Orientador: Fernanda C. Landim Alvarenga / Banca: Maria Denise Lopes / Banca: Mayra Elena Ortiz D'Avila Assumpção / Resumo: O objetivo deste estudo foi aprimorar os protocolos de produção in vitro de embriões e de ativação partenogenética visando o isolamento e o cultivo de células tronco embrionárias felinas. Os CCOs-I foram obtidos a partir de ovários de gatas adultas e maturados in vitro. No experimento I, os CCOS foram fecundados e os embriões cultivados nos meios SOFaa e FOC. Foram comparadas as taxas de clivagem e a produção de blastocistos. A análise estatística foi realizada por meio da análise de variância e a viabilidade embrionária foi avaliada por sondas fluorescentes (Hoechst e iodeto de propídio). Não houve diferenças significativas entre os meios de cultivo, os quais apresentaram taxas de clivagem de 50,5±9,47 e 63,75±5,9 (P>0,05) e de produção de blastocistos em relação ao total de oócitos fecundados de 18±5,07 e 33,2±3,71 (P>0,05) para FOC e SOF respectivamente. No experimento II, os CCOs maturos foram submetidos a três diferentes protocolos de ativação partenogenética: 1-ionomicina associada ao cicloheximide; 2-ionomicina associada ao roscovitine e 3-ionomicina associada ao estrôncio, os quais foram comparados entre si e ao controle quanto às taxas de ativação, clivagem e desenvolvimento embrionário, sendo cultivados em SOFaa por 72 horas após a ativação. Para tais avaliações, oócitos e embriões foram corados com Hoechst 33342 e examinados em microscópio invertido. Como análise estatística foi utilizado o teste qui-quadrado. Não houve diferença significativa entre os tratamentos quanto à taxa de oócitos ativados (69,9%, 76,6% e 64,6%, para tratamento 1, 2 e 3 respectivamente) (P>0,05) nem quanto às taxas de clivagem (46,6%, 46,73% e 32,32%, para tratamento 1, 2 e 3 respectivamente) (P>0,05), mas sim entre estes e o controle (36% e 12%, respectivamente, para taxa de oócitos ativados e taxas de clivagem) (P<0,05). Quanto ao desenvolvimento... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of this study was to improve the existent protocols for in vitro embryos production and parthenogenetic activation in cats, aiming the isolation and culture of feline embryonic stem cells. COCs-I were collected from adult queens's ovaries and matured in vitro. In the experiment I, COCs were fertilized and embryos cultured in two culture media, SOFaa and FOC. In both media the cleavage rate and blastocysts production were compared. Fluorescents probes (Hoechst and propidium iodide) were utilized to estimate embryo viability. The statistical analysis was realized through the ANOVA. No statistical difference was observed between culture media. The cleavage rates considering the total number of fertilized oocytes were 50.5±9.47 and 63.75±5.9 (P>0.05) for FOC and SOF medium respectively. Similarly, the blastocysts production rates were 18±5.07 and 33.2±3.71 (P>0.05) for FOC and SOF, respectively. In experiment II matured COCs were submitted to three parthenogenetic activation protocols: 1- ionomycin associated to cycloheximide; 2 - ionomycin associated to roscovitine; 3 - ionomycin associated to strontium. The treatments were compared among themselves and among them and the control concerning chromatin decondensation, cleavage and embryo development rates. The parthenogenetic embryos were then cultured in SOFaa during 72 hours. To estimate chromatin status and number of nuclei, oocytes and embryos were stained with Hoechst 33342 and examined under an inverted fluorescent microscope. As statistical analyses chi-square test was utilized. No statistical difference was observed among treatments concerning activated oocytes rates (69.9%, 76.6% e 64.6%, respectively, for treatment 1, 2 and 3) (P>0.05) neither cleavage rates (46.6%, 46.73% e 32.32%, respectively, for treatment 1, treatment 1, 2, 3) (P>0.05). However, statistical difference was observed among treatments and... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Banca: Lígia Veiga Pereira / Banca: Irina Kerkis / Resumo: O estudo dos processos de diferenciação em células tronco embrionárias (CTE) representa uma importante ferramenta para o entendimento das vias moleculares que os regem, apresentando grande aplicação tanto na ciência básica quanto na engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Pouco é conhecido sobre as marcas epigenéticas existentes na cromatina destas células, e de que forma a regulação da expressão gênica ocorre no momento da diferenciação. O presente trabalho teve como objetivo o estudo dos efeitos da hiperacetilação das histonas causada pela droga tricostatina A (TSA), uma inibidora das enzimas histona desacetilases, sobre a diferenciação destas células em estádios iniciais e avançados. Para tanto, a hiperacetilação induzida pela droga foi estimada por reações de imunocitoquímica para AcLys9H3. Os efeitos anti-proliferativos da TSA foram mensurados pelo teste de TUNEL e contagem de células. Ainda, foram conduzidos experimentos de diferenciação in vitro de CTE e análise da expressão de proteínas características de linhagens celulares diferenciadas por reações de imunocitoquímica (Oct3/4, nestina, âIII tubulina, desmina e troponina I), em cultivos tratados com TSA em diferentes concentrações e em diferentes momentos. Desta forma, foi estimada a população de tipos celulares oriundos dos folhetos embrionários ectodérmico e mesodérmico, como neurônios, e células musculares, quando foi promovida a hiperacetilação das histonas nas CTE, em diferentes momentos da diferenciação celular in vitro. A TSA induziu apoptose em níveis superiores aos do grupo controle, e retardou/inibiu a divisão celular. Promoveu hiperacetilação dose-dependente nos períodos estudados, e estimulou a diferenciação de precursores mesodérmicos (50nM d5) e ectodérmicos (15nMd0-5 e 50nMd5), cardiomiócitos (50nMd5 e 100nMd13) e neurônios (15nMd0-5, 50nMd5, 100nMd5, 100nMd13). / Abstract: Studies on embryonic stem cells (ESC) differentiation represents an important tool leading to understanding of its molecular pathways, with many applications both on basic research and tissue engineering / regenerative medicine. Little is known about epigenetic marks on ESC chromatin, and how gene expression occurs at differentiation time. The aim of this work was to study effects of histone hiperacetylation, induced by cell treatment with trichostatin A (TSA), an histone deacetylase inhibitor, on both initial and late differentiation. For that, drug-induced hyperacetylation was studied by AcLys9H3 immunocitochemistry. TSA anti-proliferative effects were analysed by TUNEL test and cell counts. Experiments on ESC in vitro differentiation and immunocitochemistry for specific cell types proteins (Oct3/4, nestin, âIII tubulin, desmin and troponin I) were performed, in treated and control groups, at different moments. This analysis showed specific cell types populations derived from embryonic ectodermal and mesodermal, such as neurons and cardiomyocytes, when histone hyperacetylation were induced, on both initial and late diferentiation. Our results showed that TSA induces apoptosis and inhibits cellular proliferation. Also, TSA promoted dose-dependent histone hyperacetylation at studied moments, and stimulated mesodermal (50nM d5) and ectodermal (15nMd0-5 e 50nMd5) precursors, cardiomyocytes (50nMd5 e 100nMd13) and neurons (15nMd0-5, 50nMd5, 100nMd5, 100nMd13) differentiation. / Mestre