Orientador: Fernanda C. Landim Alvarenga / Banca: Maria Denise Lopes / Banca: Mayra Elena Ortiz D'Avila Assumpção / Resumo: O objetivo deste estudo foi aprimorar os protocolos de produção in vitro de embriões e de ativação partenogenética visando o isolamento e o cultivo de células tronco embrionárias felinas. Os CCOs-I foram obtidos a partir de ovários de gatas adultas e maturados in vitro. No experimento I, os CCOS foram fecundados e os embriões cultivados nos meios SOFaa e FOC. Foram comparadas as taxas de clivagem e a produção de blastocistos. A análise estatística foi realizada por meio da análise de variância e a viabilidade embrionária foi avaliada por sondas fluorescentes (Hoechst e iodeto de propídio). Não houve diferenças significativas entre os meios de cultivo, os quais apresentaram taxas de clivagem de 50,5±9,47 e 63,75±5,9 (P>0,05) e de produção de blastocistos em relação ao total de oócitos fecundados de 18±5,07 e 33,2±3,71 (P>0,05) para FOC e SOF respectivamente. No experimento II, os CCOs maturos foram submetidos a três diferentes protocolos de ativação partenogenética: 1-ionomicina associada ao cicloheximide; 2-ionomicina associada ao roscovitine e 3-ionomicina associada ao estrôncio, os quais foram comparados entre si e ao controle quanto às taxas de ativação, clivagem e desenvolvimento embrionário, sendo cultivados em SOFaa por 72 horas após a ativação. Para tais avaliações, oócitos e embriões foram corados com Hoechst 33342 e examinados em microscópio invertido. Como análise estatística foi utilizado o teste qui-quadrado. Não houve diferença significativa entre os tratamentos quanto à taxa de oócitos ativados (69,9%, 76,6% e 64,6%, para tratamento 1, 2 e 3 respectivamente) (P>0,05) nem quanto às taxas de clivagem (46,6%, 46,73% e 32,32%, para tratamento 1, 2 e 3 respectivamente) (P>0,05), mas sim entre estes e o controle (36% e 12%, respectivamente, para taxa de oócitos ativados e taxas de clivagem) (P<0,05). Quanto ao desenvolvimento... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of this study was to improve the existent protocols for in vitro embryos production and parthenogenetic activation in cats, aiming the isolation and culture of feline embryonic stem cells. COCs-I were collected from adult queens's ovaries and matured in vitro. In the experiment I, COCs were fertilized and embryos cultured in two culture media, SOFaa and FOC. In both media the cleavage rate and blastocysts production were compared. Fluorescents probes (Hoechst and propidium iodide) were utilized to estimate embryo viability. The statistical analysis was realized through the ANOVA. No statistical difference was observed between culture media. The cleavage rates considering the total number of fertilized oocytes were 50.5±9.47 and 63.75±5.9 (P>0.05) for FOC and SOF medium respectively. Similarly, the blastocysts production rates were 18±5.07 and 33.2±3.71 (P>0.05) for FOC and SOF, respectively. In experiment II matured COCs were submitted to three parthenogenetic activation protocols: 1- ionomycin associated to cycloheximide; 2 - ionomycin associated to roscovitine; 3 - ionomycin associated to strontium. The treatments were compared among themselves and among them and the control concerning chromatin decondensation, cleavage and embryo development rates. The parthenogenetic embryos were then cultured in SOFaa during 72 hours. To estimate chromatin status and number of nuclei, oocytes and embryos were stained with Hoechst 33342 and examined under an inverted fluorescent microscope. As statistical analyses chi-square test was utilized. No statistical difference was observed among treatments concerning activated oocytes rates (69.9%, 76.6% e 64.6%, respectively, for treatment 1, 2 and 3) (P>0.05) neither cleavage rates (46.6%, 46.73% e 32.32%, respectively, for treatment 1, treatment 1, 2, 3) (P>0.05). However, statistical difference was observed among treatments and... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Banca: Flávio Vieira Meirelles / Banca: Claudia Lima Verde Leal / Banca: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Resumo: A maturação oocitária é marcada pela retomada da primeira divisão da meiose, com progressão do estádio de Vesícula Germinativa (GV) da Prófase I até a Metáfase II (MII), e inclui todos os eventos necessários para que o oócito expresse seu potencial máximo de desenvolvimento após a fecundação. Para avaliarmos a eficiência da maturação in vitro (MIV), utilizamos oócitos classificados em viáveis (graus I, II e III) e inviáveis (atrésico e desnudo), e acompanhamos a progressão nuclear e a distribuição dos grânulos corticais (GC) como indício de maturação citoplasmática, após MIV em TCM 199 com soro fetal bovino, hormônios, antibiótico e piruvato, por 24h em 5% de CO2 em ar. Maturação nuclear (78,4-87,8%) e citoplasmática (GC periféricos; 67,2-79,3%) foram semelhantes entre as diferentes classes de oócitos e apresentaramse como eventos independentes. Para o acompanhamento dos eventos desencadeados pelo espermatozóide, avaliamos a dinâmica nuclear e de microtúbulos, em intervalos de 2h, após fecundação in vitro (FIV), em meio TALP com heparina, PHE e sêmen preparado em gradiente de Percoll. Observamos que o estádio de MII foi predominante de 2 a 8h; MII e Anáfase/Telófase (A/T) predominaram às 10h; MII, A/T e estádio pronuclear (PN) de 14 a 16h; e PN a partir de 18h. A penetração do espermatozóide ocorreu após 4h da inseminação dos oócitos; a diferenciação dos PN 14 masculino e feminino pelo tamanho foi possível de 14 a 18h e a singamia ocorreu a partir de 24h. O período de 10h pode ser suficiente para que a FIV seja efetiva em oócitos bovinos, nas condições aqui descritas. / Abstract: We aimed to evaluate events involved in in vitro maturation, fertilization and development, and parthenogenetic activation of bovine oocytes assessed by nuclear-cytoplasmic interaction and gene expression. Oocyte morphological selection did not affect nuclear maturation (78.4-87.8%) and cytoplasmic cortical granule distribution (67.2-79.3%). Following nuclear and microtubular dynamics after fertilization (IVF), we observed sperm penetration 4h after insemination; male and female pronuclei differentiation by size from 14 to 18h; syngamy after 24h; and sufficient co-incubation of spermatozoa and oocytes for 10h. Pronuclear transfer to study the interaction between nucleus (N) and cytoplasm (C) in parthenogenetic embryos produced by ionomycin followed by strontium (S) or 6-DMAP (D) was assessed by cleavage, eight-cell, and blastocyst development rates: CSND (76.5, 36.4, and 6.8%) and CDNS (69.5, 25.0, and 4.9%). S cytoplasm promoted dominant effect on D nucleus. Higher rates of developmental arrest up to the eight-cell stage were observed by the combination of cytoplasm and nucleus produced by the two different activation treatments. We recovered parthenogenetic D fetuses on Day 35, which were small but normal in formation and in appearance of chorio-alantoic membranes. Genomic imprinting of IGF2 was observed, but XIST was maternally expressed in extra-embryonic tissues. In vitro culture promoted higher expression of IGF2 and H19 genes and also increased IGF2/IGF2r ratio in IVF embryos compared to in vivo produced ones. / Doutor