Transposable elements are DNA sequences that can change their location within the genome and can be found in almost all organisms. The mariner transposable element belongs to Class II, Tc1-mariner superfamily. An inactive insertion of this element in the gene white (w+) located on the X chromosome, causes a phenotypic change in color's eyes becoming them a peach color in the place of the wild coloration, being for this reason called whitepeach (wpch). Crossing of mutant females with males obtained from nature, an offspring with eyes the color of peach or variegated with spots of wild color is formed enabling estimate transposicional activity in natural populations. From the use of this system, several studies have been performed to understand if the number of copies and the activity of the mariner element are involved with environmental factors, historical and/or populational. In this study, the existence of intrapopulation variability of D. simulans collected in two places at Santa Maria (RS) city was investigated by crossing with a line of D. simulans wpch. Moreover, data on another species, D. melanogaster, were also obtained and analyzed: interspecific crosses generated progeny with variegation. The isolines that showed these properties were studied using of molecular research tools, such as PCR, cloning and sequencing, it was also necessary. The results suggest the existence of intrapopulation variability in D. simulans and indicate the discovery of sequences very similar to the element mariner in the genome of natural populations of D. melanogaster. / Os elementos transponíveis são seqüências de DNA capazes de alterar sua localização dentro do genoma e podem ser encontrados em praticamente todos os organismos. O elemento transponível mariner pertence à classe II, superfamília Tc1-mariner. Uma inserção inativa deste elemento no gene white (w+) localizado no cromossomo X de Drosophila simulans, causa uma alteração fenotípica na cor dos olhos tornando-os cor de pêssego no lugar da coloração selvagem, sendo por este motivo denominada white-peach (wpch). Do cruzamento de fêmeas mutantes com machos coletados na natureza, uma prole com olhos cor de pêssego ou variegados com pontos de coloração selvagem é formada, possibilitando estimar a atividade transposicional em populações naturais. A partir do uso deste sistema, diversos estudos têm sido realizados para compreender se o número de cópias e a atividade do elemento mariner estão envolvidos com fatores ambientais, históricos e/ou populacionais. Neste trabalho, a existência de variabilidade intrapopulacional de D. simulans coletadas em dois pontos da cidade de Santa Maria RS foi investigada através de cruzamentos com uma linhagem de D. simulans wpch. Além disso, dados sobre uma outra espécie, D. melanogaster, também foram obtidos e analisados: cruzamentos interespecíficos que geraram descendência com variegação fez com que o uso de ferramentas de pesquisa molecular, como PCR, clonagem e seqüenciamento, também fossem necessárias. Os resultados obtidos sugerem a existência de variabilidade intrapopulacional em D. simulans e indicam a descoberta de seqüências semelhantes ao elemento mariner no genoma de populações naturais de D. melanogaster.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 482532 bytes, checksum: 1c1dce279e9ef945c0bd479992a99516 (MD5) Previous issue date: 2009-02-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The hemibiothrophic basidiomycete Moniliophthora perniciosa, the causal agent of witche's broom disease in cocoa (Theobroma cacao), presents different transposable elements in its genome. A transposable element of Class II belonging to the super-family PIF/Harbinger, named Boto, had been partially characterized in previous studies. The element Boto, as well as other elements PIF/Harbinger, presents two ORFs (ORF 1 and ORF 2). OFR 2 codifies the transposase while ORF 1 codifies one protein which function is unknown. The aim of this work was to prove the Boto element activity and characterize the ORF 1. For assure the activity of the transposable element Boto in the genome of M pernicious was carried out the evaluation of the integration profile in isolates resultants of sexual cycle. Three of such isolates showed variation in the copy number of transposable element Boto, proving Boto activity. Furthermore, PCR reactions were carried out for detection of insertion sites of this element in different isolates. Among the 28 isolates used in this experiment, 14 showed amplification products with expected size. The products of amplification of two isolates, randomly chosen, were cloned and sequenced. The analysis of the obtained sequences showed that in both isolated sequenced the element Boto did not transpose for the insertion site analyzed in the M. perniciosa genome. It proves the activity of this element in the genome of M. perciciosa, because, in the isolated used as reference for this study, the Boto element was inserted in that position. In the in silico analysis of the ORF 1 sequence, the presence of two possible introns was verified, one containing 55 pb and another 48 pb. This sequence codifies a protein of 422 amino acids residues. To demonstrate the presence of the two introns, experiments of RT-PCR were carried out using two oligonucleotides groups. Amplified products obtained, when cDNA was used as template of PCR reaction, were cloned and sequenced, being confirmed the position and the size of the two predicted introns. Analysis of RT-PCR also showed that this ORF is expressed even in normal conditions of cultivation of the fungi, what is important for activity of this element, since other studies showed that the expression of this ORF is fundamental to the transposition of elements PIF/Harbinger. The results of this work showed that Boto is active in the M. perniciosa genome and it can have an important role as generating agent of genetic variability in this phytopathogen. It is worth to emphasize that this is the first description of an element of the superfamily PIF/Harbinger that presents two introns in ORF 1. / O basidiomiceto hemibiotrófico Moniliophthora perniciosa, agente causal da vassoura-de-bruxa no cacaueiro (Theobroma cacao) apresenta diferentes elementos transponíveis em seu genoma. Um elemento transponível da Classe II pertencente à superfamília PIF/Harbinger, denominado Boto, foi parcialmente caracterizado em estudos anteriores. O elemento Boto, assim como os demais elementos PIF/Harbinger, apresenta duas ORFs (Open Reading Frame), uma que codifica a transposase e outra, denominada ORF 1, cuja seqüência de aminoácidos deduzida representa uma proteína de função é desconhecida. Este trabalho foi conduzido com o objetivo de comprovar a atividade de Boto e caracterizar a ORF 1. Para a confirmação da atividade do elemento transponível Boto no genoma de M. perniciosa realizou-se a avaliação do perfil de integração em isolados resultantes do ciclo sexual, isto é, obtidos a partir da germinação de basidiósporos. Três isolados apresentaram variação no número de cópias, demonstrando a atividade de Boto. Foi realizado PCR para detecção dos sítios de inserção deste elemento em diferentes isolados. Dentre os 28 isolados utilizados no experimento, 14 apresentaram produtos de amplificação com o tamanho esperado. Os produtos de amplificação de dois isolados, escolhidos aleatoriamente, foram clonados e seqüenciados. Na análise das seqüências obtidas, verificou-se que, em ambos os isolados sequenciados, o elemento Boto provavelmente não sofreu transposição para os sítios analisados no genoma de M. perniciosa. Isto comprova a atividade deste elemento, pois, no isolado usado como referência para este estudo, o elemento Boto estava inserido naquela posição. Na análise da seqüência da ORF 1, verificou-se a presença de dois possíveis íntrons, um contendo 55 pb e outro de 48 pb. Esta seqüência codifica uma proteína de 422 resíduos de aminoácidos. Para comprovar a presença dos íntrons, experimentos de RT-PCR foram realizados com a utilização de dois conjuntos de oligonucleotídeos. Os amplificados obtidos, quando cDNA foi utilizado como molde da reação de PCR, foram clonados e sequenciados, sendo confirmada a posição e o tamanho dos dois íntrons preditos. Análise de RT-PCR mostrou que esta ORF é expressa mesmo em condições normais de cultivo do fungo, o que é importante para atividade deste elemento, visto que outros estudos mostram que a expressão desta ORF é fundamental à transposição de elementos PIF/Harbinger. Os resultados deste trabalho mostram que Boto é ativo no genoma de M. perniciosa e pode ter um importante papel como agente gerador de variabilidade genética neste fitopatógeno. Vale ressaltar que esta é a primeira descrição de um elemento da superfamília PIF/Harbinger que apresenta dois íntrons na ORF 1.