As reações aldólicas vêm ganhando destaque com os recentes avanços na área de biocatálise. Uma alternativa para o uso de aldolases, que não atuam sobre uma grande variedade de substratos e possuem custos elevados, é o emprego de enzimas de outras classes que possam exercer como função promíscua a atividade aldolase. Neste trabalho lipases e celulases foram capazes de catalisar a reação aldólica entre o 4-nitrobenzaldeído e a cicloexanona. A lipase de Rhizopus niveus (RNL) catalisou a reação aldólica em solventes orgânicos na presença de água e também em tampões aquosos. As reações condicionais influenciaram o rendimento (0-99%) e a enantiosseletividade do produto aldólico anti (6-55% eeanti). O produto aldólico com enantiosseletividade foi observado mesmo com a enzima inativa e em condições desnaturantes. Portanto, as reações aldólicas procederam por catálise proteica inespecífica com enantiosseletividades moderadas e não por atividade promíscua. Contudo, este estudo identificou um novo catalisador verde para reações aldólicas, pois foram obtidos produtos com bons rendimentos, ee e excesso diastereoisomérico (ed), demonstrando novas possibilidades para lipases, especialmente para a RNL que é pouco estudada na literatura. A partir destes resultados obtidos, uma nova abordagem baseada em sistemas reacionais de miniemulsão foi elaborada. Superando limitações para este sistema fluido não convencional como o emprego de reagente sólido (4-nitrobenzaldeído), substratos relativamente polares, solução tampão e o desenvolvimento de um procedimento de isolamento do produto. Desta maneira, foram descritos neste trabalho métodos de produção de sistemas reacionais de miniemulsão estáveis e aplicáveis, como relatado para reações aldólicas pela RNL. Empregando planejamento experimental minimizou-se a quantidade de catalisador (de 20 para 6 mg mL-1) em comparação com as reações realizadas em mistura de solvente orgânico e água. Mesmo com menor quantidade de enzima, o rendimento aumentou de 25% para valores de até 65% para 48 h de reação e o eeanti de 10% foi maximizado para valores acima de 30%, valor não considerado satisfatório, entretanto bem superior ao observado inicialmente. Com a interpretação estatística dos dados obtidos foi possível apresentar compreensões satisfatórias para as variações observadas de ee, ed, rendimento e tamanho médio de diâmetro das gotículas de miniemulsão, possibilitando uma compreensão mais completa deste sistema e permitindo uma melhor racionalização deste meio reacional que ainda não foi amplamente estudado e divulgado na literatura para promover reações biocatalíticas. Este estudo demonstrou a potencialidade deste método para diferentes tipos de reações orgânicas. / The aldol reactions have received attention with the recent advances in biocatalysis. In this sense, studies showed that an alternative for the use of aldolases, which do not act on a great variety of substrates and have high costs, is the use of enzymes of other classes that can present the promiscuous aldolase activity. In this work lipases and cellulases were able to catalyze the aldol reaction between 4-nitrobenzaldehyde and cyclohexanone. Rhizopus niveus lipase (RNL) catalyzed the aldol reaction in organic solvents with water or aqueous buffers. The reactional conditions affected the yield (0-99%) and the enantioselectivity of the anti-aldol product (6-55% eeanti). The aldol product with enantioselectivity was observed even with the inactive enzyme and under denaturing conditions. Therefore, the aldol reaction proceeded by non-specific protein catalysis with moderate enantioselectivity and not by promiscuous activity. However, this study identified a new green catalyst for aldol reactions, since products with good yields, ee and diastereoisomeric excess (ed) were obtained, and new possibilities for lipases, especially for RNL that is understudied. From these results, a new approach based on the miniemulsion reactional system was developed. Overcoming limitations to this unconventional fluid system such as the use of a solid reagent (4-nitrobenzaldehyde), relatively polar substrates, buffer solutions and the development of a product isolation method. In this way, we have described in this work methods for the production of stable and applicable miniemulsion reaction systems for aldol reactions by RNL. Using experimental design, the amount of catalyst (from 20 to 6 mg mL -1) was minimized in comparison with the reactions performed in organic solvent and water. Even with a lower amount of enzyme, the yield increased from 25% to 65% for 48 hours of reaction and the eeanti of 10% was maximized to values above 30%, a value not considered satisfactory, however higher than the enantioselectivity initially observed. The statistics applied to the obtained data presented satisfactory interpretations for the observed ee, ed, yield and average diameter size of the miniemulsion droplets, allowing a more complete understanding of the miniemulsion system and allowing a better rationalization of this reactional medium that is understudied to promote biocatalytic reactions. This study demonstrated the potential of this methodology for different types of organic reactions.

As reações aldólicas vêm ganhando destaque com os recentes avanços na área de biocatálise. Uma alternativa para o uso de aldolases, que não atuam sobre uma grande variedade de substratos e possuem custos elevados, é o emprego de enzimas de outras classes que possam exercer como função promíscua a atividade aldolase. Neste trabalho lipases e celulases foram capazes de catalisar a reação aldólica entre o 4-nitrobenzaldeído e a cicloexanona. A lipase de Rhizopus niveus (RNL) catalisou a reação aldólica em solventes orgânicos na presença de água e também em tampões aquosos. As reações condicionais influenciaram o rendimento (0-99%) e a enantiosseletividade do produto aldólico anti (6-55% eeanti). O produto aldólico com enantiosseletividade foi observado mesmo com a enzima inativa e em condições desnaturantes. Portanto, as reações aldólicas procederam por catálise proteica inespecífica com enantiosseletividades moderadas e não por atividade promíscua. Contudo, este estudo identificou um novo catalisador verde para reações aldólicas, pois foram obtidos produtos com bons rendimentos, ee e excesso diastereoisomérico (ed), demonstrando novas possibilidades para lipases, especialmente para a RNL que é pouco estudada na literatura. A partir destes resultados obtidos, uma nova abordagem baseada em sistemas reacionais de miniemulsão foi elaborada. Superando limitações para este sistema fluido não convencional como o emprego de reagente sólido (4-nitrobenzaldeído), substratos relativamente polares, solução tampão e o desenvolvimento de um procedimento de isolamento do produto. Desta maneira, foram descritos neste trabalho métodos de produção de sistemas reacionais de miniemulsão estáveis e aplicáveis, como relatado para reações aldólicas pela RNL. Empregando planejamento experimental minimizou-se a quantidade de catalisador (de 20 para 6 mg mL-1) em comparação com as reações realizadas em mistura de solvente orgânico e água. Mesmo com menor quantidade de enzima, o rendimento aumentou de 25% para valores de até 65% para 48 h de reação e o eeanti de 10% foi maximizado para valores acima de 30%, valor não considerado satisfatório, entretanto bem superior ao observado inicialmente. Com a interpretação estatística dos dados obtidos foi possível apresentar compreensões satisfatórias para as variações observadas de ee, ed, rendimento e tamanho médio de diâmetro das gotículas de miniemulsão, possibilitando uma compreensão mais completa deste sistema e permitindo uma melhor racionalização deste meio reacional que ainda não foi amplamente estudado e divulgado na literatura para promover reações biocatalíticas. Este estudo demonstrou a potencialidade deste método para diferentes tipos de reações orgânicas. / The aldol reactions have received attention with the recent advances in biocatalysis. In this sense, studies showed that an alternative for the use of aldolases, which do not act on a great variety of substrates and have high costs, is the use of enzymes of other classes that can present the promiscuous aldolase activity. In this work lipases and cellulases were able to catalyze the aldol reaction between 4-nitrobenzaldehyde and cyclohexanone. Rhizopus niveus lipase (RNL) catalyzed the aldol reaction in organic solvents with water or aqueous buffers. The reactional conditions affected the yield (0-99%) and the enantioselectivity of the anti-aldol product (6-55% eeanti). The aldol product with enantioselectivity was observed even with the inactive enzyme and under denaturing conditions. Therefore, the aldol reaction proceeded by non-specific protein catalysis with moderate enantioselectivity and not by promiscuous activity. However, this study identified a new green catalyst for aldol reactions, since products with good yields, ee and diastereoisomeric excess (ed) were obtained, and new possibilities for lipases, especially for RNL that is understudied. From these results, a new approach based on the miniemulsion reactional system was developed. Overcoming limitations to this unconventional fluid system such as the use of a solid reagent (4-nitrobenzaldehyde), relatively polar substrates, buffer solutions and the development of a product isolation method. In this way, we have described in this work methods for the production of stable and applicable miniemulsion reaction systems for aldol reactions by RNL. Using experimental design, the amount of catalyst (from 20 to 6 mg mL -1) was minimized in comparison with the reactions performed in organic solvent and water. Even with a lower amount of enzyme, the yield increased from 25% to 65% for 48 hours of reaction and the eeanti of 10% was maximized to values above 30%, a value not considered satisfactory, however higher than the enantioselectivity initially observed. The statistics applied to the obtained data presented satisfactory interpretations for the observed ee, ed, yield and average diameter size of the miniemulsion droplets, allowing a more complete understanding of the miniemulsion system and allowing a better rationalization of this reactional medium that is understudied to promote biocatalytic reactions. This study demonstrated the potential of this methodology for different types of organic reactions.

Orientador: Anita Jocelyne Marsaioli / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-18T09:33:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_BrunaZucolotoda_M.pdf: 3730198 bytes, checksum: aee2e21aa8a8998b409bff4636299519 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A versatilidade enzimática foi abordada nesta dissertação desde a triagem de microorganismos para a seleção de biocatalisadores adequados, e estudos de interações intermoleculares presentes em sistemas complexos de promiscuidade enzimática, até avaliação da inibição de enzimas relacionadas a ocorrência de diversas enfermidades. As triagens enzimáticas de micro-organismos isolados de água de drenagem de mina de prospecção de cobre permitiram a identificação de hidrolases e monoxigenases, sendo que as cepas de bactérias que apresentaram as melhores atividades oxidativas mostraram-se promissoras para oxidação de diversas classes de sulfetos, em ensaios de biocatálise convencional. A atuação promíscua de lipases foi avaliada frente a oxidação de cetonas cíclicas em meio orgânico, e as interações intermoleculares deste sistema foram estudadas por RMN, onde foi observado características de um sistema organizado em micelas reversas. A partir destas evidências, foi proposto que a condição necessária para a reação enzimática é o confinamento da enzima num ambiente aquoso restrito limitado por uma barreira molecular de ácido graxo. Finalmente a inibição da atividade enzimática de proteína tirosina fosfatases foi avaliada com implementação de uma metodologia fluorimétrica rápida e eficiente. Logo, este trabalho apresentou uma visão ampla no campo da enzimologia com o emprego de biocatalisadores, sejam eles enzimas isoladas ou células íntegras, em estudos relacionados a aspectos químicos, bioquímicos e terapêuticos das enzimas / Abstract: In this thesis the enzymatic versatility was evaluated in microorganisms selecting specific biocatalysts, in studies of intermolecular interactions of complex systems focusing enzyme promiscuity, and last in enzyme inhibition related to the occurrence of various diseases. The enzymatic screening of microorganisms isolated from copper mine water drainage led to the identification of hydrolases and monooxygenases, and bacterial strains with relevant oxidative activities were further investigated in larger scale oxidation of several sulfides. The promiscuous activity of lipases was evaluated in organic medium catalyzing the oxidation of cyclic ketones. The supramolecular interactions involved in these reactions were studied by NMR, revealing the presence of reverse micelles in a highly organized system. Therefore confinement of the enzyme in a restricted aqueous environment limited by a narrow molecular barrier of fatty acids in an organic medium is the necessary condition for this enzymatic reaction to occur. Finally, inhibition of enzymatic activity of protein tyrosine phosphatases was assessed with the implementation of a quick and efficient fluorimetric method. The data presented herewith provide a broad vision of enzyme application, as isolated enzymes or whole cells, in studies addressing chemical, biochemical and therapeutic issues / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

Issue de l'Archaea extrêmophile Sulfolobus solfataricus, SsoPox est une enzyme à fort potentiel biotechnologique du fait de son extrême stabilité. Nous avons caractérisé son activité lactonase naturelle ainsi que son activité de promiscuité phosphotriestérase. Elle est capable d'hydrolyser les organophosphorés (OPs), des agents neurotoxiques utilisés en tant qu'insecticide et arme chimique de guerre dont les méthodes actuelles de décontamination restent insatisfaisantes. Non optimale, l'activité phosphotriestérase de SsoPox a été améliorée en redessiné in silico son site actif de afin qu'il ressemble à celui des PTEs, hydrolysant très efficacement les OPs. L'enzyme ainsi développée offre des perspectives d'utilisation pour la décontamination des pollutions aux OPs. L'activité lactonase de l'enzyme a également été améliorée envers certaines N-Acyl Homosérine Lactones (AHLs), des molécules impliquées dans la communication inter-bactérienne (quorum sensing). Or, le quorum sensing régule notamment la virulence bactérienne (e.g. Pseudomonas aeruginosa). Ainsi, l'utilisation de lactonases telles que SsoPox constituerait une alternative aux antibiotiques par interférence au quorum sensing (i.e. quorum quenching). L'ensemble de ces travaux a conduit au dépôt d'un brevet protégeant les séquences des variants améliorés ainsi que leurs domaines d'applications. Ils permirent également d'étudier des phénomènes clés dans l'évolution des enzymes tels que l'épistasie, la promiscuité et la flexibilisation. Ce projet, mêlant Sciences fondamentales et appliquées, pourrait, in fine, mener à la valorisation d'un projet de recherche académique. / Issued from the extremophilic Archaea Sulfolobus solfataricus, SsoPox exhibits an important biotechnological potential because of its extreme stability. Belonging to the phosphotriesterase-like lactonase family, its natural lactonase and promiscuous phosphotriesterase activities were characterized. The enzyme is able to hydrolyze organophosphates (OPs), i.e. nerve agents used as insecticides and chemical warfare agents for which current methods of decontamination are unsatisfactory. The phosphotriesterase activity of SsoPox is suboptimal unlike some mesophilic enzymes (PTEs). To develop a robust bio-decontaminant of OPs, we redesigned, in silico, SsoPox active site in the aim to mimic that of PTEs. Using a mutation database in an in vitro evolution protocol, we screened, selected and characterized efficient enzymes for OPs insecticides hydrolysis, offering prospects in OPs decontamination. SsoPox lactonase activity was also improved for some N-Acyl Homoserine Lactones (AHLs), molecules involved in the inter-bacterial communication (quorum sensing). Quorum sensing regulates several functions such as virulence of some pathogens (e.g. Pseudomonas aeruginosa). The use of lactonases such as SsoPox could constitute an alternative to antibiotics by quorum sensing (and thus virulence) inhibition (i.e. quorum quenching). These works were patented, protecting the sequences of improved variants and their fields of application. They also allowed to study key phenomena in enzyme evolution such as epistasis, promiscuity and flexibility. This project, combining basic and applied Sciences, could lead, in fine, to the promotion of an academic research project.

Bioluminescence is the chemical production of light that results when a luciferase enzyme catalyzes the luminogenic oxidation of a small-molecule luciferin substrate. The numerous luciferases and luciferins nature has evolved can be used to illuminate biological processes, from in vitro assays to imaging processes in live animals. However, we can improve the utility of bioluminescence through modification of these enzymes and substrates. My thesis work focuses on developing reporters that expand the bioluminescent toolkit and improving our understanding of how bioluminescence works on a molecular level. The first part of my thesis focuses on characterizing luciferases and luciferins that improve bioluminescence imaging in vivo. Some of our luciferins can outperform the natural D-luciferin substrate in live mouse imaging, while others are selectively utilized by mutant luciferases in live mouse brain. We also engineered luciferins that can selectively report on endogenous enzymatic activity in live mice. The second part of my thesis focuses on determining the molecular details of how enzymes related to firefly luciferase, long-chain fatty acyl-CoA synthetases (ACSLs), can function as latent luciferases. I have determined the structure for one of these enzymes and improved its bioluminescent activity with synthetic luciferins enough to image in live mouse brain. I also characterized the selectivity in chimerized enzymes that combine firefly luciferase and ACSLs. In summary, my work improves the utility of bioluminescence for in vivo use and informs us about how evolutionarily-related enzymes function as luciferases on a molecular level.