Les Microvésicules (MVs) sont des marqueurs circulants de l’activation cellulaire au cours de la dysfonction du greffon et l’athérothrombose. Les MVs de la cellule bêta ou intratissulaires vasculaires, sont peu connues. Le suivi longitudinal de 19 patients transplantés d’îlots pancréatiques par les MV- PSA-NCAM+ sanguines témoigne d’une altération précoce du greffon avant l’identification des marqueurs clinique et biologique de la perte du greffon. La cinétique de libération des MVs leucocytaires, endothéliales et hépatiques suggère leur intérêt pour l’identification de la cause de la perte du greffon et pour la surveillance de l'immunosuppression. Après validation d’une méthode d’extraction douce des MVs tissulaires sur des plaques d’athérome, nous avons mesuré l’accumulation de MVs pro-sénescentes dans l’aorte de rats âgés, qui étaient réduite par l’ingestion d’EPA : DHA (6 :1), avec une baisse des propriétés pro-sénescentes identifiée sur les cellules endothéliales d’artères coronaires en culture. Le contrôle des MV nocives par cytoprotecteur du vaisseau réduirait la sénescence endothéliale. / Microvesicles (MVs) are circulating markers that reflect cellular activation during graft dysfunction and atherothrombosis. Data on graft tissue MVs or vessel are scarce. The longitudinal follow-up of 19 patients with pancreatic islets transplants showed that circulating MV-PSA-NCAM+ typifying the early graft loss of islet graft prior its detection using the clinical and biological markers of graft loss. In addition, the kinetics release of leukocyte, endothelial and hepatic MV suggest their interest in identifying the cause of graft loss and in monitoring of immunosuppression. Using a new tissular MV mild extraction process validated with arteriosclerotic plaques, we evidenced an accumulation of pro-senescent MVs in the aorta of old rats that was significantly reduced by EPA: DHA (6 :1) intake as well as their pro-senescent properties on coronary artery endothelial cell cultures. Altogether, the pharmacological control of the release of noxious MVs using vessel cytoprotectors would limit the consequences of endothelial senescence.

Depuis quelques décennies, de nombreuses données suggèrent que l’effet protecteur cardiovasculaire des anthocyanes implique vraisemblablement une amélioration de la fonction endothéliale par une augmentation de la formation de monoxyde d’azote (NO). Cependant, les mécanismes protecteurs du transport intracellulaire des anthocyanes dans la cellule endothéliale demeurent mal compris. L’objectif de cette thèse est d’évaluer la contribution de SGLT1 et SGLT2, les co-transporteurs majeurs du sodium et du glucose, dans l’entrée des anthocyanes issues du cassis et de ses dérivés glucoside et rutinoside dans les cellules endothéliales. Cette entrée promeut l’activation de la voie de la monoxyde d’azote synthase endothéliale (eNOS) qui est ici étudiée par l’utilisation de vaisseaux isolés et de cellules endothéliales en culture. Un extrait de cassis riche en anthocyanes (BCE) induit la relaxation dépendante de l’endothélium par la voie du NO sur des anneaux d’artère coronaire de porc et active la voie de signalisation Akt-eNOS au sein des cellules endothéliales en culture. De plus, des expériences additionnelles suggèrent que l’effet protecteur des anthocyanes dépend à la fois du type de glucoside présent dans la structure des anthocyanes mais aussi de la contribution des transporteurs SGLTs dans l’influx cellulaire des anthocyanes. La capacité des anthocyanes à lutter contre la dysfonction endothéliale est hautement potentialisée dans un modèle cellulaire de sénescence réplicative par l’augmentation de l’influx des anthocyanes due à une forte expression des SGLTs. L’ensemble de ces données indique que les anthocyanes extraits du cassis sont de puissants activateurs de la voie du NO endothélial dans les cellules natives et en culture. Parmi les anthocyanes contenus dans le cassis, les dérivés glycosidiques comme la cyanidine et la delphinidine-3-O-glucoside, sont les anthocyanes les plus puissantes afin d’activer la voie du NO. En conclusion, les anthocyanes peuvent être particulièrement intéressantes afin de cibler précocement les sites à risque d’athérosclérose par leur effet de stimulation de l’expression des transporteurs SGLT1 et 2. / Since last few decades, considerable data have been suggested that the protective effect of anthocyanin on cardiovascular system is likely to involve an improvement of endothelial function by increase nitric oxide (NO) formation. However, comprehensive studies on the subsequent mechanisms of protective effect by anthocyanin intracellular transportation in vascular endothelial cell is poorly understood. The aim of this thesis is to evaluate the possibility that SGLT1 and 2, the two major sodium-glucose cotransporters (SGLT), contribute to blackcurrant anthocyanins and its major glucoside- and rutinoside-conjugated anthocyanins uptake into endothelial cells that promoting the subsequent activation of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) pathway using isolated blood vessels and cultured endothelial cells. An anthocyanin rich blackcurrant extract (BCE) induced NO-mediated endothelium dependent relaxation in porcine coronary artery rings and activated Akt-eNOS signaling pathway in cultured endothelial cell. Furthermore, additional experiments suggested that such a protective effect of anthocyanin is based on the type of glucoside in anthocyanin structure and contribution of SGLTs for the intracellular transportation of anthocyanins. An ability of anthocyanin against endothelial dysfunction is highly potentiated in the endothelial cell replicative senescence model by the increase anthocyanin efflux according to the high expression of SGLTs. Altogether, the present findings indicate that blackcurrant anthocyanins are potent activator of the endothelial NO pathway in native and cultured endothelial cells. Among blackcurrant anthocyanins, glucose derivatives such as cyanidin and delphinidin -3-O-glucoside are the most potent anthocyanins for activation of NO pathway. In conclusion, anthocyanin can be more prominent by preferentially targeting an early stage of atherosclerotic site by their increase expression of SGLT1 and 2.

La sénescence endothéliale est une étape précoce menant à la dysfonction endothéliale, laquelle favorise la pathogénèse de maladies cardiovasculaires lors du vieillissement physiologique et, de manière prématurée, chez le sujet diabétique. La première étude indique que le stress oxydant favorise l’induction du système angiotensine local menant à la sénescence et la dysfonction endothéliale dans les cellules endothéliales en culture. La deuxième étude indique que l’expression redox-sensible des co-transporteurs sodium-glucose 2 (SGLT2) entraîne via le système angiotensine la sénescence et la dysfonction endothéliale en réponse au high glucose. De plus, les observations indiquent que l’Empagliflozine, un inhibiteur sélectif de SGLT2, et les anthocyanes du jus de cassis sont capables d’inhiber l’induction de la sénescence endothéliale au glucose. De ce fait, le système angiotensine local et le SGLT2 sont des cibles intéressantes pour retarder le vieillissement vasculaire. / Endothelial senescence is an early step to endothelial dysfunction, known to favor the development of cardiovascular diseases during ageing, or its accelerated form in diabetes. The first in vitro study shows that the activation of the local angiotensin system is favored by the oxidative stress and leads to endothelial senescence and dysfunction. The second study indicates that endothelial senescence and dysfunction in response to high glucose are driven by the redox-sensitive expression of sodium-glucose co-transporters SGLT-2, via the angiotensin system. Moreover, data also indicate that empagliflozin, a SGLT2 selective inhibitor, and anthocyans from black-currant juice can inhibit the glucose-induced endothelial senescence. Therefore, the local angiotensin system and SGLT2 are promising targets to stunt vascular ageing.

[ES] El envejecimiento se concibe como un proceso progresivo de deterioro funcional que se produce a lo largo de la vida. En general, el avance de la edad va acompañado del deterioro de múltiples tejidos, la alteración de la homeostasis y el aumento de la fragilidad. La edad se considera el principal factor de riesgo de un gran número de enfermedades con elevadas tasas de mortalidad, como las patologías cardiovasculares, el cáncer, la fibrosis pulmonar, la esteatosis hepática y los trastornos neurodegenerativos, entre otros. A medida que aumenta la población de edad avanzada, estas patologías son cada vez más frecuentes en nuestra sociedad y constituyen actualmente una de las principales preocupaciones sanitarias en atención primaria. Por consiguiente, comprender los mecanismos que causan el envejecimiento y el consiguiente deterioro de la salud es un reto importante para la comunidad científica, respaldado por un significativo interés socioeconómico. Alcanzar este objetivo permitiría realizar intervenciones específicas contra las enfermedades relacionadas con la edad, promover un envejecimiento saludable y prolongar la vida humana. En este contexto, la senescencia celular se ha convertido en un importante objetivo de investigación, ya que este destino celular se considera un factor que contribuye al deterioro funcional y estructural de los tejidos con el aumento de la edad, dando lugar a enfermedades crónicas. Los trastornos neurodegenerativos son en su mayoría de etiología desconocida, y en la actualidad sólo se dispone de tratamientos paliativos. La neurodegeneración puede deberse a la disminución de la neurogénesis que se produce con el envejecimiento. A este respecto, la vasculatura cerebral representa un componente esencial de los nichos neurogénicos, donde residen las células con capacidad para generar nuevas neuronas. Los microvasos cerebrales contribuyen sustancialmente a preservar la homeostasis y el potencial neurogénico de estas regiones, pero también experimentan cambios estructurales y funcionales con la edad. Sin embargo, aún no está claro si estas alteraciones están relacionadas con la senescencia celular. De ahí que el propósito de esta tesis sea profundizar en los entresijos de la senescencia relacionada con la edad y su impacto en el proceso de envejecimiento cerebral. En este sentido, hemos desarrollado una sonda fluorogénica para la detección in vivo de la actividad ß-Gal, un marcador ampliamente utilizado de senescencia celular. Hemos estimado la carga de células senescentes de forma no invasiva en estudios longitudinales utilizando esta sonda durante el envejecimiento natural y acelerado o durante tratamientos senolíticos. Estos resultados nos han permitido establecer una correlación real entre envejecimiento y senescencia. Por otro lado, hemos centrado nuestros esfuerzos en crear estrategias para detectar la senescencia en las células endoteliales cerebrales y estudiar sus efectos sobre la neurogénesis durante el envejecimiento. Los resultados mostraron que las células endoteliales senescentes a nivel cerebral tienen un impacto perjudicial sobre la neurogénesis y las células madre neurales, lo que sitúa a estas células como diana para futuros estudios sobre el envejecimiento cerebral. / [CA] L'envelliment es concep com un procés progressiu de deterioració funcional que es produeix al llarg de la vida. En general, l'avanç de l'edat va acompanyat de la deterioració de múltiples teixits, l'alteració de l'homeòstasi i l'augment de la fragilitat. L'edat es considera el principal factor de risc d'un gran nombre de malalties amb elevades taxes de mortalitat, com les patologies cardiovasculars, el càncer, la fibrosi pulmonar, la esteatosis hepàtica i els trastorns neurodegeneratius, entre altres. A mesura que augmenta la població d'edat avançada, aquestes patologies són cada vegada més freqüents en la nostra societat i constitueixen actualment les principals preocupacions sanitàries en atenció primària. Per consegüent, comprendre els mecanismes que causen l'envelliment i la consegüent deterioració de la salut és un repte important per a la comunitat científica, recolzat per un significatiu interés socioeconòmic. Aconseguir aquest objectiu permetria realitzar intervencions específiques contra les malalties relacionades amb l'edat, promoure un envelliment saludable i prolongar la vida humana. En aquest context, la senescència cel·lular s'ha convertit en un important objectiu d'investigació, ja que aquest destí cel·lular es considera un factor que contribueix a la deterioració funcional i estructural dels teixits amb l'augment de l'edat, donant lloc a malalties cròniques. Els trastorns neurodegeneratius són en la seua majoria d'etiologia desconeguda, i en l'actualitat només es disposa de tractaments pal·liatius. La neurodegeneración pot deure's a la disminució de la neurogènesi que es produeix amb l'envelliment. Referent a això, la vasculatura cerebral representa un component essencial dels nínxols neurogènics, on resideixen les cèl·lules amb capacitat per a generar noves neurones. Els microvasos cerebrals contribueixen substancialment a preservar l'homeòstasi i el potencial neurogènic d'aquestes regions, però també experimenten canvis estructurals i funcionals amb l'edat. No obstant això, encara no és clar si aquestes alteracions estan relacionades amb la senescència cel·lular. D'aquí ve que el propòsit d'aquesta tesi siga aprofundir en els secrets de la senescència relacionada amb l'edat i el seu impacte en el procés d'envelliment cerebral. En aquest sentit, hem desenvolupat una sonda fluorogénica per a la detecció in vivo de l'activitat ß-Gal, un marcador àmpliament utilitzat de senescència cel·lular. Hem estimat la càrrega de cèl·lules senescentes de forma no invasiva en estudis longitudinals utilitzant aquesta sonda durant l'envelliment natural i accelerat o durant tractaments senolíticos. Aquests resultats ens han permés establir una correlació real entre envelliment i senescència. D'altra banda, hem centrat els nostres esforços a crear estratègies per a detectar la senescència en les cèl·lules endotelials cerebrals i estudiar els seus efectes sobre la neurogènesi durant l'envelliment. Els resultats van mostrar que les cèl·lules endotelials *senescentes a nivell cerebral tenen un impacte perjudicial sobre la neurogènesi i les cèl·lules mare *neurales, la qual cosa situa a aquestes cèl·lules com a diana per a futurs estudis sobre l'envelliment cerebral. / [EN] Ageing is conceived as a progressive process of functional decline that occurs over the course of life. In general, advancing age is accompanied by the deterioration of multiple tissues, altered homeostasis and increased frailty. Age is considered to be the main risk factor for a large number of diseases with high mortality rates, such as cardiovascular pathologies, cancer, pulmonary fibrosis, hepatic steatosis, and neurodegenerative disorders, among others. As the elderly population grows, these pathologies are becoming increasingly prevalent in our society and are now the leading health concerns in primary care. Consequently, comprehending the mechanisms that cause ageing and resulting health decline is a major challenge for the scientific community, backed by significant socio-economic interest. Achieving this goal would allow for targeted interventions against age-related diseases, promote healthy ageing, and extend human lifespan. In this context, cellular senescence has emerged as an important research target, as this cellular fate is considered a contributing factor to the functional and structural deterioration of tissues with increasing age, leading to chronic diseases. Neurodegenerative disorders are mostly of unknown etiology, and only palliative treatments are currently available. Neurodegeneration may be prompted by the decline in neurogenesis that occurs with ageing. In this regard, the brain vasculature represents an essential component of the neurogenic niches, where cells with the capacity to generate new neurons reside. Brain microvessels contribute substantially to preserving the homeostasis and neurogenic potential of these regions, but they also undergo structural and functional changes with age. However, whether these alterations are linked to cellular senescence it is not yet clear. Hence, the purpose of this thesis is to delve deeper into the intricacies of age-related senescence and its impact on the process of brain ageing. In this regard, we have developed a fluorogenic probe for the in vivo detection of ß-Gal activity, a widely used marker of cellular senescence. We have estimated the senescent cell burden non-invasively in longitudinal studies using this probe during natural and accelerated ageing or during senolytic treatments. These results have allowed us to establish a real correlation between ageing and global senescence. On the other hand, we have focused our efforts on creating strategies to detect senescence in brain endothelial cells and to study its effects on neurogenesis during ageing. The results showed that senescent endothelial cells at the brain level have a detrimental impact on neurogenesis and neural stem cells, positioning these cells as a target for future studies on brain ageing. / This PhD thesis has been supported by a pre-doctoral scholarship from the Spanish Ministry of Universities, “Programa de Formación del Profesorado Universitario (FPU)”, and a technical expert contract funded by the European Commission. The research has been funded by the following research projects led by Ramón Mártinez Máñez: - Gobierno de España (RTI2018-100910-B-C41 and PID2021-126304OB-C41). - Generalitat Valenciana (PROMETEO 2018/024 and CIPROM/2021/007). - CIBER-BBN- Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Ciencia e Innovación (CB06/01/2012). And by the following research projects led by Isabel Fariñas: - 2014-2018. Estudio de células madre en el ámbito de las investigaciones básicas en terapia celular. Fundación Botín-Banco de Santander. - 2018-2021. Regulación del comportamiento de las células madre neurales por el medio sistémico: el nicho extendido. MINECO (SAF2017-86690-R). - 2016-ongoing. CIBER en Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED). ISCIII (Programa de Investigación Cooperativa, CB06/05/0086). - 2017-2021. Efectos directos y remotos de la respuesta inflamatoria sobre las células madre neurales. Generalitat Valenciana (Proyectos de Excelencia, PROMETEO/2017/030). - 2017-2021. RETIC de terapia celular ISCIII (RD16/0011/0017). - 2021-2024 Regulación molecular de la heterogeneidad celular en los nichos neurogénicos adultos MICINN (PID2020- 117937GB-I00). - 2021-2025. Una aproximación multidisciplinar al estudio de la respuesta al daño genómico en células madre neurales: de levadura a mamíferos y vuelta. Generalitat Valenciana. Programa Prometeo de Proyectos de Excelencia (PROMETEO/2021/028). / Rojas Vázquez, S. (2023). Impact of Brain Endothelial Senescence on Neurogenesis: Application of Novel Strategies for Age-Related Senescence Detection [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/194629