La pathogenèse de l’encéphalite herpétique (HSE) n’est pas totalement connue, mais la réplication du virus engendre une encéphalite aiguë nécrosante du lobe temporal/frontal et une inflammation cérébrale menant à l’infiltration des cellules immunitaires périphériques au sein du système nerveux central. Bien que la majorité des dommages cérébraux engendrés seraient causés par la réplication virale, de plus en de plus de données indiquent une composante immunitaire dans la pathogenèse de l’HSE. La réponse immunitaire innée constitue la première ligne de défense limitant la propagation virale. Nous savons que la réponse immunitaire est engendrée à la suite de la reconnaissance du VHS-1, notamment par les « Toll-like receptors » (TLRs). De plus, la synthèse d’interféron (IFN) de type I est primordiale dans la réponse antivirale. En effet, des études montrent qu’une déficience d’un composant impliqué dans les voies de signalisation menant à la production d’IFNs de type I est délétère chez la souris et chez l’humain au cours de l’HSE. Par ailleurs, la migration des cellules immunitaires au sein du SNC prend de plus en plus d’ampleur dans l’étude de la réponse immunitaire contre cette infection. Cependant, bien que différents modèles animaux permettent l’étude de la réponse immunitaire cérébrale, la complexité de cette pathologie, du SNC et de sa réponse inflammatoire en limite encore notre compréhension. L’objectif principal de cette thèse a été de mieux comprendre la composante immunitaire de la pathogenèse de l’HSE, et plus spécifiquement, au niveau du recrutement des cellules immunitaires périphériques dans le SNC, de la participation des voies de signalisation passant par les facteurs de transcription régulateurs des IFNs (IRF) 3 et IRF7 et d’évaluer l’effet d’immunomodulateurs tels que l’artésunate et la rapamycine sur la sensibilité de différentes souches murines au cours de l’encéphalite herpétique expérimentale. Les études menées ont permis de mettre en évidence qu’une réponse immunitaire cérébrale innée efficace participe à la résistance naturelle des souris C57BL/6 en comparaison aux souris BALB/c naturellement sensibles. En effet, la charge virale dans le SNC des souris C57BL/6 infectées par le VHS-1 par voie I.N est plus faible au pic de l’infection (i. e jour 6 post-infection [p. i]) comparativement aux souris BALB/c. Ce contrôle de la charge virale est associé à une infiltration rapide (avec au jour 4 post-infection, infiltration de monocytes inflammatoires, de cellules dendritiques conventionnelles [cDCs], de cellules dendritiques plasmacytoïdes [pDCs], de cellules « natural killers » [NK], de cellules « natural killers T » [NKT]) et coordonnée (suivie d’une infiltration de lymphocyte T au jour 8 p. i). Par ailleurs, les travaux réalisés ont permis de mettre en évidence un rôle clé d’IRF3 et plus particulièrement d’IRF7 dans la réponse interféron de type I. En ce sens, les souris déficientes pour IRF3 ou IRF7 sont plus sensibles à l’infection intranasale par le VHS-1 que les souris C57BL/6 sauvages. Chez les souris déficientes pour IRF7 et dans une moindre mesure pour IRF3, la perte de contrôle de la réplication virale dans le cerveau est associée à un défaut de production d’IFN -b à un temps précoce après l’infection suivi par une surproduction des IFNs de type I. La sensibilité accrue au cours de l’HSE, aussi bien chez les souris BALB/c naturellement sensibles que chez les souris déficientes pour IRF7 ou IRF3, est combinée à une forte production de cytokines pro-inflammatoires et de chimiokines à des temps tardifs postinfection. Nous avons donc évalué l’effet de l’ajout d’immunomodulateurs au traitement antiviral : l’artésunate (ART), agissant sur les voies de signalisation passant par TLR2 et 9 et la rapamycine (RAPA), agissant sur les voies de signalisation passant par TLR3 et 9 et ainsi mis en évidence que l’ajout d’un composé immunomodulateur au traitement antiviral permettait d’améliorer la survie des souris sensibles à l’infection sans action directe sur la charge virale au niveau du cerveau, mais en diminuant significativement les taux de cytokines pro-inflammatoire et de chimiokines dans le SNC. À l’aide de ces différents modèles expérimentaux, j’ai également démontré une surexpression de cytokines pro-inflammatoires (l’IL-1 b, l’IL-6, l’IFN -g) et de chimiokine (CCL2), dont les taux sont diminués par l’ajout d’un traitement immunomodulateur à la thérapie antivirale dans un modèle murin sensible à l’HSE. Ces données apportent donc de nouvelles preuves d’une composante immunitaire dans la pathogenèse de l’encéphalite herpétique, ainsi que de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. / Pathogenesis of herpes simplex encephalitis is not completely understood, but viral replication results in acute necrotizing encephalitis of the temporal/frontal lobes and cerebral inflammation leading to the infiltration of the peripheral immune cells to the central nervous system (CNS). Although most brain damage is caused by viral replication, a lot of data suggest that the immune response could also contribute to the pathogenesis of HSE. The innate immune response is the first line of host defense that limits viral spread. Numerous studies showed that the immune response is induced by the recognition of HSV-1, in particular by the toll-like receptors (TLRs). Likewise, type I interferon (IFN) is essential to the antiviral response. Indeed, studies showed that impairment of a component involved in signaling pathways inducing the type I IFN synthesis is deleterious in mice and humans during HSE. For several years, a series of studies have suggested that the immune response participated in this CNS pathology resulting in a fatal course and that hyperinflammatory responses initiated by early infiltrating innate cells play a key role in the development of this pathology. In addition, the complexity of the CNS inflammatory response constitutes a challenge for our understanding of the pathogenesis of herpetic encephalitis. The main objective of this thesis was to better understand the immune response as a contributor to the pathogenesis of HSE, and more specifically, the recruitment of peripheral immune cells in the CNS, the involvement of signaling pathway mediated by the interferon regulatory transcription factors (IRF) 3 and IRF7 and the evaluation of the effects of immunomodulators such as artesunate and rapamycin on the susceptibility of different murine strains during experimental HSE An effective innate cerebral immune response contributes to the natural resistance of C57BL/6 mice compared to naturally sensitive BALB/c mice. In fact, the viral load in the CNS of C57BL/6 mice infected with HSV-1 by the I.N. route is lower at the peak of infection (day 6 post-infection (p.i)) compared to BALB/c mice. This control of the viral load is associated with rapid and coordinated infiltration of cells in the CNS (infiltration of inflammatory monocytes, conventional dendritic cells (cDCs), plasmacytoid dendritic cells (pDCs), natural killer cells (NK), natural killer cells T (NKT) on day 4 p.i) followed by T lymphocyte infiltration on day 8 p.i. Moreover, the control of viral replication is orchestrated by the activation of transcription factors IRF3 and particularly IRF7. In this regard, mice deficient for IRF3 or IRF7 are more susceptible to intranasal infection by HSV-1 than wild type C57BL/6 mice. In mice deficient for IRF7 and to a lesser extent for IRF3, the loss of control of viral replication in the brain is associated with a defect in IFN-b production at an early time after infection followed by overproduction of type I IFNs. Increased susceptibility of BALB/c mice, IRF3- or IRF7-deficient mice is associated with higher levels of pro-inflammatory cytokines and chemokines levels in the CNS compared to C57BL/6 mice at later times post-infection. We therefore evaluated the effect of the addition of immunomodulators to antiviral treatment: artesunate (ART), acting on signaling pathways mediated by TLR2 and 9 and rapamycin (RAPA), acting on signaling pathways mediated by TLR3 and 9. We show that the administration of ART or RAPA to the antiviral therapy was beneficial and improve the outcome of HSE in mice, without a direct effect on the viral load. Instead they act by decreasing significantly pro-inflammatory cytokine and chemokine levels in the CNS. Using these different experimental models, we also demonstrated overexpression of pro-inflammatory cytokines (IL-1 b, IL-6, IFN -g) and chemokine (CC2) during experimental HSE. In this regard, adding of immunomodulatory compound to antiviral therapy allowed to decrease levels of these inflammatory proteins. In conclusion, these data provide new evidence for the contribution of the immune response in the pathogenesis of herpetic encephalitis, as well as the development of potential new therapeutic targets.

Les virus herpès simplex (VHS) possèdent une propriété biologique unique très importante, soit la neurovirulence. Les VHS peuvent ainsi atteindre le système nerveux central (SNC) et causer une encéphalite. Cette infection déclenche une réponse inflammatoire menant à l'infiltration de cellules immunitaires périphériques dans le SNC. De ce fait, l'encéphalite représente l'infection associée au VHS de type 1 (VHS-1) la plus dévastatrice et est la principale cause d'encéphalite sporadique virale, potentiellement fatale dans les pays développés. Bien que différents modèles animaux permettent l'étude de l'encéphalite, la complexité du SNC et de sa réponse immunitaire en limite encore notre compréhension. L'objectif de recherche principal de cette thèse est de mieux comprendre la réponse immunitaire innée impliquant différentes voies de signalisation associées à la reconnaissance du VHS-1. Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse de doctorat ont permis de démontrer le rôle clé de 1TFN-β, de la voie de signalisation des récepteurs Tolllike 3 (TLR3) et TLR9 ainsi que des protéines adaptatrices TRIF et IPS-1. Ainsi, le prétraitement des souris par un agoniste du TLR3 permet de créer un environnement proinflammatoire qui est néfaste à la replication virale initiale, permettant, à des temps plus tardifs, de diminuer la production de cytokines et de la charge virale. De plus, la stimulation de la voie du TLR9 est bénéfique avant l'infection, mais il est nécessaire de contenir celle-ci suite à l'infection. Comme il l'a déjà été suggéré, 1TFN-β peut exercer un effet bénéfique contre l'infection au VHS-1 mais le dosage et le temps d'administration après l'infection peuvent fortement influencer la replication virale et la survie. Enfin, les protéines adaptatrices TRIF et IPS-1 jouent un rôle très important au niveau de la réponse immunitaire innée en menant à la production d'IFN-β, bien que TRIF affecte davantage la replication virale précoce qu'IPS-1. Ainsi, au cours de ce doctorat, plusieurs modèles expérimentaux ont été développés pour mieux comprendre la réponse immunitaire innée au niveau du SNC au cours de l'encéphalite herpétique, le recrutement de différentes cellules immunitaires ainsi que pour mieux caractériser le rôle de l'IFN-β.

Les infections au virus herpès simplex I (VHS-1) sont souvent bénignes mais peuvent être responsables de pathologies sévères, telle que l'infection du système nerveux central, telle que l'encéphalite herpétique (EH). Cette dernière représente l'encéphalite virale sporadique la plus répandue dans les pays développés. Malgré la disponibilité des antiviraux, le taux de mortalité est de plus que 30%. De plus, la majorité des survivants souffrent des séquelles neurologiques. Le mécanisme par lequel l'encéphalite herpétique est létale n'est pas encore clairement établi. Bien que la réplication virale cause des dommages importants, de plus en plus d'évidences suggèrent que l'inflammation induite en réponse à l'infection joue également un rôle dans la pathogénèse de cette maladie. L'hypothèse principale de notre équipe est que la réponse immunitaire cérébrale innée induite au cours de cette infection est une arme à double tranchant car elle est critique pour contenir la réplication virale dans le cerveau durant la phase précoce de la maladie, mais si elle est incontrôlée, elle peut résulter en une réponse inflammatoire exacerbée qui peut être néfaste. Les microglies sont les seules cellules immunitaires résidentes du cerveau. Plusieurs études ont rapporté que ces cellules qui forment la première ligne de défense, jouaient un rôle clé dans le contrôle des infections du SNC. En revanche, la microglie réactive semblerait contribuer à la neuroinflammation. De plus, il est proposé que ces microglies réactives participent à la perturbation de la barrière hématoencéphalique au cours de l'EH, que nous avons également pu constater chez la souris BALB/c infectée par la voie intranasale, décrite dans la première partie de nos travaux. Cependant, le rôle exact des microglies dans l'EH n'a pas encore été élucidé. Alors, nous avons décidé de mener des travaux dans le but de comprendre l'implication des microglies dans le contrôle de l'EH et de caractériser les mécanismes exploités par ces cellules. Pour atteindre nos objectifs, nous avons d'abord évalué l'effet de l'activation des microglies par le « macrophage colony-stimulating factor » (M-CSF) administré avant l'infection. Ce traitement a significativement augmenté la survie des souris et diminué les titres viraux cérébraux au J6 p.i. En parallèle, l'augmentation du nombre de microglies CD68⁺ observée dans les cerveaux des souris traitées avec du M-CSF a mené à l'hypothèse que la microglie CSF1R⁺ était responsable de cette amélioration du pronostic de l'EH. Pour répondre à cette question, nous avons déplété la microglie chez des souris CSF1R-loxP-CX3CR1-cre/ERT2. Le taux de survie réduit et des titres viraux cérébraux plus élevés pour ces souris déplétées des microglies ont souligné l'importance de la réponse microgliale dans la phase précoce de l'infection. Suivant ces observations, les mécanismes impliqués dans la réponse immunitaire microgliale au cours de l'EH ont été étudiés à l'aide de la microscopie électronique et du séquençage d'ARNm sur une cellule unique. Dans cette partie, nous avons étudié uniquement les microglies situées dans le noyau postéro-ventral (VPL, pour « Ventral posterolateral nucleus »), qui a été identifié, à