Le long de l’axone d’un neurone mature, les microtubules (MTs) sont organisés en faisceaux parallèles et orientés. Cette géométrie devrait en théorie favoriser la formation de fagots serrés de MTs par encombrement macromoléculaire au sein de l’axoplasme (distance interMT < 5 nm). Or, des images de coupes d’axones obtenues par microscopie électronique ont révélé qu’ils y étaient bien séparés (distance interMT ≈ 75 nm). Dans la littérature, cette singularité pourrait s’expliquer par la présence de Tau, une protéine associée aux MTs. Cependant, l’effet de Tau sur l’organisation de MTs est encore sujet à controverse et deux modèles antagonistes ont été proposés. Le premier modèle avance que le domaine de projection de Tau connecte les MTs tout en les maintenant espacés en formant des ponts d’origine électrostatiques, à l’inverse du second qui explique l’espacement des MTs par un effet de « polymer brush » dû à la présence de Tau à la surface du MT. Afin d’éclairer la fonction de Tau dans l’organisation des MTs, nous avons combiné des approches expérimentales à différentes échelles, in vitro et in cellulo, avec des données issues de la modélisation analytique et numérique. Les résultats obtenus nous ont permis de proposer un modèle alternatif où la protéine Tau formerait des ponts transitoires. Ces derniers permettraient de maintenir les MTs suffisamment éloignés les uns des autres afin d’éviter l’effet de forces attractives à courte portée qui déclencheraient une mise en fagot irréversible des MTs. Enfin, notre modèle tient compte de la faible densité de Tau sur la surface des MTs axonaux. En effet, même à un bas ratio molaire Tau : Tubuline, Tau permet de garder les MTs éloignés les uns des autres grâce à la mobilité relative de Tau sur les MTs. / In mature neurons, axonal microtubules (MTs) are arranged in parallel arrays. Interestingly, even though both macromolecular crowding and their parallel orientation should force the formation of tightly packed bundles, they remain well separated. For decades, Tau, a microtubule-associated protein, has been implicated in this unique organization of axonal MTs. However, Tau properties still remain controversial as two antagonist models of interaction with MTs exist. Tau projection domains are either thought to connect MTs by forming electrostatic cross-bridges or to repulse them via a polymer brush mechanism. To gain a comprehensive view of Tau function, we then performed in vitro and in cells experiments, combined to analytical and mathematical modelling. We also reviewed the data traditionally used to support the cross-bridging and the polymer brush models and compared them with our interdisciplinary approach. Taken together, these results are indicating that tau can form transient and long-range cross-bridges at the interface between microtubules. These cross-bridges could prevent short-range attractive interactions that trigger an irreversible microtubule bundling. Finally, our model explain how MTs are kept apart at very low Tau:Tubulin molar ratio thanks to tau diffusion on microtubules.

L'objectif de la thèse était d'étudier la dynamique des molécules biologiques in vivo, sur l'échelle de la pico- à la nanoseconde (ps-ns), en combinant la diffusion incohérente de neutrons et le marquage isotopique hydrogène/deutérium.<br /> Les mouvements diffusifs de l'eau ont été explorés dans le cytoplasme d'E. coli. L'étude a établi que la diffusion de l'eau intracellulaire est similaire à celle de l'eau pure, à température physiologique. Ce travail infirme le paradigme établi, selon lequel l'eau cellulaire est fortement ralentie par l'encombrement macromoléculaire.<br /> Les mouvements moléculaires internes et la diffusion globale des macromolécules ont été étudiés in vivo. Les résultats montrent que la proportion d'eau intracellulaire est un facteur déterminant dans la dynamique interne des macromolécules in vivo. L'encombrement macromoléculaire atténue cependant l'effet lubrifiant de l'eau sur les mouvements moléculaires internes. L'étude témoigne du fait que les échantillons standards (poudres et solutions) ne miment pas l'environnement physiologique.<br /> L'effet isotopique du solvant et l'influence de la deutériation sur la dynamique macromoléculaire moyenne, ont été explorés in vivo. Les macromolécules natives sont moins flexibles et moins résilientes en D2O. La deutériation augmente légèrement la flexibilité structurale et diminue faiblement la résilience, ce qui suggère que l'utilisation du marquage isotopique est justifiée pour les études dynamiques.<br /> Ce travail souligne l'importance du contrôle négatif lors des mesures sur des échantillons sélectivement marqués et montre qu'un taux de marquage conséquent (> 10 %) est nécessaire pour observer la dynamique d'un composant spécifique.

