (p ≤ 0,001). Beim Eiklar ließ die geringe Nachweisrate sowohl in der Versuchs- als auch in der Kontrollgruppe eine statistische Beurteilung des Eipulvereinflusses nicht zu. Aus dem Eidotter wurden in der Versuchsgruppe bei 0,6 % der Eier Salmonellen isoliert, während es in der Kontrollgruppe mit 2,4 % signifikant mehr waren (p ≤ 0,05). Die Ergebnisse des Versuchskomplexes C zeigten, dass Volleiantikörper und Serumantikörper die Invasion von S. Enteritidis in intestinale Epithelzellen serovarspezifisch vermindern können. Insgesamt lassen die Ergebnisse die Schlussfolgerung zu, dass bei einer oralen Verabreichung von Volleipulver mit S. Enteritidis-spezifischen Antikörpern an Legehennen bei einer Infektionsbelastung von 2x108 kbE/Tier mit einer gesicherten Reduzierung des Vorkommens von Salmonellen im Nahrungsmittel Ei im Vergleich zu Tieren ohne Zugabe von Eipulver zu rechnen ist. / In vitro and in vivo studies on the efficiency of egg yolk antibodies against Salmonella Enteritidis Michael Gürtler Institute of Food Hygiene, Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig Infection of humans by Salmonella are among the most important zoonotic diseases. Contaminated food, especially eggs and egg products, represents the highest risk. Still Salmonella Enteritidis (S. Enteritidis) dominates, a serovar that occurs especially in poultry flocks. A possibility to combat Salmonella infection is the passive immunisation of laying hens by oral administration of egg yolk antibodies. The application of antibody-containing full-egg powder against bacterial diseases was tested previously especially on calves and piglets. The suitability of administration of egg-yolk antibodies to protect laying-hens flocks against Salmonella was not tested previously. It was the aim of the study to investigate the influence of egg-yolk antibodies of S. Enteritidis in egg laying hens by in-vivo and in-vitro studies. In part A, we investigated the influence of anti-S. antibodies in egg yolk on the multiplication of Salmonella in vitro. In part B, the impact of oral application of anti-Salmonella full-egg antibodies on the in-vivo Salmonella-contamination rate of eggs layed by experimentally infected hens was investigated. In part C the ability of egg-yolk antibodies and serum antibodies were tested with regard to the rate of adhesion and invasion of Salmonella on or in epithelial cells of a permanent cell culture line (two major pathogenic mechanisms). In part A, laying hens were hyper-immunised parenterally by an inactivated S. Enteritidis strain to induce a high concentration of antibodies in the egg yolk. Egg yolk was than inoculated with two S. Enteritidis strains in three different contamination doses. Multiplication of Salmonella cells was detected by cell counts and calculated as generation time. In part B, laying hens were immunised passively with anti-Salmonella egg yolk antibodies (by feeding 3 g of full egg powder per day and per animal) and the effects were compared with a control group without full-egg powder. The inoculation strain of S. Enteritidis was detected on egg shell, in egg white and in egg yolk separately. In part C, a suspension of S. Enteritidis was added to a permanent duodenal epithelial cell line of the rat (IEC-6). After incubation the adhesivity of Salmonella strains and their ability to invade these cells in the presence or in the absence of anti-S. Enteritidis egg yolk and serum antibodies, respectively, was detected by cell count. The results of part A demonstrated that egg-yolk antibodies are not able to inhibit multiplication of Salmonella in egg yolk. Experiments of part B showed that the Salmonella contamination rate of eggs could not be influenced by antibody-containing egg powder at a Salmonella infection dose of 2x109 colony forming units (cfu)/animal, whereas the antibody-containing egg powder at an Salmonella infection dose of 2x108 cfu/animal proved effective (i.e. contamination rate of egg components was reduced). In the experimental group 13.3 % of the eggs were Salmonella positive, which was significantly different from 29.4 % in the control group (p ≤ 0,001). At least in one of the three compartiments egg shell, egg white or egg yolk Salmonella was detectable. In the experimental group Salmonella could be isolated from the shell of every positive egg. The rate of Salmonella isolation from egg shells of the control group was significantly higher those in the experimental group (p ≤ 0,001). With regard to egg white, the low number of Salmonella detections in both groups did not allow statistical evaluation of the effect of full-egg powder. From egg yolk of the experimental group in 0.6 % of the eggs Salmonella could be isolated which was significantly lower than the detection rate in the control group with 2.4 % (p ≤ 0,05). The results of part C demonstrated that full-egg antibodies and serum antibodies can inhibit the serovar-specific invasion of S. Enteritidis into intestinal epithelial cells. As a whole, the results support the conclusion that oral administration of full-egg powder containing S. Enteritidis specific antibodies to egg-laying hens exposed to a administration of 2x108 cfu/animal reduce the occurrence of Salmonella in the egg compared to eggs of animals without egg powder administration.

6 Zusammenfassung In-vitro- und In-vivo-Studien zur Wirksamkeit von Eigelbantikörpern gegen Salmonella Enteritidis Michael Gürtler Institut für Lebensmittelhygiene der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Infektionen mit Salmonellen gehören weltweit zu den wichtigsten von Tieren auf den Menschen übertragbaren Erkrankungen. Anteilmäßig besitzen dabei die durch kontaminierte Lebensmittel, insbesondere Eier und Eiprodukte, hervorgerufenen Infektionen die größte Bedeutung. Dabei ist nach wie vor Salmonella Enteritidis (S. Enteritidis) in den Geflügelbeständen vorherrschend. Als Möglichkeit zur Bekämpfung von Salmonella-Infektionen bietet sich die passive Immunisierung der Legehennen durch orale Applikation von Eigelbantikörpern an. Bereits mehrfach wurde das Verfahren der Verabreichung von antikörperhaltigem Volleipulver zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionskrankheiten, vor allem bei Kälbern und Ferkeln, getestet. Untersuchungen über die Einsatz solcher Eigelbantikörper mit dem Ziel der Zurückdrängung von Salmonellen in Legehennenbeständen sind bisher nicht bekannt geworden. Ziel dieser Arbeit war es, im Rahmen von In-vitro- und In-vivo-Studien den Einfluss von Eigelbantikörpern auf Vermehrung und Vorkommen von S. Enteritidis bei Legehennen zu untersuchen. Im Versuchskomplex A wurde in vitro ermittelt, ob Anti-S. Enteritidis-Antikörper im Eidotter in der Lage sind, die Vermehrung von Salmonellen zu hemmen. Im Versuchskomplex B wurde untersucht, ob es gelingt, durch die orale Verabreichung von Anti-S. Enteritidis-Eigelbantikörpern die Kontaminationsrate der gelegten Eier mit Salmonellen bei experimentell infizierten Legehennen zu beeinflussen. Im Versuchskomplex C sollte geprüft werden, ob Eigelbantikörper die Fähigkeit besitzen, das Adhäsions- und Invasionsvermögen von Salmonellen an bzw. in Epithelzellen einer permanenten Zelllinie zu beeinflussen. Im Rahmen von Versuchskomplex A wurden Legehennen mit einem inaktivierten S. Enteritidis-Stamm parenteral hyperimmunisiert, um hohe Konzentrationen an Antikörpern im Dotter zu induzieren. Die Eidotter wurden mit zwei S. Enteritidis-Stämmen in drei verschiedenen Kontaminationsdosen beimpft und das Vermehrungsverhalten durch Keimzählung als Generationszeit ermittelt. Im Versuchskomplex B wurden in zwei Infektionsversuchen Anti-S. Enteritidis-Eigelbantikörper in Form von Volleipulver in einer Menge von 3 g pro Tier und Tag über das Futter an experimentell mit S. Enteritidis infizierte Legehennen verabreicht und die Ergebnisse mit denen einer Kontrollgruppe ohne Volleipulver verglichen. Die gelegten Eier wurden getrennt nach Eischale, Eiklar und Eigelb auf den Infektionsstamm untersucht. Im Versuchskomplex C wurden die Adhäsivität und Invasivität verschiedener Salmonella-Stämme an bzw. in Epithelzellen bei An- bzw. Abwesenheit von Anti-S. Enteritids-Eigelb- bzw. -Serumantikörpern unter Verwendung einer permanenten Dünndarmepithelzelllinie von der Ratte (IEC-6) nach Inkubation durch Keimzählung überprüft. Die Ergebnisse in Versuchskomplex A zeigten, dass Eigelbantikörper nicht in der Lage sind, im Eigelb befindliche Salmonellen in ihrer Vermehrung zu hemmen oder gar abzutöten. Die Infektionsversuche im Versuchskomplex B ergaben, dass bei einer Infektionsdosis von 2x109 koloniebildenden Einheiten (kbE)/Tier die Salmonella-Kontaminationsrate der Eier durch das antikörperhaltige Eipulver nicht gesichert verändert wird. Dagegen konnte beim Einsatz einer solchen von 2x108 kbE/Tier eine Wirkung des antikörperhaltigen Eipulvers auf die Kontamination der einzelnen Eikompartimente nachgewiesen werden. Dabei wurden in der Versuchsgruppe mit 13,3 % gesichert weniger Eier als positiv detektiert als in der Kontrollgruppe mit 29,4 % (p ≤ 0,001), wobei mindestens in einem der drei Kompartimente Eischale, Eiklar oder Eigelb Salmonellen nachweisbar waren. In der Versuchsgruppe wies jedes Salmonella-positive Ei auch Keime auf der Eischale auf. In der Kontrollgruppe waren mit 29,9 % signifikant mehr Eischalen positiv als in der Versuchsgruppe mit 13,3 % (p ≤ 0,001). Beim Eiklar ließ die geringe Nachweisrate sowohl in der Versuchs- als auch in der Kontrollgruppe eine statistische Beurteilung des Eipulvereinflusses nicht zu. Aus dem Eidotter wurden in der Versuchsgruppe bei 0,6 % der Eier Salmonellen isoliert, während es in der Kontrollgruppe mit 2,4 % signifikant mehr waren (p ≤ 0,05). Die Ergebnisse des Versuchskomplexes C zeigten, dass Volleiantikörper und Serumantikörper die Invasion von S. Enteritidis in intestinale Epithelzellen serovarspezifisch vermindern können. Insgesamt lassen die Ergebnisse die Schlussfolgerung zu, dass bei einer oralen Verabreichung von Volleipulver mit S. Enteritidis-spezifischen Antikörpern an Legehennen bei einer Infektionsbelastung von 2x108 kbE/Tier mit einer gesicherten Reduzierung des Vorkommens von Salmonellen im Nahrungsmittel Ei im Vergleich zu Tieren ohne Zugabe von Eipulver zu rechnen ist. / In vitro and in vivo studies on the efficiency of egg yolk antibodies against Salmonella Enteritidis Michael Gürtler Institute of Food Hygiene, Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig Infection of humans by Salmonella are among the most important zoonotic diseases. Contaminated food, especially eggs and egg products, represents the highest risk. Still Salmonella Enteritidis (S. Enteritidis) dominates, a serovar that occurs especially in poultry flocks. A possibility to combat Salmonella infection is the passive immunisation of laying hens by oral administration of egg yolk antibodies. The application of antibody-containing full-egg powder against bacterial diseases was tested previously especially on calves and piglets. The suitability of administration of egg-yolk antibodies to protect laying-hens flocks against Salmonella was not tested previously. It was the aim of the study to investigate the influence of egg-yolk antibodies of S. Enteritidis in egg laying hens by in-vivo and in-vitro studies. In part A, we investigated the influence of anti-S. antibodies in egg yolk on the multiplication of Salmonella in vitro. In part B, the impact of oral application of anti-Salmonella full-egg antibodies on the in-vivo Salmonella-contamination rate of eggs layed by experimentally infected hens was investigated. In part C the ability of egg-yolk antibodies and serum antibodies were tested with regard to the rate of adhesion and invasion of Salmonella on or in epithelial cells of a permanent cell culture line (two major pathogenic mechanisms). In part A, laying hens were hyper-immunised parenterally by an inactivated S. Enteritidis strain to induce a high concentration of antibodies in the egg yolk. Egg yolk was than inoculated with two S. Enteritidis strains in three different contamination doses. Multiplication of Salmonella cells was detected by cell counts and calculated as generation time. In part B, laying hens were immunised passively with anti-Salmonella egg yolk antibodies (by feeding 3 g of full egg powder per day and per animal) and the effects were compared with a control group without full-egg powder. The inoculation strain of S. Enteritidis was detected on egg shell, in egg white and in egg yolk separately. In part C, a suspension of S. Enteritidis was added to a permanent duodenal epithelial cell line of the rat (IEC-6). After incubation the adhesivity of Salmonella strains and their ability to invade these cells in the presence or in the absence of anti-S. Enteritidis egg yolk and serum antibodies, respectively, was detected by cell count. The results of part A demonstrated that egg-yolk antibodies are not able to inhibit multiplication of Salmonella in egg yolk. Experiments of part B showed that the Salmonella contamination rate of eggs could not be influenced by antibody-containing egg powder at a Salmonella infection dose of 2x109 colony forming units (cfu)/animal, whereas the antibody-containing egg powder at an Salmonella infection dose of 2x108 cfu/animal proved effective (i.e. contamination rate of egg components was reduced). In the experimental group 13.3 % of the eggs were Salmonella positive, which was significantly different from 29.4 % in the control group (p ≤ 0,001). At least in one of the three compartiments egg shell, egg white or egg yolk Salmonella was detectable. In the experimental group Salmonella could be isolated from the shell of every positive egg. The rate of Salmonella isolation from egg shells of the control group was significantly higher those in the experimental group (p ≤ 0,001). With regard to egg white, the low number of Salmonella detections in both groups did not allow statistical evaluation of the effect of full-egg powder. From egg yolk of the experimental group in 0.6 % of the eggs Salmonella could be isolated which was significantly lower than the detection rate in the control group with 2.4 % (p ≤ 0,05). The results of part C demonstrated that full-egg antibodies and serum antibodies can inhibit the serovar-specific invasion of S. Enteritidis into intestinal epithelial cells. As a whole, the results support the conclusion that oral administration of full-egg powder containing S. Enteritidis specific antibodies to egg-laying hens exposed to a administration of 2x108 cfu/animal reduce the occurrence of Salmonella in the egg compared to eggs of animals without egg powder administration.