l'aide du VHS-1 recombinant neurovirulent que nous avons décrit dans la première partie des travaux, comme la région la plus infectée du cerveau chez des souris C57BL/6 au J6 p.i. Nos analyses ont confirmé que ces cellules limitaient l'infection à l'aide de la phagocytose et de la présentation d'antigènes. En outre, nous avons pu décrire une nouvelle réponse transcriptionnelle, associée à une population cellulaire rare, que nous avons appelées des microglies « en transition ». L'expression élevée des transcrits viraux par ces cellules pourrait correspondre à la réponse immunitaire antivirale intrinsèque des microglies infectées par le VHS-1 dans le VPL. Enfin, l'analyse de ce transcriptome révélant l'augmentation d'expression des gènes impliqués dans la production d'interleukine IL-1β médiée par l'inflammasome NLRP (pour « Nucleotide-binding oligomerization domain, Leucine rich Repeat and Pyrin domain containing ») 3, a suggéré que ces microglies « en transition » infectées favoriseraient l'exacerbation de l'inflammation au cours de l'EH L'ensemble de nos données montrent que les microglies sont nécessaires en phase précoce pour un meilleure contrôle de l'EH. Ceci peut évoluer vers un phénotype pro-inflammatoire et contribuer ensuite à l'exacerbation de l'inflammation. De plus, nos résultats suggèrent que l'infection de ces microglies du VPL par le VHS-1 pourrait ainsi induire l'acquisition de cette réponse transcriptionelle pro-inflammatoire. / Herpes simplex virus I (HSV-1) infections are often mild, but can be responsible for severe pathologies, such as the infection of the central nervous system, also called herpes simplex encephalitis (HSE). The latter is the most common sporadic viral encephalitis in developed countries. Despite available antivirals, the mortality rate is higher than 30%. In addition, most survivors suffer from neurological sequelae. The mechanism by which herpes encephalitis is lethal is not yet clearly established. Although viral replication causes significant neural damage, growing evidence suggests that the inflammatory response also plays a major role in the pathogenesis of HSE. The main hypothesis of our team is that the innate immune response induced by HSV-1 infection is a double-edged sword. We believe that this immune response, critical to limit viral replication in the brain during the early phase of the disease, become later uncontrolled, and result in an exacerbated inflammatory response which is deleterious. Microglia are the only resident immune cells in the brain. Several studies reported that these cells, which form the first line of defense, play a key role in controlling CNS infections. In contrast, reactive microglia appear to contribute to neuroinflammation. In addition, it is proposed that these reactive microglia participate in the disruption of the blood-brain barrier during HSE, which we have also been able to observe in intranasally-infected BALB/c mice, as described in the first part of our work. However, the exact role of microglia in HE has not yet been elucidated. So, we decided to conduct this research to understand the involvement of microglia in the control of HE and to characterize the mechanisms exploited by these cells. We first evaluated the effect of microglial activation by macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) administered prior to the infection. This treatment significantly increased survival rate and decreased brain viral titers at day 6 pi. In parallel, the increased number of CD68⁺ microglia found in the brains of M-CSF treated mice led the question whether CSF1R⁺ microglia were responsible for this improvement of HSE prognosis. To answer that question, we depleted microglia using CSF1R-loxP-CX3CR1-cre/ERT2 mice. The reduced survival rate and higher brain viral titers for these microglia-depleted mice highlighted the importance of the microglial response during the early phase of infection. Following these observations, the mechanisms involved in the microglial immune response during HSE have been investigated using electron microscopy and single cell mRNA sequencing. In this part, we studied only the microglia located at VPL, which was identified as the most infected region of the infected C57BL/6 brain on day 6 p.i. using a new neurovirulent recombinant HSV-1 that we described in the first part of our work. Our results confirmed that microglia limit the infection by phagocytosis and antigen presentation. Furthermore, we described a new transcriptional response, associated with a rare cell population in VPL (Ventral posterolateral nucleus), which we called "in transition" microglia. The high expression of viral transcripts by these cells suggested that this distinct transcriptome might correspond to the intrinsic antiviral immune response of HSV-1-infected microglia in the VPL. Finally, the analysis of this transcriptome revealing the increased expression of genes involved in the production of interleukin IL-1β mediated by the NLRP3 inflammasome, suggested that these infected "in transition" microglia would promote the exacerbation of the inflammation in HE. Altogether, our work shows that the microglia, necessary in the early phase for a better control of HSE, can evolve towards a pro-inflammatory phenotype and contribute to the exacerbation of inflammation. Moreover, our results suggest that the infection of microglia by HSV-1 in VPL could thus induce the acquisition of this pro-inflammatory transcriptional response.

Le virus herpès simplex de type 1 (VHS-1) est la principale cause d'encéphalite virale sporadique dans les pays développés. L'incidence annuelle de l'encéphalite herpétique est de 2 à 4 cas par million d'individus. Cette infection dévastatrice peut atteindre des taux de mortalité de 30% malgré l'administration d'un traitement antiviral à base d'acyclovir. De plus, chez certains patients qui survivent à l'infection, cette maladie peut laisser des séquelles neurologiques graves et permanentes. Le VHS-1 induit une forte réponse inflammatoire cérébrale par l'activation des composantes de la réponse immunitaire innée qui, par la suite, met en place la voie de déclenchement de la réponse adaptative. Bien que cette réponse inflammatoire soit importante pour contrôler la replication du virus, elle peut, si elle est exacerbée, causer des dommages au niveau du système nerveux central (SNC). La compréhension du rôle joué par les microglies (macrophages résidents dans le SNC) et par les monocytes périphériques (dans le sang) recrutés au niveau du cerveau pour élaborer cette réponse immunitaire innée pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Celles-ci pourraient ouvrir la porte au développement de nouvelles stratégies combinant un antiviral à un agent immunomodulateur pour contrôler à la fois la propagation du virus et l'état inflammatoire du SNC au cours de l'encéphalite herpétique. Les travaux présentés dans le cadre de ce mémoire portent sur l'étude de l'implication des microglies et des monocytes périphériques recrutés au niveau du cerveau dans la réponse immunitaire innée développée dans un modèle murin d'encéphalite herpétique. Pour atteindre nos objectifs, nous avons d'abord utilisé des souris chimériques dont les précurseurs myéloïdes périphériques dérivés de la moelle osseuse expriment la protéine fluorescente verte (GFP). Nous avons ensuite évalué l'impact de la déficience de deux récepteurs de chimiokines exprimés à la surface des monocytes/macrophages, CCR2 et CX3CR1, sur la survie des souris ainsi que sur le recrutement des deux sous-types de monocytes sanguins, les monocytes "inflammatoires" et "circulants", au cours de l'encéphalite herpétique.

Les infections au virus herpès simplex I (VHS-1) sont souvent bénignes mais peuvent être responsables de pathologies sévères, telle que l'infection du système nerveux central, telle que l'encéphalite herpétique (EH). Cette dernière représente l'encéphalite virale sporadique la plus répandue dans les pays développés. Malgré la disponibilité des antiviraux, le taux de mortalité est de plus que 30%. De plus, la majorité des survivants souffrent des séquelles neurologiques. Le mécanisme par lequel l'encéphalite herpétique est létale n'est pas encore clairement établi. Bien que la réplication virale cause des dommages importants, de plus en plus d'évidences suggèrent que l'inflammation induite en réponse à l'infection joue également un rôle dans la pathogénèse de cette maladie. L'hypothèse principale de notre équipe est que la réponse immunitaire cérébrale innée induite au cours de cette infection est une arme à double tranchant car elle est critique pour contenir la réplication virale dans le cerveau durant la phase précoce de la maladie, mais si elle est incontrôlée, elle peut résulter en une réponse inflammatoire exacerbée qui peut être néfaste. Les microglies sont les seules cellules immunitaires résidentes du cerveau. Plusieurs études ont rapporté que ces cellules qui forment la première ligne de défense, jouaient un rôle clé dans le contrôle des infections du SNC. En revanche, la microglie réactive semblerait contribuer à la neuroinflammation. De plus, il est proposé que ces microglies réactives participent à la perturbation de la barrière hématoencéphalique au cours de l'EH, que nous avons également pu constater chez la souris BALB/c infectée par la voie intranasale, décrite dans la première partie de nos travaux. Cependant, le rôle exact des microglies dans l'EH n'a pas encore été élucidé. Alors, nous avons décidé de mener des travaux dans le but de comprendre l'implication des microglies dans le contrôle de l'EH et de caractériser les mécanismes exploités par ces cellules. Pour atteindre nos objectifs, nous avons d'abord évalué l'effet de l'activation des microglies par le « macrophage colony-stimulating factor » (M-CSF) administré avant l'infection. Ce traitement a significativement augmenté la survie des souris et diminué les titres viraux cérébraux au J6 p.i. En parallèle, l'augmentation du nombre de microglies CD68⁺ observée dans les cerveaux des souris traitées avec du M-CSF a mené à l'hypothèse que la microglie CSF1R⁺ était responsable de cette amélioration du pronostic de l'EH. Pour répondre à cette question, nous avons déplété la microglie chez des souris CSF1R-loxP-CX3CR1-cre/ERT2. Le taux de survie réduit et des titres viraux cérébraux plus élevés pour ces souris déplétées des microglies ont souligné l'importance de la réponse microgliale dans la phase précoce de l'infection. Suivant ces observations, les mécanismes impliqués dans la réponse immunitaire microgliale au cours de l'EH ont été étudiés à l'aide de la microscopie électronique et du séquençage d'ARNm sur une cellule unique. Dans cette partie, nous avons étudié uniquement les microglies situées dans le noyau postéro-ventral (VPL, pour « Ventral posterolateral nucleus »), qui a été identifié, à l'aide du VHS-1 recombinant neurovirulent que nous avons décrit dans la première partie des travaux, comme la région la plus infectée du cerveau chez des souris C57BL/6 au J6 p.i. Nos analyses ont confirmé que ces cellules limitaient l'infection à l'aide de la phagocytose et de la présentation d'antigènes. En outre, nous avons pu décrire une nouvelle réponse transcriptionnelle, associée à une population cellulaire rare, que nous avons appelées des microglies « en transition ». L'expression élevée des transcrits viraux par ces cellules pourrait correspondre à la réponse immunitaire antivirale intrinsèque des microglies infectées par le VHS-1 dans le VPL. Enfin, l'analyse de ce transcriptome révélant l'augmentation d'expression des gènes impliqués dans la production d'interleukine IL-1β médiée par l'inflammasome NLRP (pour « Nucleotide-binding oligomerization domain, Leucine rich Repeat and Pyrin domain containing ») 3, a suggéré que ces microglies « en transition » infectées favoriseraient l'exacerbation de l'inflammation au cours de l'EH L'ensemble de nos données montrent que les microglies sont nécessaires en phase précoce pour un meilleure contrôle de l'EH. Ceci peut évoluer vers un phénotype pro-inflammatoire et contribuer ensuite à l'exacerbation de l'inflammation. De plus, nos résultats suggèrent que l'infection de ces microglies du VPL par le VHS-1 pourrait ainsi induire l'acquisition de cette réponse transcriptionelle pro-inflammatoire. / Herpes simplex virus I (HSV-1) infections are often mild, but can be responsible for severe pathologies, such as the infection of the central nervous system, also called herpes simplex encephalitis (HSE). The latter is the most common sporadic viral encephalitis in developed countries. Despite available antivirals, the mortality rate is higher than 30%. In addition, most survivors suffer from neurological sequelae. The mechanism by which herpes encephalitis is lethal is not yet clearly established. Although viral replication causes significant neural damage, growing evidence suggests that the inflammatory response also plays a major role in the pathogenesis of HSE. The main hypothesis of our team is that the innate immune response induced by HSV-1 infection is a double-edged sword. We believe that this immune response, critical to limit viral replication in the brain during the early phase of the disease, become later uncontrolled, and result in an exacerbated inflammatory response which is deleterious. Microglia are the only resident immune cells in the brain. Several studies reported that these cells, which form the first line of defense, play a key role in controlling CNS infections. In contrast, reactive microglia appear to contribute to neuroinflammation. In addition, it is proposed that these reactive microglia participate in the disruption of the blood-brain barrier during HSE, which we have also been able to observe in intranasally-infected BALB/c mice, as described in the first part of our work. However, the exact role of microglia in HE has not yet been elucidated. So, we decided to conduct this research to understand the involvement of microglia in the control of HE and to characterize the mechanisms exploited by these cells. We first evaluated the effect of microglial activation by macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) administered prior to the infection. This treatment significantly increased survival rate and decreased brain viral titers at day 6 pi. In parallel, the increased number of CD68⁺ microglia found in the brains of M-CSF treated mice led the question whether CSF1R⁺ microglia were responsible for this improvement of HSE prognosis. To answer that question, we depleted microglia using CSF1R-loxP-CX3CR1-cre/ERT2 mice. The reduced survival rate and higher brain viral titers for these microglia-depleted mice highlighted the importance of the microglial response during the early phase of infection. Following these observations, the mechanisms involved in the microglial immune response during HSE have been investigated using electron microscopy and single cell mRNA sequencing. In this part, we studied only the microglia located at VPL, which was identified as the most infected region of the infected C57BL/6 brain on day 6 p.i. using a new neurovirulent recombinant HSV-1 that we described in the first part of our work. Our results confirmed that microglia limit the infection by phagocytosis and antigen presentation. Furthermore, we described a new transcriptional response, associated with a rare cell population in VPL (Ventral posterolateral nucleus), which we called "in transition" microglia. The high expression of viral transcripts by these cells suggested that this distinct transcriptome might correspond to the intrinsic antiviral immune response of HSV-1-infected microglia in the VPL. Finally, the analysis of this transcriptome revealing the increased expression of genes involved in the production of interleukin IL-1β mediated by the NLRP3 inflammasome, suggested that these infected "in transition" microglia would promote the exacerbation of the inflammation in HE. Altogether, our work shows that the microglia, necessary in the early phase for a better control of HSE, can evolve towards a pro-inflammatory phenotype and contribute to the exacerbation of inflammation. Moreover, our results suggest that the infection of microglia by HSV-1 in VPL could thus induce the acquisition of this pro-inflammatory transcriptional response.