La drépanocytose, ou anémie falciforme, présente une variabilité interindividuelle considérable, conditionnée par de multiples facteurs, dynamiques et interactifs, depuis le niveau moléculaire jusqu’au niveau du patient. L’hémoglobine drépanocytaire, ou hémoglobine S (HbS, tétramère a2bS 2), est un mutant de l’hémoglobine A (a2b2) : elle possède à sa surface une valine (hydrophobe) substituant un acide glutamique natif (négativement chargé). Cette mutation entraîne l’agrégation de l’HbS désoxygénée en polymères, ainsi que l’altération des propriétés de l’érythrocyte -dont sa rhéologie et ses interactions avec les différentes cellules vasculaires. C’est pourquoi la polymérisation de l’HbS constitue un facteur étiologique clef, sinon le primum movens, de la drépanocytose, et une hypothèse thérapeutique (étayée par l’observation) postule que la réduction des fibres intra-érythrocytaires de HbS pourrait améliorer le statut clinique des patients en abaissant la fréquence et la sévérité des crises vasoocclusives. Dans l’optique de mieux comprendre et de mieux gérer la variabilité individuelle drépanocytaire, il apparaît donc indispensable de disposer, en premier lieu, d’une description réaliste de la polymérisation de l’HbS. L’objectif de ce travail de thèse est la mise en place et la validation d’un modèle mathématique de la polymérisation de l’HbS désoxygénée, en tant que processus cinétiquethermodynamique, sous l’influence de la concentration et de la température –les deux facteurs modulateurs les plus importants. A partir d’un modèle existant, mais linéaire et incomplet (Ferrone et al., 1985), nous avons procédé à son implémentation, à sa correction et à sa mise à jour, ainsi qu’à l’évaluation quantitative de ses performances dynamiques, par intégration complète et simulation numérique (Simulink©). Ceci nous a permis de réaliser un diagnostic et d’effectuer un certain nombre de raffinements, concernant en particulier (i) la voie de nucléation hétérogène (formation de néo-fibres sur les fibres préexistantes), (ii) la non-idéalité de la solution protéique de HbS, induite par le volume exclus des fibres polymères (coefficients d’activité calculé à partir de la « théorie des particules convexes »), ainsi que (iii) la structuration spatiale des polymères en domaines. Le modèle développé dans ce travail servira de base pour une description (i) de l’influence dynamique de l’oxygénation et des hémoglobines non-polymérisantes sur la polymérisation de HbS, puis (ii) des polymères de HbS sur les propriétés membranaires et rhéologiques de l’érythrocyte drépanocytaire. / Sickle cell disease pathology exhibits a strong interindividual variability, which depends upon multiple, dynamic and interacting factors, from the molecular to the patient level. Sickle hemoglobin, hemoglobin S (HbS, a2bS 2 tetramer), is a mutant of HbA (a2b2), with a surface valine (hydrophobic) substituting a native glutamic acid (negatively charged). Such a mutation endows deoxygenated HbS with the propensity to agregate into polymers, altering erythrocyte properties –including its rheology and its interactions with vascular and circulatory cells. Thus HbS polymerization is a key etiological factor of sickle cell disease, if not the primum movens. Indeed, one therapeutical hypothesis (supported by observation) postulates that the reduction of intra-erythrocytic HbS fibers could improve patients clinical status by lowering the frequency and the severity of vasooclusive crisis. In order to better understand and manage sickle cell disease variability, it is essential to have a realistic description of HbS polymerization. This work aims at developing and validating a mathematical model of deoxygenated HbS polymerization, as a kinetic and thermodynamic process under the influence of concentration and temperature –the two most important modulators. Building on an existing, but linearized and uncomplete (Ferrone et al., 1985) model, we have implemented, corrected and updated, and quantitatively evaluated its dynamical performances: this was done by full numerical integration using Simulink©. This allowed us to make several improvements, related in particular to : (i) the heterogeneous nucleation pathway (seeding and formation of new fibers from pre-existing ones), (ii) the non-ideality of the HbS protein solution, caused by polymer fibers excluded volume (activity coefficients were calculated with the CPT, Convex Particle Theory), and (iii) the spatial organization of polymers into domains. The model developped in this work will ground the description of the dynamic influence (i) oxygenation and non-polymerizing hemoglobins, (ii) HbS polymers interactions with membrane and consequences upon rheological properties of sickle cell erythrocyte.