Orientador: Alexandrina Sartori / Banca: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Banca: Virmondes Rodrigues / Resumo: A necessidade de uma vacina mais segura e eficaz para a profilaxia da tuberculose (TB) e consenso na comunidade cientifica. A vacina genica contendo o gene da proteina de choque termico de 65 KDa (hsp65) do Mycobacterium leprae, e denominada pVAXhsp65, vem sendo investigada no Brasil. Esta vacina induz imunidade protetora contra a TB experimental em camundongos e cobaias. Como o gene desta vacina codifica uma proteina altamente conservada, existe a preocupacao de que a mesma induza autoimunidade. O objetivo deste trabalho foi, portanto, investigar se esta vacina modula o desenvolvimento da encefalite autoimune experimental (EAE), que e um modelo para estudo de Esclerose Multipla. Esta investigacao foi feita em tres etapas: padronizacao da EAE em ratos Lewis, caracterizacao da resposta imune induzida pela vacina pVAXhsp65 nestes animais e, finalmente, avaliacao do efeito desta vacina nas caracteristicas clinicas e imunologicas da EAE induzida nestes animais. Ratos Lewis femeas imunizados no coxim plantar com 50 Êg de mielina, associada ao Adjuvante Completo de Freund, desenvolveram doenca tipica, caracterizada por perda acentuada de peso, escore clinico elevado e alta producao de IFN-Á e TNF-¿. A imunizacao dos animais com 3 doses de pVAXhsp65 por via intramuscular nao desencadeou resposta imune humoral, entretanto, induziu resposta imune celular, caracterizada pela producao de IFN-Á por celulas esplenicas. Animais previamente vacinados desenvolveram EAE com caracteristicas clinicas e imunologicas similares as observadas em animais nao vacinados. Portanto, este trabalho permitiu padronizar de forma satisfatoria a EAE em ratos Lewis o que permitira a utilizacao deste modelo em futuras investigacoes. Alem disso, constatamos que a imunizacao destes animais com DNAhsp65 nao alterou o desenvolvimento tipico da EAE, ou seja, esta doenca nao se manifestou de forma mais grave ou branda. / Abstract: The development of an effective tuberculosis (TB) vaccine is an urgent priority. A genetic vaccine containing the heat shock protein (hsp65) gene from Mycobacterium leprae (pVAXhsp65) showed prophylactic and therapeutic activity in experimental TB. As anti-hsp65 immune response is present in both, multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), it is important to evaluate if pVAXhsp65 immunization affects EAE development. To test this possibility we first optimized EAE development in female Lewis rats. The best procedure included immunization in the footpad with 50 ìg of myelin associated with Complete Freund Adjuvant. This triggered a typical disease, characterized by significant weight loss, high clinical scores and elevated IFN-ã and TNF-á production. Immunization with pVAXhsp65 induced immune response characterized by absence of anti-hsp65 antibodies but significant IFN-ã production by splenic cells stimulated with recombinant rhsp65. Animals previously immunized with pVAXhsp65 developed an EAE with weight loss, clinical score and immune response very similar to non-immunized rats. This investigation allowed the optimization of a very promising model of multiple sclerosis that will benefit other research projects in our laboratory. In addition, these results showed that immunization of Lewis rats with pVAXhsp65 did not exacerbate or delay EAE development. / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-03-05Bitstream added on 2014-06-13T20:31:22Z : No. of bitstreams: 1 seger_j_me_botfm.pdf: 389931 bytes, checksum: 81c6da647f5f07996792ee710b5e8a1e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A necessidade de uma vacina mais segura e eficaz para a profilaxia da tuberculose (TB) e consenso na comunidade cientifica. A vacina genica contendo o gene da proteina de choque termico de 65 KDa (hsp65) do Mycobacterium leprae, e denominada pVAXhsp65, vem sendo investigada no Brasil. Esta vacina induz imunidade protetora contra a TB experimental em camundongos e cobaias. Como o gene desta vacina codifica uma proteina altamente conservada, existe a preocupacao de que a mesma induza autoimunidade. O objetivo deste trabalho foi, portanto, investigar se esta vacina modula o desenvolvimento da encefalite autoimune experimental (EAE), que e um modelo para estudo de Esclerose Multipla. Esta investigacao foi feita em tres etapas: padronizacao da EAE em ratos Lewis, caracterizacao da resposta imune induzida pela vacina pVAXhsp65 nestes animais e, finalmente, avaliacao do efeito desta vacina nas caracteristicas clinicas e imunologicas da EAE induzida nestes animais. Ratos Lewis femeas imunizados no coxim plantar com 50 Êg de mielina, associada ao Adjuvante Completo de Freund, desenvolveram doenca tipica, caracterizada por perda acentuada de peso, escore clinico elevado e alta producao de IFN-Á e TNF-¿. A imunizacao dos animais com 3 doses de pVAXhsp65 por via intramuscular nao desencadeou resposta imune