Resumo: A acetilação das histonas é um dos principais mecanismos de reprogramação epigenética do genoma dos gametas a fim de estabelecer um estado totipotente para o desenvolvimento normal. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da utilização da Tricostatina A (TSA) sobre os níveis de acetilação das histonas e o desenvolvimento embrionário, avaliando-se a contagem do número de células da massa celular interna (MCI), trofectoderma (TE), e células totais, e os níveis da reação de imunocitoquímica para H3K9ac. Para isso, três experimentos foram delineados. No primeiro experimento, verificou-se que o grupo tratado com 5nM de TSA por 144h durante o cultivo in vitro (CIV) aumentou (p<0,01) o nível de H3K9ac em relação ao grupo controle. A taxa de clivagem e o desenvolvimento embrionário foram avaliados em um segundo experimento, e o grupo tratado com 5nM de TSA não apresentou diferença na produção de embriões comparado ao grupo controle. No experimento 3, o tratamento com a TSA não apresentou efeitos significativos em relação ao número de células da MCI, porém houve redução (p<0,01) tanto do número de células da TE quanto de células totais comparado ao grupo controle. Portanto, conclui-se que o tratamento com TSA não altera o desenvolvimento embrionário pré-implantacional de embriões fêmeas de bovinos, mostrando efeito negativo sobre o desenvolvimento dos embriões tratados / Abstract: Histone acetylation is one of the major mechanisms of epigenetic reprogramming of gamete genome to establish a totipotent state for normal development. The aim of this work was to evaluate the use of Trichostatin A (TSA) on the levels of histone acetylation and embryonic development, the assessment of counting the cell number of inner cell mass (ICM), trophectoderm (TE), and total cells, and the levels of H3K9ac for immunocytochemical reaction. Therefore, three experiments were designed. In the first experiment, it was verified that the group treated with TSA for 5nM for 144h during in vitro culture (IVC) increased (p <0.01) the level of H3K9ac in the control group. Cleavage rate and embryo development were evaluated in a second experiment, and the group treated with 5nM TSA showed no difference in embryo production compared to control. In Experiment 3, treatment with TSA had no significant effect on the cell number of ICM, but decreased (p <0.01) both the cell number of TE and total cells as compared to control. Therefore, it is concluded that treatment with TSA does not alter the preimplantation embryonic development female bovine embryos, showing a negative effect on the development of embryos treated / Orientador: Jeffrey Frederico Lui / Coorientador: Joaquim Mansano Garcia / Banca: Gilson Hélio Toniollo / Banca: Sandro Henrique Antunes Ribeiro / Mestre

Orientador: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Joaquim Mansano Garcia / Banca: Rubens Paes de Arruda / Resumo: Recentemente, tem-se dado atenção crescente aos efeitos deletérios dos radicais livres sobre os oócitos e embriões cultivados in vitro em mamíferos. No entanto, poucos estudos foram conduzidos sobre a ação desses agentes sobre a interação entre o espermatozóide-oócito durante a fertilização in vitro (FIV). Com o intuito de melhorar os resultados da produção in vitro de embriões bovinos, este trabalho teve por objetivo avaliar os efeitos da suplementação do meio de fecundação in vitro com antioxidantes cisteamina (Cist) e 2-Mercaptoetanol (2-ME) sobre a capacitação espermática, fecundação, qualidade dos zigotos e competência no desenvolvimento embrionário. Os espermatozóides apresentaram o DNA íntegro quase na totalidade entre os diferentes tratamentos e durante o tempo no processo da FIV. / Abstract: Recently, deleterious effects of free radicals over oocytes and embryos cultivated in vitro in mammals have received increasing attention. Nonetheless, few studies were conducted about the action of those agents over the interaction between the sperm-oocyte during in vitro fertilization (IVF). Aimed at improving results of in vitro production of bovine embryos, this work had as objective to evaluate the effects of supplementation of the in vitro fertilization environment with antioxidants cisteamine (Cist) and 2-Mercaptoethanol (2-ME) over the spermatic capacitation, fertilization, quality of zygotes and competency in the embryonic development. Spermatozoas exhibited an integral DNA almost in the totality of the different treatments and along the time in the IVF process. / Mestre

Orientador: Manoel Garcia Neto / Banca: Antonio Carlos de Laurentiz / Banca: Max José de Araújo Faria Júnior / Resumo: A desidratação dos ovos de avestruz (Struthio camelus) na incubação artificial é a principal causa do desenvolvimento e qualidade do filhote. Neste estudo, a necessidade de avaliar e manejar os ovos durante a incubação, tornou-se evidente. No incubatório das instalações do Setor Experimental de Zootecnia (SEZ) - UNESP/Araçatuba-SP, foram utilizados 129 ovos férteis eclodidos e 70 ovos férteis não eclodidos para a avaliação da perda de água aos 38 dias; as características da casca, a porosidade e a espessura foram confrontadas à perda total de água do ovo. Observou-se uma diferença na perda total de água para ovos férteis eclodidos (15,45%) e ovos férteis não eclodidos (10,45%). Foram estudados 1303 ovos férteis eclodidos quanto ao posicionamento na incubadora e à desidratação. Para a obtenção dos resultados, a incubadora foi estratificada em 7 prateleiras, 8 gavetas e 3 profundidades. Verificou-se uma perda maior de água por evaporação, quando os ovos estavam localizados nas gavetas próximas ao aquecedor e à entrada de ar desumidificado. Porém, não foram detectadas alterações provocadas pela altura da prateleira ou mesmo pela proximidade dos ovos em relação à porta ou ao fundo da incubadora. Desta forma, concluiu-se que a avaliação e o manejo dos ovos de avestruz na incubação artificial devem fazer parte do controle diário do incubatório. / Abstract: The dehydration of eggs of ostrich (Struthio camelus) in the artificial incubation is the main cause of the development and quality of the youngling. In this study, the necessity to evaluate and to handling eggs during the incubation, became evident. In the room incubation of the installations of the Experimental Zootechny Sector (EZS) - UNESP/Araçatuba- São Paulo, Brazil, 129 ecloded fertile eggs and 70 fertile not ecloded eggs was been followed for the evaluation of the loss of water to 38 days and samples randomly of rinds was collated the characteristics of the rind, porosity and thickness, to the total loss of water of the egg. A difference observed in the total loss of water for ecloded fertile eggs was (15.45%) and fertile not ecloded eggs was (10.45%). Studied of 1303 ecloded fertile eggs how much to the positioning in the incubator and the dehydration for the attainment of the results, the incubator was subdivided in seven shelves, eight drawers and three depths. A bigger loss for evaporation of eggs was verified, when located in the drawers next to the heater and the dry air entrance. Nevertheless, no effect related to the shelves height was detected, not even when the proximity of the egg to the incubator door or the deep one was concerned. In such a way, one concluded that the evaluation and the handling of eggs of ostrich in the artificial incubation must be part of the daily control of the room incubation. / Mestre

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Banca: Flávio Vieira Meirelles / Banca: Claudia Lima Verde Leal / Banca: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Resumo: A maturação oocitária é marcada pela retomada da primeira divisão da meiose, com progressão do estádio de Vesícula Germinativa (GV) da Prófase I até a Metáfase II (MII), e inclui todos os eventos necessários para que o oócito expresse seu potencial máximo de desenvolvimento após a fecundação. Para avaliarmos a eficiência da maturação in vitro (MIV), utilizamos oócitos classificados em viáveis (graus I, II e III) e inviáveis (atrésico e desnudo), e acompanhamos a progressão nuclear e a distribuição dos grânulos corticais (GC) como indício de maturação citoplasmática, após MIV em TCM 199 com soro fetal bovino, hormônios, antibiótico e piruvato, por 24h em 5% de CO2 em ar. Maturação nuclear (78,4-87,8%) e citoplasmática (GC periféricos; 67,2-79,3%) foram semelhantes entre as diferentes classes de oócitos e apresentaramse como eventos independentes. Para o acompanhamento dos eventos desencadeados pelo espermatozóide, avaliamos a dinâmica nuclear e de microtúbulos, em intervalos de 2h, após fecundação in vitro (FIV), em meio TALP com heparina, PHE e sêmen preparado em gradiente de Percoll. Observamos que o estádio de MII foi predominante de 2 a 8h; MII e Anáfase/Telófase (A/T) predominaram às 10h; MII, A/T e estádio pronuclear (PN) de 14 a 16h; e PN a partir de 18h. A penetração do espermatozóide ocorreu após 4h da inseminação dos oócitos; a diferenciação dos PN 14 masculino e feminino pelo tamanho foi possível de 14 a 18h e a singamia ocorreu a partir de 24h. O período de 10h pode ser suficiente para que a FIV seja efetiva em oócitos bovinos, nas condições aqui descritas. / Abstract: We aimed to evaluate events involved in in vitro maturation, fertilization and development, and parthenogenetic activation of bovine oocytes assessed by nuclear-cytoplasmic interaction and gene expression. Oocyte morphological selection did not affect nuclear maturation (78.4-87.8%) and cytoplasmic cortical granule distribution (67.2-79.3%). Following nuclear and microtubular dynamics after fertilization (IVF), we observed sperm penetration 4h after insemination; male and female pronuclei differentiation by size from 14 to 18h; syngamy after 24h; and sufficient co-incubation of spermatozoa and oocytes for 10h. Pronuclear transfer to study the interaction between nucleus (N) and cytoplasm (C) in parthenogenetic embryos produced by ionomycin followed by strontium (S) or 6-DMAP (D) was assessed by cleavage, eight-cell, and blastocyst development rates: CSND (76.5, 36.4, and 6.8%) and CDNS (69.5, 25.0, and 4.9%). S cytoplasm promoted dominant effect on D nucleus. Higher rates of developmental arrest up to the eight-cell stage were observed by the combination of cytoplasm and nucleus produced by the two different activation treatments. We recovered parthenogenetic D fetuses on Day 35, which were small but normal in formation and in appearance of chorio-alantoic membranes. Genomic imprinting of IGF2 was observed, but XIST was maternally expressed in extra-embryonic tissues. In vitro culture promoted higher expression of IGF2 and H19 genes and also increased IGF2/IGF2r ratio in IVF embryos compared to in vivo produced ones. / Doutor