TLR3 est un récepteur endosomal qui détecte les doubles brins d’ARN produits par HSV-1 lors de sa réplication. La majorité des patients déclarés portants des mutations dans le gène TLR3 ont souffert de l’encéphalite herpétique (EH) sans autre phénotype clinique majeur. Nous avons décrit trois patients présentant des mutations dans le gène TLR3. Ici, nous reportons trois nouvelles formes de défaut AD de TLR3: G743D+R811I et L360P, qui chez deux patients confèrent un défaut AD de TLR3 par dominance négative et haplo-insuffisance; et R867Q, qui confère à un patient un défaut partial AR de TLR3. Les fibroblastes des patients présentent une diminution des réponses médiées par TLR3 et sont plus susceptibles à l’infection par le HSV-1. Le défaut de TLR3 est donc présent chez six (5%) patients sur les 120 EH patients étudiés. De plus, de façon surprenante, nous avons identifé deux mutations dans le gène TLR3 chez deux patients présentant des pneumonies sévères dues au virus de l’influenza A (IAV). Deux patients sont hétérozygotes pour les mutations P554S et P680L dans le gène TLR3. Il a été reporté que P554S est délétère et exerte un effet dominant-négatif chez les patients d’EH. P680L est aussi délétère et cause un défaut AD de TLR3 par haplo-insuffisance. Les fibroblastes hétérozygotes pour la mutation P680L ainsi que les cellules épitheliales pulmonaires dérivées de iPSCs présentent une susceptibilité accrue à IAV. Ces résultats suggèrent que le défaut de TLR3 ne cause pas seulement l’EH mais aussi des pneumonies IAV sévères via une diminution des réponses immunitaires dépendantes de TLR3 et médiées par IFN intrinsèques au système nerveux central et aux poumons. / TLR3 is an endosomal receptor for dsRNA, an intermediate of viral replication. Most of the reported human TLR3 deficiency related to life-threatening HSV-1 encephalitis (HSE), in otherwise healthy children. To date, we have described 3 patients with TLR3 deficiency and 7 patients with TLR3 pathway gene deficiency. We herein report the three novel forms of TLR3 deficiency: G743D+R811I and L360P in two patients underlie AD TLR3 deficiency due to dominant negative (DN) and haploinsufficiency, respectively, and R867Q in one patient leads to a partial AR TLR3 deficiency. The patients’ fibroblasts display impaired TLR3 responses and enhanced HSV-1 susceptibility. TLR3 deficiency is therefore a relatively common in childhood HSE, as it is found in six (5%) of the 120 patients studied. In addition, we surprisingly found two TLR3 mutations in two patients with influenza A virus (IAV) pneumonitis. The pathogenesis of isolated severe influenza is largely unknown, until we recently reported a child with AR IRF7 deficiency. Two patients are each heterozygous for P554S and P680L in TLR3. P554S is previously found to be deleterious and DN in HSE patients. P680L is also deleterious and causes AD TLR3 deficiency by haploinsufficiency. We show that P680L heterozygous fibroblasts fail to produce IFN-β and -λ upon poly(I:C) and IAV infection. Furthermore, both P680L heterozygous and AR TLR3-deficient fibroblasts and iPSCs-derived lung epithelium display enhanced susceptibility to IAV, like IRF7-deficient cells. These findings suggest that TLR3 deficiency underlies not only HSE but also severe influenza due to impaired TLR3-dependent, IFN-mediated, CNS or lung-intrinsic antiviral immunity.

La protéine découplante mitochondriale UCP2 est exprimée basalement dans différents tissus et le rôle de régulateur négatif de la production des espèces actives oxygénées (ROS) mitochondriales a été avancé. Les travaux présentés se sont intéressés à l'implication potentielle d'UCP2 dans le déroulement de la réponse immunitaire. Une induction de l'expression d'UCP2 est démontrée dans un modèle murin d'encéphalite par le virus Herpès simplex de type 1 (HSV-1) tout d'abord, puis dans un modèle parasitaire de leishmaniose causée par Leishmania donovani. Cette expression d'UCP2 a été observée dans les cellules immunitaires, colocalisée avec différents marqueurs inflammatoires exprimés à des niveaux élevés. Le modèle d'infection virale a montré un délai entre la mise en place de la réponse immunitaire innée et l'apparition d'UCP2 dans le cerveau, impliquant UCP2 dans les étapes tardives de la défense antivirale. A cette étape, la réplication du virus et la neuroinflammation sont au maximum, expliquant la susceptibilité des souris déficientes en UCP2. De plus, l'invalidation des gènes codant pour TNF-a et/ou IL-ip sensibilise au virus HSV-1 les souris naturellement résistantes et modifie le profil d'expression d'UCP2. Dans le modèle parasitaire, l'invalidation du gène codant UCP2 n'a pas permis de diminuer la croissance des parasites dans la première phase de la leishmaniose. Ainsi la protéine UCP2 ne serait pas impliquée dans les étapes précoces de mise en place de la défense antiparasitaire; les tactiques des parasites pour inhiber la réponse de l'hôte pourraient expliquer l'absence de différences nettes liées à la perte d'UCP2. La dernière étude portait sur la chronologie d'apparition d'UCP2 par rapport aux marqueurs neuroinflammatoires suite à l'injection intrastriatale de LPS. Dans ce modèle, une forte expression transitoire de TNF-a, bcBa et TLR2 est repérée dans la zone adjacente au site d'injection dès 6 h suivant l'injection puis diminue. UCP2 est seulement observable 48 h post injection dans les mêmes régions cérébrales. En conclusion, nous avons démontré dans 3 types de stimulations infectieuses de la réponse immunitaire que l'apparition d'UCP2 était liée avec un délai à l'expression de facteurs inflammatoires et UCP2 n'a semblée être qu'un marqueur. En effet, la fonction antioxydante tenue par UCP2 dans les étapes tardives de l'immunité semble modeste à la vue des résultats des souris déficientes en UCP2, mais ce rôle reste encore à préciser. / Mitochondrial uncoupling protein 2 (UCP2) is basally expressed in diverse tissues and a function of negative regulator of reactive oxygen species (ROS) production has been proposed. Studies presented in this thesis emphasize the potential role of UCP2 in immunity. Induction of UCP2 expression was demonstrated first in a murine model of encephalitis caused by Herpes simplex virus type 1 (HSV-1), then in a parasitic leishmaniasis model. UCP2 mRNA expression was observed in immune cells, colocalized with different inflammatory factors at high levels. Models of viral infection demonstrated that the transcriptional activation of UCP2 was delayed compared with the inflammatory response, involving UCP2 in the later stages of the antiviral response. At those later steps, viral replication and neuroinflammation were maximal, which could explain susceptibility in UCP2-deficient mice. Moreover, invalidation of the genes encoding TNFa and/or IL1B in resistant mice allowed HSV-1 for replicating in neurons and modified the distribution pattern of UCP2m RNA in the brain. In parasitic models, growth of parasites in UCP2- deficient mice was not impaired in the first phase of pathogenesis. Therefore UCP2 did not appear to be implicated in early steps of the antiparasitic response; parasites could develop strategies for inhibiting the host response, which would explain the similarity in the immune responses between UCP2-deficient and wild type mice. The last study addressed the chronology of UCP2 expression in relation with neuroinflammation following intrastriatal injection of LPS. In this model, strong and transitory expressions of TNFa, IkB and TLR2 were shown in ipsilateral region at 6h after injection. UCP2 was only expressed 48h post injection in the same cerebral region. In conclusion, we have demonstrated, in three models of infection triggering an immune response that the induction of UCP2 expression occurs in a coordinated but delayed manner with that of common inflammatory factors. UCP2 appears to be a marker of the severity of the immune response. It does not appear, based on the results obtained in UCP2-deficient mice, to play an essential role in the models of infection that we used. The role of UCP2 in those models remains to be folly elucidated.