Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-03-26. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:42Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10645.pdf: 540710 bytes, checksum: 5f5de7e771c848ceae0f6cfc22f8c4e2 (MD5) / A imunização gênica pode contornar alguns problemas encontrados na imunização protéica, quais sejam as dificuldades na obtenção do antígeno purificado e a reatividade da resposta imune (r.i.) com a forma nativa do antígeno. O gene que codifica o antígeno de interesse, carregado por um vetor, é injetado no animal e a proteína é expressa in vivo, com a estrutura tridimensional apropriada, favorecendo a produção de anticorpos específicos. Entretanto, o esquema de imunização gênica pode determinar a eficácia da vacina de DNA. No presente estudo, comparamos quatro protocolos de imunização gênica, usando três antígenos diferentes: dois deles guardam grande homologia na escala filogenética, human vascular endothelial growth factor 165 (hVEGF165) e human fibroblast growth factor-2 (hFGF-2), e um de origem vegetal, o inibidor de serina protease extraído de Bauhinia bauhinioides (BbKi). Para tanto, grupos de camundongos Balb/c foram imunizados com DNA plasmideal carregando o gene hVEGF165, hFGF-2 ou BbKi. No primeiro protocolo, imunizamos os animais via intraesplênica (i.s.); no segundo, via intramuscular (i.m.); no terceiro, via i.m. seguida de eletroporação (ep); e no quarto, via i.m. seguida de ep em animais préimunizados com células modificadas para expressar os respectivos antígenos. Soros de animais imunizados foram analisados por ELISA para detecção da presença de anticorpos anti-hVEGF165, anti-hFGF-2 ou anti-BbKi. Os resultados mostraram que a imunização i.s. não provocou r.i. humoral detectável em nossas condições. Por outro lado, análises estatísticas indicaram que a ep melhorou muito a r.i. à imunização i.m. e que três imunizações gênicas seguidas de ep produzem o mesmo efeito que duas da mesma forma em animais pré-imunizados com células transfectadas para expressar o antígeno correspondente. Nossos resultados mostraram que todos os protocolos funcionaram de maneira similar para os três antígenos estudados e que a imunização gênica via i.m. seguida de ep foi o esquema de imunização mais vantajoso. Ainda, a r.i. à imunização i.m. seguida de ep foi comparável à obtida por imunização protéica no caso da proteína vegetal. Finalmente, esses achados permitiram selecionar um protocolo eficiente de imunização gênica que torna possível a obtenção de anticorpos na falta da proteína purificada. / Gene immunization may bypass some difficulties found with protein immunogen, such as the obtainment of purified antigen and the immune response reactivity to its native conformation. Thus, antigen encoding DNA inserted into a vector is inoculated into animal and the protein expressed in vivo with the appropriate three-dimensional structure stimulates the production of specific antibodies. However, the gene immunization methods may determine the efficacy of DNA vaccine. The present study compared four protocols of DNA immunization, using three different antigens: two of them phylogenetically conservative, human vascular endothelial growth factor 165 (hVEGF165) and human fibroblast growth factor-2 (hFGF-2), and other from vegetal origin, Kunitz-type serine protease inhibitor from Bauhinia bauhinioides (BbKi). For this, Balb/c mice were immunized with plasmid DNA encoding hVEGF165, hFGF-2 or BbKi genes. In the first protocol, animals were immunized by intrasplenic (i.s.) pathway; in the second, intramuscularly (i.m.); in the third, i.m. injections were followed by electroporation (ep); and in the fourth, i.m. injections followed by ep were performed in animals pre-immunized with antigen-transfected cells. Sera were analyzed by ELISA to detect the presence of anti-hVEGF165, -hFGF-2 or -BbKi antibodies. Results showed that i.s. immunization did not elicit detectable humoral immune response in our conditions. On the other hand, statistical analyses revealed that the ep improved the immune response to i.m. immunization and that three DNA immunizations followed by ep elicited the same effect obtained by two i.m. immunizations followed by ep in pre-immunized animals with antigentransfected cells. Our results showed that all protocols worked similarly for the three studied antigens and that i.m. gene immunization followed by ep was the more advantageous protocol. In addition, the immune response to i.m. immunization followed by ep was comparable to that obtained by protein immunization. Finally, these data allowed us select an efficient DNA immunization protocol that makes possible the antibody obtainment in the lack of purified protein. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-03-05Bitstream added on 2014-06-13T20:31:22Z : No. of bitstreams: 1 seger_j_me_botfm.pdf: 389931 bytes, checksum: 81c6da647f5f07996792ee710b5e8a1e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A necessidade de uma vacina mais segura e eficaz para a profilaxia da tuberculose (TB) e consenso na comunidade cientifica. A vacina genica contendo o gene da proteina de choque termico de 65 KDa (hsp65) do Mycobacterium leprae, e denominada pVAXhsp65, vem sendo investigada no Brasil. Esta vacina induz imunidade protetora contra a TB experimental em camundongos e cobaias. Como o gene desta vacina codifica uma proteina altamente conservada, existe a preocupacao de que a mesma induza autoimunidade. O objetivo deste trabalho foi, portanto, investigar se esta vacina modula o desenvolvimento da encefalite autoimune experimental (EAE), que e um modelo para estudo de Esclerose Multipla. Esta investigacao foi feita em tres etapas: padronizacao da EAE em ratos Lewis, caracterizacao da resposta imune induzida pela vacina pVAXhsp65 nestes animais e, finalmente, avaliacao do efeito desta vacina nas caracteristicas clinicas e imunologicas da EAE induzida nestes animais. Ratos Lewis femeas imunizados no coxim plantar com 50 Êg de mielina, associada ao Adjuvante Completo de Freund, desenvolveram doenca tipica, caracterizada por perda acentuada de peso, escore clinico elevado e alta producao de IFN-Á e TNF-¿. A imunizacao dos animais com 3 doses de pVAXhsp65 por via intramuscular nao desencadeou resposta imune humoral, entretanto, induziu resposta imune celular, caracterizada pela producao de IFN-Á por celulas esplenicas. Animais previamente vacinados desenvolveram EAE com caracteristicas clinicas e imunologicas similares as observadas em animais nao vacinados. Portanto, este trabalho permitiu padronizar de forma satisfatoria a EAE em ratos Lewis o que permitira a utilizacao deste modelo em futuras investigacoes. Alem disso, constatamos que a imunizacao destes animais com DNAhsp65 nao alterou o desenvolvimento tipico da EAE, ou seja, esta doenca nao se manifestou de forma mais grave ou branda. / The development of an effective tuberculosis (TB) vaccine is an urgent priority. A genetic vaccine containing the heat shock protein (hsp65) gene from Mycobacterium leprae (pVAXhsp65) showed prophylactic and therapeutic activity in experimental TB. As anti-hsp65 immune response is present in both, multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), it is important to evaluate if pVAXhsp65 immunization affects EAE development. To test this possibility we first optimized EAE development in female Lewis rats. The best procedure included immunization in the footpad with 50 ìg of myelin associated with Complete Freund Adjuvant. This triggered a typical disease, characterized by significant weight loss, high clinical scores and elevated IFN-ã and TNF-á production. Immunization with pVAXhsp65 induced immune response characterized by absence of anti-hsp65 antibodies but significant IFN-ã production by splenic cells stimulated with recombinant rhsp65. Animals previously immunized with pVAXhsp65 developed an EAE with weight loss, clinical score and immune response very similar to non-immunized rats. This investigation allowed the optimization of a very promising model of multiple sclerosis that will benefit other research projects in our laboratory. In addition, these results showed that immunization of Lewis rats with pVAXhsp65 did not exacerbate or delay EAE development.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-06Bitstream added on 2014-06-13T19:51:42Z : No. of bitstreams: 1 pezavento_sfgz_me_botfm.pdf: 924376 bytes, checksum: e516f8ff865bbc2e7b75d6fc6e8d7450 (MD5) / A única vacina disponível contra a tuberculose (TB) é o bacilo de Calmette- Guérin (BCG), que é constituída por uma cepa de Mycobacterium bovis vivo atenuado, mas que possui variabilidade de proteção de 0 a 80%. Portanto é necessário o desenvolvimento de novas vacinas para o controle dessa infecção. Dentre as novas formulações profiláticas em teste para TB destacam-se as vacinas gênicas, sendo a DNAhsp65 a vacina investigada por nosso grupo. A DNAhsp65 é uma construção que contém o gene que codifica a proteína de choque térmico de 65KDa do M. leprae. Em virtude da elevada homologia entre a hsp65 micobacteriana e a hsp60 dos mamíferos, pode ocorrer mimetismo antigênico, ou seja, reatividade cruzada entre anticorpos e células T específicas para hsp65 micobacteriana e hsp60 humana. Nesse contexto, nosso grupo tem estudado o possível efeito colateral da DNAhsp65 no desenvolvimento de doenças autoimunes. Neste projeto foi investigado o efeito (proteção, exacerbação ou inocuidade) de diferentes formulações vacinais para TB na encefalite autoimune experimental (EAE). Os objetivos foram caracterizar a resposta imune específica induzida pela DNAhsp65 em ratos Lewis e avaliar o efeito imunomodulador tanto da estratégia clássica de imunização (3 doses de DNAhsp65 por via im) quanto da estratégia prime-boost BCG / DNAhsp65, nas características clínicas, imunológicas e histológicas da EAE. Quanto à imunogenicidade da DNAhsp65, foram testadas duas doses da vacina administradas via intramuscular (100 e 300 μg), sendo que somente a maior dose induziu IgG2b específica para hsp65 e produção de IFN- em cultura de células esplênicas estimuladas in vitro com rhsp65. Para avaliar o efeito da imunização com DNAhsp65 ou do prime-boost BCG /DNAhsp65 no desenvolvimento da EAE, os animais foram previamente imunizados com 3 doses de 300 μg de DNAhsp65 ou... / BCG is the only accepted vaccine against tuberculosis (TB) but its protective ability is very limited. Many new vaccines are therefore being evaluated. Our group has been working with DNAhsp65 that is a genetic construction containing the gene of hsp65 from Mycobacterium leprae. In previous experimental work we demonstrated that both, DNAhsp65 alone or associated with BCG, in a prime-boost regimen, were effective to control TB. A possible deleterious effect related to autoimmunity needed to be tested because hsp65 is highly homologous to the correspondent mammalian protein. In this investigation we tested the effect of a previous immunization with DNAhsp65 alone or associated with BCG in a rat model of multiple sclerosis. Female Lewis rats were immunized with 3 doses of DNAhsp65 or primed with BCG followed by 2 DNAhsp65 boosters. The animals were then immunized with myelin associated with Complete Freund Adjuvant to develop experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). The following parameters were evaluated: weight loss, clinical score, inflammation at the central nervous system (CNS) and immune response against myelin. No deleterious effect was associated with these immunizations schedules. Immunized animals equally lost weight, the clinical scores were similar and inflammation at the CNS did not increase. Interestingly, both procedures determined decreased inflammation in the brain and lumbar spinal cord. This was concurrent with a modulatory effect over cytokine production by peripheral lymphoid organs. Cell cultures from spleen and lymph nodes in vitro stimulated with myelin produced less IFN- and IL-10, respectively. This phenomenon was more clear in rats immunized with the genetic vaccine alone than with the prime-boost strategy. Together the results suggest that these strategies for TB prophylaxis would not accelerate or aggravate MS, being therefore... (Complete abstract click electronic access below)

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica endêmica na América Latina, sendo o Brasil o país com maior número de casos. A enfermidade é adquirida por meio da inalação de propágulos de fungos do gênero Paracoccidioides e afeta principalmente os pulmões. Anteriormente, nosso grupo mostrou que o tratamento de camundongos infectados com P. brasiliensis com uma dose da proteína de estresse térmico de 60kDa recombinante de P. brasiliensis (PbHsp60r) induzia um efeito prejudicial na PCM, aumentando carga fúngica e lesão pulmonar, quando comparado a animais infectados e tratados com o veículo. No presente trabalho, buscou-se determinar se outra forma de apresentação da PbHsp60r poderia gerar um efeito benéfico em camundongos infectados com P. brasiliensis. Optou-se pelo plasmídeo pVAX1 subclonado com o gene da PbHsp60 (pVAX1-PB_HSP60). Após subclonagem do gene, foi mostrado, por Western blot, que anticorpos específicos para PbHsp60 eram produzidos por camundongos imunizados com três doses da construção e que a proteína era sintetizada por células HEK293 transfectadas com pVAX1-PB_HSP60. O tratamento dos animais infectados com três doses de pVAX1-PB_HSP60 ou pVAX1 subclonado com Hsp65 de M. leprae (pVAX1-ML_HSP65), que reconhecidamente melhora a PCM experimental, induziu uma diminuição de carga fúngica e da lesão pulmonar quando comparado com animais infectados e tratados com pVAX1 ou PBS. Uma dose de uma dessas construções não induziu melhora significativa na PCM quando comparado aos controles. Como esperado, os animais infectados e tratados com uma dose da PbHsp60r tiveram uma piora dos parâmetros de infecção, o que curiosamente não foi observado com os animais tratados com três doses dessa proteína recombinante, cuja melhora foi muito similar a dos animais infectados e tratados com três doses das construções plasmidiais. Ao pesquisar porque uma dose induz piora da infecção, observouse que PbHsp60r induz morte de linfócitos esplênicos in vitro, em um mecanismo dependente de TLR4, proteína adaptadora TRIF e receptor 1 de TNF. Esses resultados abrem perspectivas de se avaliar a importância da morte de células da resposta imunológica no curso da infecção por P. brasiliensis. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis endemic in Latin America and Brazil, which holds most of the PCM cases. PCM is acquired through the inhalation of propagules of fungi from genus Paracoccidioides and mainly affects the lungs. We have previously shown that P. brasiliensis-infected mice treated with single dose of recombinant 60-kDa-heat shock protein from P. brasiliensis (rPbHsp60) had a worsening of infection when compared with animals only infected. In this study, we investigate whether the treatment of infected mice with PbHsp60 gene cloned into a plasmid (pVAX1-PB_HSP60) would render an efficient immune response and improvement of the disease. After cloning of the PbHsp60 gene, we first showed that immunization of mice with three doses of pVAX1-PB_HSP60 induced production of specific anti-PbHsp60 antibody and that pVAX1-PB_HSP60-transfected HEK293 cells synthesized the PbHsp60. Interestingly, mice treated with three doses, but not single dose, of pVAX1-PB_HSP60, and pVAX1 subcloned with Hsp65 from Mycobacterium leprae (pVAX1- ML_HSP65), which induces a beneficial effect in experimental PCM, had an improvement in fungal load and lung injury when compared with infected mice treated with pVAX1 or PBS. Unlike animals infected and treated with single dose of rPbHsp60, which had a worsening of infection parameters, treatment with three doses of rPbHsp60 interestingly induced a beneficial effect in the infected animals, as seen with the plasmid constructs. In investigating the causes of this worsening of PCM triggered by injection of a single dose of protein, we showed that rPbHsp60 induced the death of splenic lymphocytes in vitro in a mechanism dependent on Tolllike receptor 4, TRIF adapter protein and TNF receptor 1. These results open perspectives to evaluate the importance of cell death of the immune response in the course of P. brasiliensis infection.

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica endêmica na América Latina, sendo o Brasil o país com maior número de casos. A enfermidade é adquirida por meio da inalação de propágulos de fungos do gênero Paracoccidioides e afeta principalmente os pulmões. Anteriormente, nosso grupo mostrou que o tratamento de camundongos infectados com P. brasiliensis com uma dose da proteína de estresse térmico de 60kDa recombinante de P. brasiliensis (PbHsp60r) induzia um efeito prejudicial na PCM, aumentando carga fúngica e lesão pulmonar, quando comparado a animais infectados e tratados com o veículo. No presente trabalho, buscou-se determinar se outra forma de apresentação da PbHsp60r poderia gerar um efeito benéfico em camundongos infectados com P. brasiliensis. Optou-se pelo plasmídeo pVAX1 subclonado com o gene da PbHsp60 (pVAX1-PB_HSP60). Após subclonagem do gene, foi mostrado, por Western blot, que anticorpos específicos para PbHsp60 eram produzidos por camundongos imunizados com três doses da construção e que a proteína era sintetizada por células HEK293 transfectadas com pVAX1-PB_HSP60. O tratamento dos animais infectados com três doses de pVAX1-PB_HSP60 ou pVAX1 subclonado com Hsp65 de M. leprae (pVAX1-ML_HSP65), que reconhecidamente melhora a PCM experimental, induziu uma diminuição de carga fúngica e da lesão pulmonar quando comparado com animais infectados e tratados com pVAX1 ou PBS. Uma dose de uma dessas construções não induziu melhora significativa na PCM quando comparado aos controles. Como esperado, os animais infectados e tratados com uma dose da PbHsp60r tiveram uma piora dos parâmetros de infecção, o que curiosamente não foi observado com os animais tratados com três doses dessa proteína recombinante, cuja melhora foi muito similar a dos animais infectados e tratados com três doses das construções plasmidiais. Ao pesquisar porque uma dose induz piora da infecção, observouse que PbHsp60r induz morte de linfócitos esplênicos in vitro, em um mecanismo dependente de TLR4, proteína adaptadora TRIF e receptor 1 de TNF. Esses resultados abrem perspectivas de se avaliar a importância da morte de células da resposta imunológica no curso da infecção por P. brasiliensis. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis endemic in Latin America and Brazil, which holds most of the PCM cases. PCM is acquired through the inhalation of propagules of fungi from genus Paracoccidioides and mainly affects the lungs. We have previously shown that P. brasiliensis-infected mice treated with single dose of recombinant 60-kDa-heat shock protein from P. brasiliensis (rPbHsp60) had a worsening of infection when compared with animals only infected. In this study, we investigate whether the treatment of infected mice with PbHsp60 gene cloned into a plasmid (pVAX1-PB_HSP60) would render an efficient immune response and improvement of the disease. After cloning of the PbHsp60 gene, we first showed that immunization of mice with three doses of pVAX1-PB_HSP60 induced production of specific anti-PbHsp60 antibody and that pVAX1-PB_HSP60-transfected HEK293 cells synthesized the PbHsp60. Interestingly, mice treated with three doses, but not single dose, of pVAX1-PB_HSP60, and pVAX1 subcloned with Hsp65 from Mycobacterium leprae (pVAX1- ML_HSP65), which induces a beneficial effect in experimental PCM, had an improvement in fungal load and lung injury when compared with infected mice treated with pVAX1 or PBS. Unlike animals infected and treated with single dose of rPbHsp60, which had a worsening of infection parameters, treatment with three doses of rPbHsp60 interestingly induced a beneficial effect in the infected animals, as seen with the plasmid constructs. In investigating the causes of this worsening of PCM triggered by injection of a single dose of protein, we showed that rPbHsp60 induced the death of splenic lymphocytes in vitro in a mechanism dependent on Tolllike receptor 4, TRIF adapter protein and TNF receptor 1. These results open perspectives to evaluate the importance of cell death of the immune response in the course of P. brasiliensis infection.

Orientador: Alexandrina Sartori / Banca: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Banca: Virmondes Rodrigues Júnior / Resumo: A única vacina disponível contra a tuberculose (TB) é o bacilo de Calmette- Guérin (BCG), que é constituída por uma cepa de Mycobacterium bovis vivo atenuado, mas que possui variabilidade de proteção de 0 a 80%. Portanto é necessário o desenvolvimento de novas vacinas para o controle dessa infecção. Dentre as novas formulações profiláticas em teste para TB destacam-se as vacinas gênicas, sendo a DNAhsp65 a vacina investigada por nosso grupo. A DNAhsp65 é uma construção que contém o gene que codifica a proteína de choque térmico de 65KDa do M. leprae. Em virtude da elevada homologia entre a hsp65 micobacteriana e a hsp60 dos mamíferos, pode ocorrer mimetismo antigênico, ou seja, reatividade cruzada entre anticorpos e células T específicas para hsp65 micobacteriana e hsp60 humana. Nesse contexto, nosso grupo tem estudado o possível efeito colateral da DNAhsp65 no desenvolvimento de doenças autoimunes. Neste projeto foi investigado o efeito (proteção, exacerbação ou inocuidade) de diferentes formulações vacinais para TB na encefalite autoimune experimental (EAE). Os objetivos foram caracterizar a resposta imune específica induzida pela DNAhsp65 em ratos Lewis e avaliar o efeito imunomodulador tanto da estratégia clássica de imunização (3 doses de DNAhsp65 por via im) quanto da estratégia prime-boost BCG / DNAhsp65, nas características clínicas, imunológicas e histológicas da EAE. Quanto à imunogenicidade da DNAhsp65, foram testadas duas doses da vacina administradas via intramuscular (100 e 300 μg), sendo que somente a maior dose induziu IgG2b específica para hsp65 e produção de IFN- em cultura de células esplênicas estimuladas in vitro com rhsp65. Para avaliar o efeito da imunização com DNAhsp65 ou do prime-boost BCG /DNAhsp65 no desenvolvimento da EAE, os animais foram previamente imunizados com 3 doses de 300 μg de DNAhsp65 ou... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: BCG is the only accepted vaccine against tuberculosis (TB) but its protective ability is very limited. Many new vaccines are therefore being evaluated. Our group has been working with DNAhsp65 that is a genetic construction containing the gene of hsp65 from Mycobacterium leprae. In previous experimental work we demonstrated that both, DNAhsp65 alone or associated with BCG, in a prime-boost regimen, were effective to control TB. A possible deleterious effect related to autoimmunity needed to be tested because hsp65 is highly homologous to the correspondent mammalian protein. In this investigation we tested the effect of a previous immunization with DNAhsp65 alone or associated with BCG in a rat model of multiple sclerosis. Female Lewis rats were immunized with 3 doses of DNAhsp65 or primed with BCG followed by 2 DNAhsp65 boosters. The animals were then immunized with myelin associated with Complete Freund Adjuvant to develop experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). The following parameters were evaluated: weight loss, clinical score, inflammation at the central nervous system (CNS) and immune response against myelin. No deleterious effect was associated with these immunizations schedules. Immunized animals equally lost weight, the clinical scores were similar and inflammation at the CNS did not increase. Interestingly, both procedures determined decreased inflammation in the brain and lumbar spinal cord. This was concurrent with a modulatory effect over cytokine production by peripheral lymphoid organs. Cell cultures from spleen and lymph nodes in vitro stimulated with myelin produced less IFN- and IL-10, respectively. This phenomenon was more clear in rats immunized with the genetic vaccine alone than with the prime-boost strategy. Together the results suggest that these strategies for TB prophylaxis would not accelerate or aggravate MS, being therefore... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre