Les archées sont principalement connues pour leur capacité à croître et survivre dans des conditions extrêmes de température, pression, pH, etc. qui sont hostiles à l’homme. Néanmoins, il est désormais clair que les archées sont aussi présentes de manière ubiquitaire dans divers environnements. L’étude détaillée des différents aspects de la biologie de ces microorganismes a amené à des découvertes pour le moins inattendues comme celle de la virosphère associée aux archées qui est unique. En effet, plusieurs virus infectant les archées ont été isolés et présentent une incroyable diversité tant au niveau morphologique que génomique et ne ressemblent aucunement aux virus connus de bactéries ou d’eucaryotes. Récemment, l’analyse en détails du cycle viral a mis à jour de nouveaux mécanismes d’interactions avec la cellule hôte. Au cours de mes travaux de thèse, nous nous sommes intéressés aux systèmes virus-hôtes présents dans les milieux hyperthermiques et acidophiles en sélectionnant les virus fusiforme et filamenteux SSV1 et SIRV2 en tant que modèles d’étude. Tout d’abord, nous avons défini une nouvelle classification des virus fusiformes en basée sur l’analyse comparative des protéines structurales et des génomes viraux. L’ensemble des virus considérés forme un réseau global malgré le fait qu’ils ont été isolés dans des environnements distincts ; qu’ils infectent des hôtes qui sont distant phylogénétiquement parlant et que certains de leurs virions présentent une certaine pléomorphicité. Ensuite, la caractérisation en détails de l’architecture des virions fusiformes de SSV1 a révélé qu’ils étaient enveloppés, composés de protéines de capside glycosylées et contenaient le complexe nucléoprotéique. Finalement, nous nous sommes concentrés sur la manière dont les virus d’archées interagissent avec la cellule hôte. Alors que les virions de SIRV2 semblent utiliser une stratégie pour l’entrée qui est similaire aux bactériophages dits flagellotrophiques ; on observe que les virions de SSV1 emploient un mécanisme de sortie qui rappelle le bourgeonnement des virus eucaryotes enveloppés. L’ensemble de ces recherches participent à une meilleure compréhension de la biologie des archées ainsi que de leurs virus et permettent de définir des cibles intéressantes pour de futures études. / Although, archaea were initially regarded as exotic microorganisms capable of growing in conditions which are hostile to humans, it became clear that they are ubiquitous and abundant in various environments. Detailed studies focusing on different aspects of archaeal biology have led to many unexpected discoveries, including the unique virosphere associated with archaea. Indeed, highly diverse viruses characterized by uncommon virion shapes and mysterious genomic contents have been isolated that typically do not resemble viruses of either bacteria or eukaryotes. Recent analysis of the sequential events of the viral cycle resulted in major breakthroughs in the field. In the framework of my PhD studies, I have focused on two model hyperthermo-acidophilic virus-host systems, the spindle-shaped SSV1 and rod-shaped SIRV2, both infecting organisms of the genus Sulfolobus. Initially, we defined structure-based lineages for all known spindle-shaped viruses isolated from highly divergent hosts and residing in very different environments. Then, we provided insights into the architecture of spindle-shaped viruses by showing that SSV1 virions are composed of glycosylated structural proteins and contain a lipid envelope. Finally, we focused on virus-host interplay. Whereas SIRV2 virions appear to use a similar entry strategy as flagellotrophic bacteriophages, SSV1 virions employ an exit mechanism reminiscent of the budding of eukaryotic enveloped viruses. Collectively, these studies shed light on the biology of archaeal viruses and help to define interesting targets that should be the focus of intensive research in the next future.

L’entrée du virus de l’hépatite C (VHC) dans les hépatocytes est un événement multi-étapes complexe, impliquant un certain nombre de facteurs cellulaires. Elle est initiée par la fixation des particules virales sur des structures d’héparanes sulfates (HS) présentes à la surface de l’hépatocyte. Cette étape initiale reste cependant peu comprise. En effet, en raison de l’interaction de la particule virale du VHC avec des lipoprotéines, la contribution exacte des différents composants du virion à cette interaction reste controversée. Au cours de cette thèse, nous avons étudié le rôle potentiel de protéines d'enveloppe du VHC et de l'apolipoprotéine E dans l'étape de liaison aux HS. Nous avons d’abord montré que la délétion de la région hypervariable 1 (HVR1), une région précédemment proposée pour participer à l’interaction avec les HS, n'avait aucun effet sur la liaison du virion aux HS, indiquant que cette région n'est pas impliquée dans cette interaction. Nous avons également utilisé des anticorps monoclonaux neutralisants reconnaissant différentes régions des glycoprotéines d'enveloppe du VHC dans un test de compétition utilisant des billes d’agarose couplées à l’héparine, un homologue structural des HS, pour précipiter le virus. Bien que les glycoprotéines d’enveloppe du VHC dissociées de la particule virale interagissaient avec l'héparine, aucun de ces anticorps n’était capable d'interférer avec l'interaction entre la particule virale et l’héparine, suggérant fortement que les glycoprotéines d'enveloppe du VHC présente à la surface des virions ne sont pas accessibles pour interagir avec les HS. En revanche, nos résultats d’études cinétiques, d’interaction avec l’héparine ainsi que les expériences d'inhibition avec des anticorps anti-apolipoprotéine E indiquent que cette apolipoprotéine joue un rôle majeur dans l'interaction initiale entre le VHC et les HS. Enfin, la caractérisation des déterminants structuraux des HS nécessaires à l'infection par le VHC, à l’aide d’ARN interférents ciblant des enzymes impliquées dans la voie de biosynthèse des HS et par compétition avec des héparines modifiées, indique que la N-sulfatation et la 6-O-sulfatation sont nécessaires pour l’initiation de l'infection par le VHC. Par contre la 2-O-sulfatation n’est pas indispensable pour l’étape d’entrée cellulaire du VHC. Enfin, nous avons également montré que la taille minimale des oligosaccharides d’HS requise pour l'infection par le VHC est un decasaccharide. En conclusion, l’ensemble de ces données indique que le VHC détourne l'apolipoprotéine E pour initier son interaction avec des structures d’HS spécifiques. / Hepatitis C virus (HCV) entry into hepatocytes is a complex multistep process involving a series of cellular factors. HCV entry is initiated by the binding of viral particles to cell surface heparan sulfate (HS) structures. However, due to the lipoprotein-like structure of HCV, the exact contribution of virion components to this interaction remains controversial. Here, we investigated the relative contribution of HCV envelope proteins and apolipoprotein E in the HS-binding step. Deletion of hypervariable region 1, a region previously proposed to be involved in HS-binding, did not alter HCV virion binding to HS, indicating that this region is not involved in this interaction. Neutralizing monoclonal antibodies recognizing different regions of HCV envelope glycoproteins were also used in a pull-down assay with beads coated with heparin, a close HS structural homologue. Although isolated HCV envelope glycoproteins could interact with heparin, none of these antibodies was able to interfere with virion-heparin interaction, strongly suggesting that, at the virion surface HCV envelope glycoproteins are not accessible for HS binding. In contrast, results from kinetic studies, heparin pull-down and inhibition experiments with anti-apolipoprotein E antibodies indicate that this apolipoprotein plays a major role in HCV-HS interaction. Finally, characterization of HS structural determinants required for HCV infection by silencing enzymes involved in the HS biosynthesis pathway and by competition with modified heparin indicated that N- and 6-O-sulfation but not 2-O-sulfation are required for HCV infection, and that the minimum HS oligosaccharide length required for HCV infection is a decasaccharide. Together, these data indicate that HCV hijacks apolipoprotein E to initiate its interaction with specific HS structures.

Les quatre étapes principales d'infection des bactéries par leurs virus sont (i) la reconnaissance spécifique de la cellule hôte et l'entrée du génome dans le cytoplasme,(ii) la réplication du génome viral, (iii) l'assemblage des particules virales, et (iv) leur relâchement, menant dans la plupart des cas à la lyse de la cellule. Bien que la description des étapes individuelles du cycle viral a été relativement bien établie, les détails de comment d'ADN viral chemine du virion jusqu’au cytoplasme de la bactérie hôte et de comment l'environnement cellulaire participe au processus restent mal compris.La première étape de l’infection est la reconnaissance d’un récepteur à la surface de la bactérie hôte par la machinerie d’adsorption du phage. Les barrières que l’agent infectieux doit franchir par la suite sont la membrane externe de la bactérie Gram-negative, la paroi cellulaire et la membrane cytoplasmique. Ceci implique une dégradation localisée de la paroi et le cheminement de l’ADN à travers un pore dans la membrane. L‘ADN linéaire se circularise normalement dans le cytoplasme et il est répliqué par la suite. On a utilisé le bactériophage SPP1 qui infecte la bactérie Gram-positive Bacillus subtilis comme modèle d’étude pour disséquer ces différentes étapes clés pour le démarrage de l’infection virale. Dans ce travail de thèse les conditions d’infection et d’acquisition de données pour suivre en temps réel la dépolarisation de la membrane cellulaire de B. subtilis lors de l’infection par SPP1 ont été mis au point. Il est montré que le démarrage de l’infection déclenche une dépolarisation très rapide de la membrane cytoplasmique.Le potentiel de membrane n’est plus rétablit pendant toute la durée du cycle d'infection. Ce changement du potentiel de membrane au début de l’infection dépend de la présence du récepteur YueB. L’amplitude de la dépolarisation dépend du nombre de particules virales infectieuses présentes et de la concentration du récepteur YueB à la surface de la bactérie hôte. L’interaction du phage avec le récepteur YueB conduit à l’interaction irréversible et à l'éjection de l’ADN de SPP1. Pour établir si c’est l’interaction avec YueB ou le début de l’entrée de l’ADN qui conduit à la dépolarisation de la membrane on a utilisé des phages SPP1 éclates par EDTA qui adsorbent normalement à B. subtilis mais qui n’avaient plus leur ADN. Les résultats obtenus ont montré que la dépolarisation requiert l’interaction du virus intacte avec le récepteur YueB. Des concentrations sous-millimolaire de Ca2+ sont nécessaires et suffisantes pour SPP1 liaison réversible à l'enveloppe d'hôte et donc de déclencher la dépolarisation.La cinétique d’entrée de l’ADN du bactériophage SPP1 dans la bactérie Bacillus subtilis a été suivie en temps réel par microscopie de fluorescence. On a mis au point une méthode de microscopie pour visualiser des particules virales marquées avec des «quantum dots» ce qui permit de démontrer que ces particules se fixent préférentiellement aux pôles des bacilli. L’immuno-marquage du récepteur de SPP1,la protéine YueB, a montré que celle-ci a une organisation ponctuée à la surface de B.subtilis et se concentre particulièrement aux extrémités de la bactérie. Cette localisation particulière du phage sur la surface de la cellule hôte corrèle avec l’observation que l’ADN viral rentre dans le cytoplasme (<2 min) et se réplique dans des foci situés dans la plupart des cas à proximité des pôles de B. subtilis. L’étude spatio-temporelle de l’interaction de SPP1 avec son hôte Gram-positive montre que le virus cible des régions spécifiques de la bactérie pour son entrée et pour sa réplication. Transfert d'ADN dans le cytoplasme dépend des concentrations millimolaires de Ca2+. Un modèle décrivant les événements précoces de l'infection bactériophage SPP1 est présenté. / The four main steps of bacterial viruses (bacteriophages) lytic infection are (i) specific recognition and genome entry into the host bacterium, (ii) replication of the viral genome, (iii) assembly of viral particles, and (iv) their release, leading in most cases to cell lysis. Although the course of individual steps of the viral infection cycle has been relatively well established, the details of how viral DNA transits from the virion to the host cytoplasm and of how the cellular environment catalyzes and possibly organizes the entire process remain poorly understood.Tailed bacteriophages are by far the most abundant viruses that infect Eubacteria. The first event in their infection is recognition of a receptor on the surface of host bacterium by the phage adsorption machinery. The barriers that the infectious particle overcomes subsequently are the cell wall and the cytoplasmic membrane of bacteria. This implies a localized degradation of the wall and the flow of its double stranded DNA (dsDNA) through a hydrophilic pore in the membrane. The lineards DNA molecule is most frequently circularized in the cytoplasm followed by its replication. In this study we used bacteriophage SPP1 that infects the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis as a model system to dissect the different steps leading to transfer of the phage genome from the viral capsid to the host cell cytoplasm.normally to B. subtilis but do not trigger depolarization of the CM. Attachment of intact SPP1 particles is thus required for phage-induced depolarization.The beginning of B. subtilis infection by bacteriophage SPP1 was followed inspace and time. The position of SPP1 binding at the cell surface was imaged by fluorescence microscopy using virus particles labeled with "quantum dots". We found that SPP1 reversible adsorption occurs preferentially at the cell poles. This initial binding facilitates irreversible adsorption to the SPP1 phage receptor protein YueB,which is encoded by a putative type VII secretion system gene cluster.Immunostaining and YueB – GFP fusion showed that the phage receptor protein YueB is found over the entire cell surface. It concentrates at the bacterial poles too,and displays a punctate distribution over the sidewalls. The dynamics of SPP1 DNA entry and replication was visualised in real time by assaying specific binding of a fluorescent protein to tandem sequences present in the SPP1 genome. During infection, most of the infecting phages DNA entered and replicated near the bacterial poles in a defined focus. Therefore, SPP1 assembles a replication factory at a specific location in the host cell cytoplasm. DNA delivery to the cytoplasm depends on millimolar concentrations of Ca2+ allowing uncoupling it from the precedent steps of SPP1 adsorption to the cell envelope and CM depolarization that require only micromolar amounts of this divalent cation. A model describing the early events of bacteriophage SPP1 infection is presented.