Os neutrófilos representam a primeira linha de defesa do organismo contra microrganismos invasores, células infectadas com vírus e células tumorais. Em seres humanos saudáveis eles constituem a população de células brancas mais abundantes do sangue. O reconhecimento de componentes microbianos por neutrófilos desencadeia a fagocitose, geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) e liberação de proteínas granulares, tais como mieloperoxidase (MPO) e elastase (NE). Essas EROs e enzimas agem como agentes microbicidas e contribuem para os processos inflamatórios. Em trabalho anterior constatamos um aumento da atividade do sistema NADPH oxidase fagocítico (NOX2) e da geração de EROs por neutrófilos de ratos diabéticos e não diabéticos tratados com aminoguanidina (AG), um conhecido inibidor da formação de produtos finais de glicação avançada (AGEs), que culminou num aumento da atividade microbicida destas células. Nosso objetivo é elucidar o mecanismo de ação pelo qual a AG está atuando no nosso modelo. Desta forma, neste trabalho, avaliamos a hipótese que a AG estaria estimulando a degranulação de neutrófilos, portanto, estudamos a modulação da MPO e da NE, principais enzimas presentes nos grânulos azurófilos de neutrófilos. Para isso, utilizamos neutrófilos humanos isolados a partir de sangue periférico colhido por punção venosa de voluntários sadios. Os neutrófilos foram incubados ou não com AG 0,5 mM por um período de 18 horas em estufa de cultivo celular. A atividade de MPO foi avaliada através da formação de HOCl e através de quimiluminescência amplificada por luminol. A atividade de NE foi avaliada através da formação do produto da reação p-nitroanilida, por espectrofotometria. Avaliamos também a expressão da MPO e NE por Western blotting e imunomarcação. Como controle das reações foi utlizado inibidor de MPO (azida) e de NE (inibidor de tripsina de glycine max (soybean) - (STI)). O isolamento de neutrófilos permitiu obter uma população celular com mais de 95% de neutrófilos, com viabilidade superior a 99%. Nossos resultados mostraram que a AG não foi capaz de influenciar a atividade de cloração e basal da MPO, porém, observamos um aumento de ERO pelo tratamento com a AG após estímulo. Vimos também que a atividade de NE permaneceu inalterada pelo tratamento com a AG. Além disso, a AG não interferiu na expressão e distruibuição da MPO e NE. Estes resultados em conjunto nos levam a sugerir que a AG não influencia diretamente no processo de degranulação de neutrófilos, uma vez que este processo é um mecanismo utilizado por fagócitos com o propósito de criar um ambiente totalmente hostil para patógenos invasores. Aparentemente, o aumento da atividade microbicida de neutrófilos tratados com AG, não é via NE ou MPO na atividade clássica desta enzima, ou seja, na produção de HOCl. Entretanto, vimos uma resposta importante na atividade de MPO, que nos permite propor várias atividades para esta enzima, ora como uma atividade oxidativa que pode contribuir para o killing, ora como uma atividade antioxidante e desta forma pode proteger outras proteínas granulares antimicrobianas dos danos oxidativos. / Neutrophils represent the organism´s first line of defense against invading microorganisms, infected cells with viruses and tumor cells. In healthy humans, they constitute the most abundant population of white blood cells. The recognition of microbial components by neutrophils initiate phagocytosis, generation of reactive oxygen species (ROS) and release of granular proteins, such as myeloperoxidase (MPO) and elastase (NE). These ROS and enzymes act as microbicidal agents and contribute to the inflammatory processes. In a previous study, we found an increase in phagocyte NADPH oxidase system activity (NOX2) and generation of ROS by neutrophils of diabetic rats and non-diabetics treated with aminoguanidine (AG), a known inhibitor of the formation of advanced glycation end products (AGEs), which resulted in an increased microbicidal activity of these cells. Our aim is to elucidate the mechanism of action by which AG is acting in our model. This way, this study evaluated the hypothesis that AG would be stimulating degranulation of neutrophils, therefore, we studied the modulation of MPO and NE, the main enzymes present in azurophilic granules of neutrophils. For this, we used human neutrophils isolated from peripheral blood collected by venipuncture from healthy volunteers. Neutrophils were incubated or not with AG 0,5 mM for a 18 hour period in cell culture incubator. MPO activity was evaluated through the formation of HOCl and luminol-amplified chemiluminescence. NE activity was evaluated through the formation of the product of p-nitroanilide reaction, by spectrophotometry. We also evaluated the expression of MPO and NE by western blotting and immunostaining. As control of reactions was used inibitor of MPO (azide) and of NE (trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) - (STI)). The neutrophil isolation allowed the achievement of a cell population with over 95% of neutrophils, with viability greater than 99%. Our results showed that AG was not capable of influencing the chlorination and basal activity of MPO, however, an increase of ROS by the treatment with AG after stimulation was noted. We also noted that NE activity remained unaltered by the treatment with AG. In addition, AG did not affect expression and distribution of MPO and NE. These results together lead us to suggest that AG does not influence directly the process of neutrophils degranulation, as this process is a mechanism used by phagocytes in order to create a fully hostile environment for invading pathogens. Apparently, the increase of microbicidal activity of neutrophils treated with AG is not via NE or MPO in the classical activity of this enzyme, in other words, in the production of HOCl. However, we observed a significant response in MPO activity, allowing us to propose various activities for this enzyme, either as a oxidative activity that can contribute to the killing or as an antioxidant activity, and therefore may protect other antimicrobial granular proteins from oxidative damage. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Introdução: As proteinases tem um papel importante no desenvolvimento, na destruição tecidual e na produção de muco causada pela DPOC. O inibidor de proteinase de origem vegetal Enterolobium contortisiliquum Tripsin Inhibitor (EcTI) inibe tanto as proteinases da classe serina quanto da classe cisteína. Objetivos: Avaliar os efeitos do tratamento com EcTI nas alterações pulmonares induzidas pela elastase em camundongos. Métodos: Camundongos C57Bl6 receberam elastase via intratraqueal (50 uL/animal, grupo ELA) ou salina (grupo SAL). Os camundongos foram tratados com EcTI (2mg/kg) nos dias 1, 15 e 21 após a instilação de elastase (grupo ELA-EcTI) ou salina (grupo SAL-EcTI). No dia 28 do protocolo, os animais foram anestesiados, a mecânica pulmonar foi medida e o óxido nítrico exalado coletado. Posteriormente, foi realizado o lavado broncoalveolar e os pulmões foram removidos para a preparação de lâminas de histoquímica e imunohistoquímica. Por meio de morfometria analisamos o número de células positivas para neutrófilos, TNF-alfa, MMP-9, MMP-12, TIMP-1, iNOS, eNOS assim como a fração de volume de 8-iso-PGF2alfa, fibras colágenas e elásticas, nos septos alveolares e nas vias aéreas. Também foram avaliados o número de células positivas para macrófagos nos septos alveolares e MUC5ac nas vias aéreas. Resultados: O inibidor de proteinase EcTI reduziu as alterações de mecânica pulmonar (Ers, Htis e Raw), destruição do septo alveolar (Lm) e o número de células no lavado broncoalveolar (células totais, macrófagos, neutrófilos, linfócitos e eosinógilos) induzidos pela elastase. Em relação a resposta inflamatória, o EcTI reduziu o número de neutrófilos e de células TNFalfa positivas no septo alveolar e nas vias aéreas além de reduzir o número de macrófagos no septo alveolar. Considerando o remodelamento de matriz extracelular, o inibidor de proteinase atenuou a fração de volume de fibras colágenas e o número de células MMP-9 e MMP-12 positivas nos septos alveolares e nas vias aéreas. Além disso, nas vias aéreas ocorreu uma atenuação da fração de volume de fibras elásticas, e nos septos alveolares uma atenuação da quantidade de células que expressam TIMP-1. Em relação a resposta de estresse oxidativo, o EcTI reduziu a fração de volume de isoprostano e o número de células iNOS e eNOS positivas tanto nos septos alveolares quanto nas vias aéreas. O EcTI também reduziu o número de células MUC5ac positivas nas vias aéreas. Conclusões: O tratamento como inibidor EcTI modulou a mecânica pulmonar e reduziu as alterações inflamatórias, de remodelamento e de estresse oxidativo induzidas pela elastase intratraqueal. Embora sejam necessários mais estudos para elucidar os mecanismos envolvidos neste processo, o inibidor de proteinase EcTI pode ser considerado como um potencial instrumento terapêutico para o tratamento da DPOC / Background: Proteinases play a key role on emphysema development, tissue destruction and mucus production. Enterolobium contortisiliquum Tripsin Inhibitor (EcTI) is a proteinase inhibitor from plant that neutralizes serine and cysteine proteinases. Aims: To evaluated the effects of the EcTI treatment in pulmonary alterations induced by elastase in mice. Methods: C57Bl6 mice received elastase intratracheally (50 uL/animal, ELA group) or saline (SAL group). Afterwards, mice were treated with EcTI (2 mg/kg) at days 1, 15 and 21 after elastase instillation (ELA-EcTI group). Control group received saline and EcTI using the same protocol (SAL-EcTI group). At day 28, mice were anesthetized, respiratory mechanics were collected, and exhaled nitric oxide were analyzed. Afterwards, broncoalveolar lavage fluid was obtained and lungs were removed to perform histochemistry and immunohistochemistry stains. By morphometry, the number of neutrophils, TNF-alfa, MMP-9, MMP-12, TIMP-1, iNOS, eNOS positive cells as well as the volume proportion of 8-iso-PGF2alfa, collagen and elastic fibers content in alveolar septum and airways walls were performed. In airways walls, we also analyzed the number of MUC-5 positive cells and the number of macrophages. Results: The proteinase inhibitor EcTI was able to reduce the pulmonary mechanical alterations (Ers, Htis and Raw), alveolar septum disruption (Lm) and the BAL cell count (total cells, macrophages, neutrophils, lymphocytes and eosinophils) induced by elastase. Regarding the inflammatory response, EcTI also reduced the number of neutrophils and TNFalfa positive cells in both alveolar septum and airway walls, and also reduced the number of macrophages in alveolar septum. Considering the extracellular matrix remodeling, the proteinase inhibitor attenuated the volume fraction of collagen fibers, MMP-9 and MMP-12 positive cells in both alveolar septum and airway walls. Besides, in airway there were attenuation in the volume fraction of elastic fibers, and in the alveolar septa a decrease of the amount of the cells expressing TIMP-1. Regarding the oxidative stress response, EcTI reduced the volume fraction of isoprostane and the number of iNOS and eNOS positive cells in both airways walls and alveolar septa, Finally, EcTI reduced the number of MUC5ac positive cells in airway walls. Conclusions: The treatment with EcTI modulated lung mechanics and reduced inflammatory, remodeling and oxidative stress alterations induced by elastase. Although more studies need to be performed to elucidate the mechanisms involved in this process, we may considerate EcTI as a potential therapeutic tool for COPD management

Introdução: As proteinases tem um papel importante no desenvolvimento, na destruição tecidual e na produção de muco causada pela DPOC. O inibidor de proteinase de origem vegetal Enterolobium contortisiliquum Tripsin Inhibitor (EcTI) inibe tanto as proteinases da classe serina quanto da classe cisteína. Objetivos: Avaliar os efeitos do tratamento com EcTI nas alterações pulmonares induzidas pela elastase em camundongos. Métodos: Camundongos C57Bl6 receberam elastase via intratraqueal (50 uL/animal, grupo ELA) ou salina (grupo SAL). Os camundongos foram tratados com EcTI (2mg/kg) nos dias 1, 15 e 21 após a instilação de elastase (grupo ELA-EcTI) ou salina (grupo SAL-EcTI). No dia 28 do protocolo, os animais foram anestesiados, a mecânica pulmonar foi medida e o óxido nítrico exalado coletado. Posteriormente, foi realizado o lavado broncoalveolar e os pulmões foram removidos para a preparação de lâminas de histoquímica e imunohistoquímica. Por meio de morfometria analisamos o número de células positivas para neutrófilos, TNF-alfa, MMP-9, MMP-12, TIMP-1, iNOS, eNOS assim como a fração de volume de 8-iso-PGF2alfa, fibras colágenas e elásticas, nos septos alveolares e nas vias aéreas. Também foram avaliados o número de células positivas para macrófagos nos septos alveolares e MUC5ac nas vias aéreas. Resultados: O inibidor de proteinase EcTI reduziu as alterações de mecânica pulmonar (Ers, Htis e Raw), destruição do septo alveolar (Lm) e o número de células no lavado broncoalveolar (células totais, macrófagos, neutrófilos, linfócitos e eosinógilos) induzidos pela elastase. Em relação a resposta inflamatória, o EcTI reduziu o número de neutrófilos e de células TNFalfa positivas no septo alveolar e nas vias aéreas além de reduzir o número de macrófagos no septo alveolar. Considerando o remodelamento de matriz extracelular, o inibidor de proteinase atenuou a fração de volume de fibras colágenas e o número de células MMP-9 e MMP-12 positivas nos septos alveolares e nas vias aéreas. Além disso, nas vias aéreas ocorreu uma atenuação da fração de volume de fibras elásticas, e nos septos alveolares uma atenuação da quantidade de células que expressam TIMP-1. Em relação a resposta de estresse oxidativo, o EcTI reduziu a fração de volume de isoprostano e o número de células iNOS e eNOS positivas tanto nos septos alveolares quanto nas vias aéreas. O EcTI também reduziu o número de células MUC5ac positivas nas vias aéreas. Conclusões: O tratamento como inibidor EcTI modulou a mecânica pulmonar e reduziu as alterações inflamatórias, de remodelamento e de estresse oxidativo induzidas pela elastase intratraqueal. Embora sejam necessários mais estudos para elucidar os mecanismos envolvidos neste processo, o inibidor de proteinase EcTI pode ser considerado como um potencial instrumento terapêutico para o tratamento da DPOC / Background: Proteinases play a key role on emphysema development, tissue destruction and mucus production. Enterolobium contortisiliquum Tripsin Inhibitor (EcTI) is a proteinase inhibitor from plant that neutralizes serine and cysteine proteinases. Aims: To evaluated the effects of the EcTI treatment in pulmonary alterations induced by elastase in mice. Methods: C57Bl6 mice received elastase intratracheally (50 uL/animal, ELA group) or saline (SAL group). Afterwards, mice were treated with EcTI (2 mg/kg) at days 1, 15 and 21 after elastase instillation (ELA-EcTI group). Control group received saline and EcTI using the same protocol (SAL-EcTI group). At day 28, mice were anesthetized, respiratory mechanics were collected, and exhaled nitric oxide were analyzed. Afterwards, broncoalveolar lavage fluid was obtained and lungs were removed to perform histochemistry and immunohistochemistry stains. By morphometry, the number of neutrophils, TNF-alfa, MMP-9, MMP-12, TIMP-1, iNOS, eNOS positive cells as well as the volume proportion of 8-iso-PGF2alfa, collagen and elastic fibers content in alveolar septum and airways walls were performed. In airways walls, we also analyzed the number of MUC-5 positive cells and the number of macrophages. Results: The proteinase inhibitor EcTI was able to reduce the pulmonary mechanical alterations (Ers, Htis and Raw), alveolar septum disruption (Lm) and the BAL cell count (total cells, macrophages, neutrophils, lymphocytes and eosinophils) induced by elastase. Regarding the inflammatory response, EcTI also reduced the number of neutrophils and TNFalfa positive cells in both alveolar septum and airway walls, and also reduced the number of macrophages in alveolar septum. Considering the extracellular matrix remodeling, the proteinase inhibitor attenuated the volume fraction of collagen fibers, MMP-9 and MMP-12 positive cells in both alveolar septum and airway walls. Besides, in airway there were attenuation in the volume fraction of elastic fibers, and in the alveolar septa a decrease of the amount of the cells expressing TIMP-1. Regarding the oxidative stress response, EcTI reduced the volume fraction of isoprostane and the number of iNOS and eNOS positive cells in both airways walls and alveolar septa, Finally, EcTI reduced the number of MUC5ac positive cells in airway walls. Conclusions: The treatment with EcTI modulated lung mechanics and reduced inflammatory, remodeling and oxidative stress alterations induced by elastase. Although more studies need to be performed to elucidate the mechanisms involved in this process, we may considerate EcTI as a potential therapeutic tool for COPD management