humoral, entretanto, induziu resposta imune celular, caracterizada pela producao de IFN-Á por celulas esplenicas. Animais previamente vacinados desenvolveram EAE com caracteristicas clinicas e imunologicas similares as observadas em animais nao vacinados. Portanto, este trabalho permitiu padronizar de forma satisfatoria a EAE em ratos Lewis o que permitira a utilizacao deste modelo em futuras investigacoes. Alem disso, constatamos que a imunizacao destes animais com DNAhsp65 nao alterou o desenvolvimento tipico da EAE, ou seja, esta doenca nao se manifestou de forma mais grave ou branda. / The development of an effective tuberculosis (TB) vaccine is an urgent priority. A genetic vaccine containing the heat shock protein (hsp65) gene from Mycobacterium leprae (pVAXhsp65) showed prophylactic and therapeutic activity in experimental TB. As anti-hsp65 immune response is present in both, multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), it is important to evaluate if pVAXhsp65 immunization affects EAE development. To test this possibility we first optimized EAE development in female Lewis rats. The best procedure included immunization in the footpad with 50 ìg of myelin associated with Complete Freund Adjuvant. This triggered a typical disease, characterized by significant weight loss, high clinical scores and elevated IFN-ã and TNF-á production. Immunization with pVAXhsp65 induced immune response characterized by absence of anti-hsp65 antibodies but significant IFN-ã production by splenic cells stimulated with recombinant rhsp65. Animals previously immunized with pVAXhsp65 developed an EAE with weight loss, clinical score and immune response very similar to non-immunized rats. This investigation allowed the optimization of a very promising model of multiple sclerosis that will benefit other research projects in our laboratory. In addition, these results showed that immunization of Lewis rats with pVAXhsp65 did not exacerbate or delay EAE development.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-06Bitstream added on 2014-06-13T19:51:42Z : No. of bitstreams: 1 pezavento_sfgz_me_botfm.pdf: 924376 bytes, checksum: e516f8ff865bbc2e7b75d6fc6e8d7450 (MD5) / A única vacina disponível contra a tuberculose (TB) é o bacilo de Calmette- Guérin (BCG), que é constituída por uma cepa de Mycobacterium bovis vivo atenuado, mas que possui variabilidade de proteção de 0 a 80%. Portanto é necessário o desenvolvimento de novas vacinas para o controle dessa infecção. Dentre as novas formulações profiláticas em teste para TB destacam-se as vacinas gênicas, sendo a DNAhsp65 a vacina investigada por nosso grupo. A DNAhsp65 é uma construção que contém o gene que codifica a proteína de choque térmico de 65KDa do M. leprae. Em virtude da elevada homologia entre a hsp65 micobacteriana e a hsp60 dos mamíferos, pode ocorrer mimetismo antigênico, ou seja, reatividade cruzada entre anticorpos e células T específicas para hsp65 micobacteriana e hsp60 humana. Nesse contexto, nosso grupo tem estudado o possível efeito colateral da DNAhsp65 no desenvolvimento de doenças autoimunes. Neste projeto foi investigado o efeito (proteção, exacerbação ou inocuidade) de diferentes formulações vacinais para TB na encefalite autoimune experimental (EAE). Os objetivos foram caracterizar a resposta imune específica induzida pela DNAhsp65 em ratos Lewis e avaliar o efeito imunomodulador tanto da estratégia clássica de imunização (3 doses de DNAhsp65 por via im) quanto da estratégia prime-boost BCG / DNAhsp65, nas características clínicas, imunológicas e histológicas da EAE. Quanto à imunogenicidade da DNAhsp65, foram testadas duas doses da vacina administradas via intramuscular (100 e 300 μg), sendo que somente a maior dose induziu IgG2b específica para hsp65 e produção de IFN- em cultura de células esplênicas estimuladas in vitro com rhsp65. Para avaliar o efeito da imunização com DNAhsp65 ou do prime-boost BCG /DNAhsp65 no desenvolvimento da EAE, os animais foram previamente imunizados com 3 doses de 300 μg de DNAhsp65 ou... / BCG is the only accepted vaccine against tuberculosis (TB) but its protective ability is very limited. Many new vaccines are therefore being evaluated. Our group has been working with DNAhsp65 that is a genetic construction containing the gene of hsp65 from Mycobacterium leprae. In previous experimental work we demonstrated that both, DNAhsp65 alone or associated with BCG, in a prime-boost regimen, were effective to control TB. A possible deleterious effect related to autoimmunity needed to be tested because hsp65 is highly homologous to the correspondent mammalian protein. In this investigation we tested the effect of a previous immunization with DNAhsp65 alone or associated with BCG in a rat model of multiple sclerosis. Female Lewis rats were immunized with 3 doses of DNAhsp65 or primed with BCG followed by 2 DNAhsp65 boosters. The animals were then immunized with myelin associated with Complete Freund Adjuvant to develop experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). The following parameters were evaluated: weight loss, clinical score, inflammation at the central nervous system (CNS) and immune response against myelin. No deleterious effect was associated with these immunizations schedules. Immunized animals equally lost weight, the clinical scores were similar and inflammation at the CNS did not increase. Interestingly, both procedures determined decreased inflammation in the brain and lumbar spinal cord. This was concurrent with a modulatory effect over cytokine production by peripheral lymphoid organs. Cell cultures from spleen and lymph nodes in vitro stimulated with myelin produced less IFN- and IL-10, respectively. This phenomenon was more clear in rats immunized with the genetic vaccine alone than with the prime-boost strategy. Together the results suggest that these strategies for TB prophylaxis would not accelerate or aggravate MS, being therefore... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Alexandrina Sartori / Banca: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Banca: Virmondes Rodrigues Júnior / Resumo: A única vacina disponível contra a tuberculose (TB) é o bacilo de Calmette- Guérin (BCG), que é constituída por uma cepa de Mycobacterium bovis vivo atenuado, mas que possui variabilidade de proteção de 0 a 80%. Portanto é necessário o desenvolvimento de novas vacinas para o controle dessa infecção. Dentre as novas formulações profiláticas em teste para TB destacam-se as vacinas gênicas, sendo a DNAhsp65 a vacina investigada por nosso grupo. A DNAhsp65 é uma construção que contém o gene que codifica a proteína de choque térmico de 65KDa do M. leprae. Em virtude da elevada homologia entre a hsp65 micobacteriana e a hsp60 dos mamíferos, pode ocorrer mimetismo antigênico, ou seja, reatividade cruzada entre anticorpos e células T específicas para hsp65 micobacteriana e hsp60 humana. Nesse contexto, nosso grupo tem estudado o possível efeito colateral da DNAhsp65 no desenvolvimento de doenças autoimunes. Neste projeto foi investigado o efeito (proteção, exacerbação ou inocuidade) de diferentes formulações vacinais para TB na encefalite autoimune experimental (EAE). Os objetivos foram caracterizar a resposta imune específica induzida pela DNAhsp65 em ratos Lewis e avaliar o efeito imunomodulador tanto da estratégia clássica de imunização (3 doses de DNAhsp65 por via im) quanto da estratégia prime-boost BCG / DNAhsp65, nas características clínicas, imunológicas e histológicas da EAE. Quanto à imunogenicidade da DNAhsp65, foram testadas duas doses da vacina administradas via intramuscular (100 e 300 μg), sendo que somente a maior dose induziu IgG2b específica para hsp65 e produção de IFN- em cultura de células esplênicas estimuladas in vitro com rhsp65. Para avaliar o efeito da imunização com DNAhsp65 ou do prime-boost BCG /DNAhsp65 no desenvolvimento da EAE, os animais foram previamente imunizados com 3 doses de 300 μg de DNAhsp65 ou... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: BCG is the only accepted vaccine against tuberculosis (TB) but its protective ability is very limited. Many new vaccines are therefore being evaluated. Our group has been working with DNAhsp65 that is a genetic construction containing the gene of hsp65 from Mycobacterium leprae. In previous experimental work we demonstrated that both, DNAhsp65 alone or associated with BCG, in a prime-boost regimen, were effective to control TB. A possible deleterious effect related to autoimmunity needed to be tested because hsp65 is highly homologous to the correspondent mammalian protein. In this investigation we tested the effect of a previous immunization with DNAhsp65 alone or associated with BCG in a rat model of multiple sclerosis. Female Lewis rats were immunized with 3 doses of DNAhsp65 or primed with BCG followed by 2 DNAhsp65 boosters. The animals were then immunized with myelin associated with Complete Freund Adjuvant to develop experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). The following parameters were evaluated: weight loss, clinical score, inflammation at the central nervous system (CNS) and immune response against myelin. No deleterious effect was associated with these immunizations schedules. Immunized animals equally lost weight, the clinical scores were similar and inflammation at the CNS did not increase. Interestingly, both procedures determined decreased inflammation in the brain and lumbar spinal cord. This was concurrent with a modulatory effect over cytokine production by peripheral lymphoid organs. Cell cultures from spleen and lymph nodes in vitro stimulated with myelin produced less IFN- and IL-10, respectively. This phenomenon was more clear in rats immunized with the genetic vaccine alone than with the prime-boost strategy. Together the results suggest that these strategies for TB prophylaxis would not accelerate or aggravate MS, being therefore... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre