This thesis is focused on the development and utilisation of chemical and biological tools to probe the function of modified bases in DNA with specific exploration of the less well-studied T-modifications: 5-hmU, 5-fU and Base J. LCMS/MS techniques are first utilised to enable the accurate global quantification of T-modifications (5-hmU, 5-fU and Base J) in both trypanosomatids and mammalian DNA. A chemical affinity-enrichment sequencing method for the T-modifications is next described, which allows their chemoselective tagging over their C-modification counterparts. DNA fragments containing 5-fU are selectively tagged and enriched via oxime, hydrazine or benzimidazole formation using a biotinylated probe, and DNA fragments containing 5-hmU can be first chemically oxidised to 5-fU using KRuO4. .Proof-of-principle T-modification enrichment is demonstrated by DNA sequencing. In the following chapter, sequencing methods are employed to investigate the role of T-modifications in both trypanosomatids and mammalian samples. In T.Brucei, Base J formation is probed by artificial incorporation of 5-hmU and subsequent Base J chemical sequencing. Base J is preferentially formed or depleted at certain genomic loci; suggesting that Base J formation is sequence-specific. This may imply a distinct role for the 5-hmU sites which are not further glucosylated. Next, 5-hmU enrichment sequencing is performed in SMUG1 knockdown HEK293T cells to determine the genomic location of 5-hmU in mammals. An increase in 5-hmU loci is observed upon SMUG1 knockdown. 5-hmU enriched regions are found to be T-rich and depleted in exons and promoters. Furthermore, 5-hmU sites show poor overlap with known TET-enzyme binding sites, indicating that 5-hmU is formed via a TET-independent mechanism in HEK293T cells. Next, mass spectrometry-based proteomics studies are utilised to determine 5-fU protein-binders in mammals. Pulldown of proteins using biotinylated baits enables the identification of proteins which are enriched or suppressed in the presence of the 5-fU modification compared to a non-modified control. Enriched proteins include those associated with DNA-damage, consistent with the current understanding that 5-fU is a product of oxidative damage in mammalian DNA. Finally, a mechanistic insight into the effect of formylated bases on nucleosomal structure is described. Schiff base formation between formylated nucleobases and histone protein lysine side-chains is demonstrated. This provides a molecular mechanism for the association of 5-fC with increased nucleosomal occupancy in vivo.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-12-16Bitstream added on 2014-06-13T19:38:28Z : No. of bitstreams: 1 000748839.pdf: 1424826 bytes, checksum: 8b005873ea1e668e7352dd202f004baf (MD5) / A produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos é uma biotecnologia de grande impacto econômico por maximizar o potencial reprodutivo de animais geneticamente superiores resultando em maior eficiência reprodutiva. Apesar dos avanços da PIVE, a porcentagem de embriões que se desenvolvem ainda são inferiores aos produzidos in vivo. Epigenética é a regulação da expressão gênica sem alteração na sequência do DNA. Mecanismos epigenéticos, como o remodelamento das histonas, controlam expressão gênica e são fundamentais para o correto desenvolvimento embrionário. Dessa forma, modificações específicas nas histonas podem reprimir ou estimular a transcrição gênica. Os mecanismos epigenéticos são vulneráveis aos fatores ambientais, assim, os sistemas de cultivo in vitro podem ter um impacto no perfil de expressão de importantes genes relacionados ao desenvolvimento embrionário pré-implantacional. Dada a importância e a aplicabilidade da PIVE como biotecnologia reprodutiva, o papel vital dos mecanismos epigenéticos durante o desenvolvimento embrionário, e a importante correlação entre as condições de cultivo embrionário e o perfil epigenético, o presente estudo investigou a influência de diferentes condições de cultivo durante o desenvolvimento embrionário por meio da utilização de diferentes concentrações de soro fetal bovino (SFB) (0% ou 2,5%) e diferentes tensões de oxigênio (O2) (5% ou 20%) durante o cultivo embrionário in vitro (CIV) na regulação epigenética, especificamente no remodelamento das histonas H3K9me2 (repressiva) e H3K4me2 (permissiva) de embriões bovinos produzido in vitro. Para este fim, foram delineados quatro tratamentos durante o cultivo embrionário. T1: embriões foram cultivados em meio de cultivo “Synthetic Oviduct Fluid” (SOF) com 0% SFB sob tensão de 5% de O2; T2: embriões foram cultivados em meio SOF com 2,5% SFB sob... / In vitro production (IVP) of bovine embryos is a biotechnology of great economic impact, as it maximizes the reproductive potential of genetically superior animals, resulting in greater reproductive efficiency. Despite advances in technology in IVP, the percentage of embryos that develop to the transfer stage is still inferior to those seen in vivo. Epigenetics is the regulation of gene expression without altering DNA sequence. Epigenetic processes, such as histone remodeling, control gene expression and are essential for proper embryo development. Specific histone modifications can repress or stimulate gene transcription. Epigenetic mechanisms are under intense environmental control, therefore in vitro culturing systems can impact the expression patterns of genes that support pre-implantation embryo development. Given the importance of IVP as a reproductive biotechnology, the role of epigenetic processes during embryo development, as well the important correlation between culture conditions and epigenetic patterns, the present study was designed to investigate the influence of different culture conditions on embryo development, through the use of different concentrations of fetal bovine serum (FBS) (0% and 2,5%) and different oxygen tensions (O2) (5% and 20%) during in vitro culture, in epigenetic regulation, specifically in the histone remodeling H3K9me2 (repressive) and H3K4me2 (permissive) marks, in bovine embryos produced in vitro. Four treatments were designed and utilized during embryo culture: T1: embryos were cultured in Synthetic Oviduct Fluid (SOF) media with 0% FBS, under 5% O2 tension; T2: embryos were cultured in SOF media with 2.5% FBS, under 5% O2 tension; T3: embryos were cultured in SOF media with 0% FBS, under 20% O2 tension and T4: embryos were cultured in SOF media with 2.5% FBS, under 20% O2 tension. Cleavage and expanded blastocyst development rates were evaluated, as ...

Thesis (MSc (Biomedical Technology))--Cape Peninsula University of Technology, 2016. / The early detection of individuals who are at risk of developing type 2 diabetes mellitus (T2DM) would decrease the morbidity and mortality associated with this disease. DNA methylation, the most widely studied epigenetic mechanism, offers unique opportunities in this regard. Aberrant DNA methylation is associated with disease pathogenesis and is observed during the asymptomatic stage of disease. DNA methylation has therefore attracted increasing attention as a potential biomarker for identifying individuals who have an increased risk of developing T2DM. The identification of high risk biomarkers for T2DM could facilitate risk stratification and lifestyle interventions, which could ultimately lead to better ways to prevent, manage and control the T2DM epidemic that is rampant worldwide. The aim of the study was to investigate global DNA methylation as a potential risk factor for T2DM by studying the association between the global DNA methylation levels and hyperglycaemic states. A cross-sectional, quantitative study design, involving 564 individuals of mixed ancestry descent, residing in Bellville South, South Africa was used. Participants were classified as normal, pre-diabetic (impaired fasting glucose (IFG) and/or impaired glucose tolerance (IGT)) or diabetic (screen detected diabetic and known diabetics) according to WHO criteria of 1998. DNA was extracted from whole blood using the salt extraction method. The percentage global DNA methylation was measured by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The association between global DNA methylation and hyperglycaemia, as well as other biochemical markers of T2DM was tested in a robust linear regression analysis adjusted for age, gender and smoking.

Thesis (MTech (Biomedical Technology))--Cape Peninsula University of Technology, 2016. / The early detection of individuals who are at risk of developing type 2 diabetes mellitus (T2DM) would decrease the morbidity and mortality associated with this disease. DNA methylation, the most widely studied epigenetic mechanism, offers unique opportunities in this regard. Aberrant DNA methylation is associated with disease pathogenesis and is observed during the asymptomatic stage of disease. DNA methylation has therefore attracted increasing attention as a potential biomarker for identifying individuals who have an increased risk of developing T2DM. The identification of high risk biomarkers for T2DM could facilitate risk stratification and lifestyle interventions, which could ultimately lead to better ways to prevent, manage and control the T2DM epidemic that is rampant worldwide. The aim of the study was to investigate global DNA methylation as a potential risk factor for T2DM by studying the association between the global DNA methylation levels and hyperglycaemic states. A cross-sectional, quantitative study design, involving 564 individuals of mixed ancestry descent, residing in Bellville South, South Africa was used. Participants were classified as normal, pre-diabetic (impaired fasting glucose (IFG) and/or impaired glucose tolerance (IGT)) or diabetic (screen detected diabetic and known diabetics) according to WHO criteria of 1998. DNA was extracted from whole blood using the salt extraction method. The percentage global DNA methylation was measured by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The association between global DNA methylation and hyperglycaemia, as well as other biochemical markers of T2DM was tested in a robust linear regression analysis adjusted for age, gender and smoking.

Resumo: A acetilação das histonas é um dos principais mecanismos de reprogramação epigenética do genoma dos gametas a fim de estabelecer um estado totipotente para o desenvolvimento normal. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da utilização da Tricostatina A (TSA) sobre os níveis de acetilação das histonas e o desenvolvimento embrionário, avaliando-se a contagem do número de células da massa celular interna (MCI), trofectoderma (TE), e células totais, e os níveis da reação de imunocitoquímica para H3K9ac. Para isso, três experimentos foram delineados. No primeiro experimento, verificou-se que o grupo tratado com 5nM de TSA por 144h durante o cultivo in vitro (CIV) aumentou (p<0,01) o nível de H3K9ac em relação ao grupo controle. A taxa de clivagem e o desenvolvimento embrionário foram avaliados em um segundo experimento, e o grupo tratado com 5nM de TSA não apresentou diferença na produção de embriões comparado ao grupo controle. No experimento 3, o tratamento com a TSA não apresentou efeitos significativos em relação ao número de células da MCI, porém houve redução (p<0,01) tanto do número de células da TE quanto de células totais comparado ao grupo controle. Portanto, conclui-se que o tratamento com TSA não altera o desenvolvimento embrionário pré-implantacional de embriões fêmeas de bovinos, mostrando efeito negativo sobre o desenvolvimento dos embriões tratados / Abstract: Histone acetylation is one of the major mechanisms of epigenetic reprogramming of gamete genome to establish a totipotent state for normal development. The aim of this work was to evaluate the use of Trichostatin A (TSA) on the levels of histone acetylation and embryonic development, the assessment of counting the cell number of inner cell mass (ICM), trophectoderm (TE), and total cells, and the levels of H3K9ac for immunocytochemical reaction. Therefore, three experiments were designed. In the first experiment, it was verified that the group treated with TSA for 5nM for 144h during in vitro culture (IVC) increased (p <0.01) the level of H3K9ac in the control group. Cleavage rate and embryo development were evaluated in a second experiment, and the group treated with 5nM TSA showed no difference in embryo production compared to control. In Experiment 3, treatment with TSA had no significant effect on the cell number of ICM, but decreased (p <0.01) both the cell number of TE and total cells as compared to control. Therefore, it is concluded that treatment with TSA does not alter the preimplantation embryonic development female bovine embryos, showing a negative effect on the development of embryos treated / Orientador: Jeffrey Frederico Lui / Coorientador: Joaquim Mansano Garcia / Banca: Gilson Hélio Toniollo / Banca: Sandro Henrique Antunes Ribeiro / Mestre

Neuroblastoma (NB) é a forma mais indiferenciada de tumores neuroblásticos e a principal causa de morte por câncer pediátrico. Alterações epigenéticas interagem em todas as etapas do desenvolvimento do câncer, promovendo a progressão tumoral. A remodelação da cromatina é influenciada pela acetilação de histonas e a metilação de DNA. Acetiltransferases de histona (HATs), desacetilases de histonas (HDAC) e metiltransferase de DNA (DNMTs) são alvos de estratégias terapêuticas em tumores. Os retinoides agem nas vias de diferenciação celular, anti-proliferação e pró-apoptose. Nesse trabalho, é proposto que a combinação desses moduladores epigenéticos e de diferenciação em linhagens de células de NB humano é mais efetiva que os agentes isolados. Os tratamentos induziram mudanças na expressão de marcadores de diferenciação e indiferenciação, como c-Myc, β-3tubulina, NeuN e Bmi1, e alterações morfológicas nas duas linhagens celulares utilizadas, SK-N-BE(2) e SH-SY5Y. Os dados encontrados podem contribuir para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares dos moduladores retinoides e epigenéticos em NB capazes de acrescentar melhorias nas atuais estratégias terapêuticas. / Neuroblastoma (NB) is the most undifferentiated form of neuroblastic tumors and the leading cause of death from pediatric cancer. Epigenetic changes interact at all stages of cancer development, promoting tumor progression. Chromatin remodeling is influenced by histone acetylation and DNA methylation. Histone acetyltransferases (HATs), histone deacetylases (HDAC), and DNA methyltransferase (DNMTs) are targets for therapeutic strategies in cancer. Retinoids act on cell differentiation pathways and display anti-proliferation and pro-apoptotic actions. In the present research we examined the effects of combining epigenetic modulators and a retinoid receptor agonist in human NB cells. The retinoid all trans-retinoic acid (ATRA) combined with inhibitors of either histone deacetylases (HDACs) or DNA methyltransferase was more effective than any drug given alone in impairing the proliferation of SH-SY5Y and SK-N-BE(2) NB cells. In addition, the treatments induced differential changes in the expression of differentiation markers including c-Myc, β-3tubulin, NeuN and Bmi1, and morphological changes in SK-N-BE(2) e SH-SY5Y cell lines. The data contribute to a better understanding of the molecular mechanisms of retinoid modulators and epigenetic in NB able to add improvements in current therapeutic strategies.

Submitted by Fernanda de Souza Monteiro (f.monteiro@unesp.br) on 2018-08-15T01:29:40Z No. of bitstreams: 1 FernandaMonteiroTESE.pdf: 1707798 bytes, checksum: 6902254db3112b853eeae6f8472782b4 (MD5) / Rejected by Elza Mitiko Sato null (elzasato@ibilce.unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: Problema 01) Falta a FICHA CATALOGRÁFICA (Obrigatório pela ABNT NBR14724) Problema 02) Como você recebeu financiamento da CAPES, o nome dela deve constar também na FOLHA DE APROVAÇÃO. Problema 03) A ordem correta das páginas pré-textuais (capa, folha de rosto, ficha catalográfica, folha de aprovação, dedicatória, agradecimentos, epígrafe, resumo na língua vernácula, resumo em língua estrangeira, listas de ilustrações, de tabelas, de abreviaturas, de siglas e de símbolos e sumário) Problema 04) A página 65 está em branco, o arquivo não pode conter páginas em branco. Problema 05) A paginação deve ser sequencial, iniciando a contagem na folha de rosto e mostrando o número a partir da introdução, a ficha catalográfica ficará após a folha de rosto e não deverá ser contada. OBS:-Estou encaminhando via e-mail o template/modelo das páginas pré-textuais para que você possa fazer as correções, sugerimos que siga este modelo pois ele contempla as normas da ABNT Lembramos que o arquivo depositado no repositório deve ser igual ao impresso, o rigor com o padrão da Universidade se deve ao fato de que o seu trabalho passará a ser visível mundialmente. Agradecemos a compreensão. on 2018-08-15T12:18:38Z (GMT) / Submitted by Fernanda de Souza Monteiro (f.monteiro@unesp.br) on 2018-08-21T11:36:28Z No. of bitstreams: 1 FernandaMonteiroTESE.pdf: 1707798 bytes, checksum: 6902254db3112b853eeae6f8472782b4 (MD5) / Rejected by Elza Mitiko Sato null (elzasato@ibilce.unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: Problema 01) Falta a FICHA CATALOGRÁFICA (Obrigatório pela ABNT NBR14724) Problema 02) Como você recebeu financiamento da CAPES, o nome dela deve constar também na FOLHA DE APROVAÇÃO. Problema 03) A ordem correta das páginas pré-textuais (capa, folha de rosto, ficha catalográfica, folha de aprovação, dedicatória, agradecimentos, epígrafe, resumo na língua vernácula, resumo em língua estrangeira, listas de ilustrações, de tabelas, de abreviaturas, de siglas e de símbolos e sumário) Problema 04) A página 65 está em branco, o arquivo não pode conter páginas em branco. Problema 05) A paginação deve ser sequencial, iniciando a contagem na folha de rosto e mostrando o número a partir da introdução, a ficha catalográfica ficará após a folha de rosto e não deverá ser contada. OBS:-Estou encaminhando via e-mail o template/modelo das páginas pré-textuais para que você possa fazer as correções, sugerimos que siga este modelo pois ele contempla as normas da ABNT Lembramos que o arquivo depositado no repositório deve ser igual ao impresso, o rigor com o padrão da Universidade se deve ao fato de que o seu trabalho passará a ser visível mundialmente. Agradecemos a compreensão. on 2018-08-21T11:47:18Z (GMT) / Submitted by Fernanda de Souza Monteiro (f.monteiro@unesp.br) on 2018-08-28T15:24:56Z No. of bitstreams: 1 FernandaMonteiroTESE.pdf: 1707798 bytes, checksum: 6902254db3112b853eeae6f8472782b4 (MD5) / Rejected by Elza Mitiko Sato null (elzasato@ibilce.unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: Problema 01) Falta a FICHA CATALOGRÁFICA (Obrigatório pela ABNT NBR14724) Problema 02) Como você recebeu financiamento da CAPES, o nome dela deve constar também na FOLHA DE APROVAÇÃO. Problema 03) A ordem correta das páginas pré-textuais (capa, folha de rosto, ficha catalográfica, folha de aprovação, dedicatória, agradecimentos, epígrafe, resumo na língua vernácula, resumo em língua estrangeira, listas de ilustrações, de tabelas, de abreviaturas, de siglas e de símbolos e sumário) Problema 04) A página 65 está em branco, o arquivo não pode conter páginas em branco. Problema 05) A paginação deve ser sequencial, iniciando a contagem na folha de rosto e mostrando o número a partir da introdução, a ficha catalográfica ficará após a folha de rosto e não deverá ser contada. Lembramos que o arquivo depositado no repositório deve ser igual ao impresso, o rigor com o padrão da Universidade se deve ao fato de que o seu trabalho passará a ser visível mundialmente. Sua submissão será rejeitada para que você possa fazer as correções. Agradecemos a compreensão. on 2018-08-28T19:46:58Z (GMT) / Submitted by Fernanda de Souza Monteiro (f.monteiro@unesp.br) on 2018-09-25T16:14:04Z No. of bitstreams: 1 FernandaTESE correção 18.09.18.pdf: 1688049 bytes, checksum: 425632850484dc8bc0111fed0b6e427c (MD5) / Approved for entry into archive by Elza Mitiko Sato null (elzasato@ibilce.unesp.br) on 2018-09-26T13:06:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 monteiro_fs_dr_sjrp.pdf: 4717252 bytes, checksum: ba2c67ffbe5c027002b90049ebbbfe2c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-26T13:06:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 monteiro_fs_dr_sjrp.pdf: 4717252 bytes, checksum: ba2c67ffbe5c027002b90049ebbbfe2c (MD5) Previous issue date: 2018-05-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Síndromes Mielodisplásicas (SMDs) é a denominação de um grupo de doenças neoplásicas clonais das células hematopoéticas, mais frequentemente observadas em idosos, caracterizadas por citopenias, displasia, hematopoese ineficaz e risco elevado para leucemia mielóide aguda (LMA). Citopenia(s) persistente(s), por mais de seis meses, e ausência de critérios diagnósticos para SMD, caracteriza a Citopenia Idiopática de Significado Indeterminado (ICUS). ICUS foi definida recentemente e é pouco conhecida quanto aos fatores etiológicos. Já as SMDs são consideradas protótipos de doenças epigenéticas, uma vez que distúrbios na metilação de alguns genes que regulam proliferação e diferenciação celular têm sido considerados fatores causais. O gene SOX17, por exemplo, é um supressor de tumor expresso em vários tecidos e alterações no seu padrão de metilação já foram observadas em tumores sólidos e neoplasias hematológicas, entretanto, foram pouco estudadas nas SMDs e não há descrições de estudos em ICUS. Do mesmo modo, alguns microRNAs vem sendo utilizados como marcadores moleculares para diagnóstico e prognóstico para diversas anormalidades hematológicas, mas seu papel na etiologia e desenvolvimento das SMDs também é pouco conhecido. Neste contexto, este estudo propos investigar o padrão de metilação do gene SOX17 por MSP-PCR em células da medula óssea (MO) de pacientes com SMD e ICUS ao diagnóstico, e analisar alterações no padrão de expressão de microRNAs por RT-PCR em células da MO de adultos e de crianças com SMD. Em adultos foram investigados os microRNAs miR126, miR29a, miR20a, miR181a, miR19b, miR21, miR155, miR146, miR22, miR193, miR26a e miR29b, e em crianças, os microRNAs miR193, miR29b miR22 e miR26a. O padrão de metilação do gene SOX17 foi analisado em 26 pacientes com SMD e em 15 pacientes com ICUS. A hipermetilação da região promotora do gene foi identificada em 57,7% dos indivíduos com SMD e em 53,3% daqueles com ICUS, sugerindo que o silenciamento do SOX17 pode ser um evento frequente e participar do curso inicial destas doenças. A análise dos microRNAs foi realizada em 55 pacientes adultos com SMD e em oito controles saudáveis. Dos 12 microRNAs testados, sete apresentaram padrão de expressão anormal em relação ao grupo controle, e dos quatro micros investigados em 28 pacientes com SMD infantil, os micros, miR193, miR29b apresentaram expressão diminuída em relação ao grupo controle em aproximadamente 70% dos pacientes analisados e a expressão do miR22 foi maior em mais da metade das amostras analisadas, enquanto uma expressão diminuída do miR26a foi observada em 28 (100%) dos pacientes analisados. Considerando-se que os microRNAs estudados podem atuar como reguladores da hematopoese, os dados revelam a importância dos microRNAS na etiologia das SMDs, sugerindo esses como possíveis biomarcadores diagnósticos para a SMD adulto e infantil. / Myelodysplastic syndromes (MDS) denominates a group of neoplastic diseases of the hematopoietic cells, most commonly observed in elderly patients, characterized by cytopenias, dysplasia, ineffective hematopoiesis and high risk of acute myeloid leukemia (AML). Persistent cytopenia (s), for more than six months, and absence of diagnostic criteria for MDS, characterizes Idiopathic Cytopenia of Undetermined Significance (ICUS). ICUS has been recently defined, and little is known about its etiological factors. The MDSs are considered as prototypes of epigenetic diseases, due to the fact that methylation disorders of some genes that regulate cell proliferation and differentiation have been considered as causal factors. The SOX17 gene, for example, is a tumor suppressor expressed in several tissues and changes in its methylation pattern have already been observed in solid tumors and hematological malignancy, however, these changes have been little studied in MDS and there are no descriptions of studies in ICUS. Similarly, some microRNAs are being used as molecular markers for diagnosis and prognosis for various hematological abnormalities, but its role in the etiology and development of MDS is also poorly understood. In this context, this study aimed to investigate the methylation pattern of the SOX17 gene by MSP-PCR in bone marrow (BM) cells of patients diagnosed with MDS and ICUS, and to analyze changes in the expression pattern of microRNAs by RT-PCR in cells of BM for adults and children with MDS. In adults, the microRNAs miR29a, miR20a, miR181a, miR19b, miR21, miR155, miR146, miR22, miR193, miR26a and miR29b were tested, and in children, microRNAs miR193, miR29b miR22 and miR26a. The methylation pattern of the SOX17 gene was analyzed in 26 patients with MDS and in 15 patients with ICUS. The hypermethylation of the SOX17 promoter region was identified in 57.7% of the individuals with MDS and in 53.3% of those with ICUS, suggesting that the silencing of SOX17 can be a frequent event and participate in the initial course of these diseases. MicroRNAs were analyzed in 55 adult MDS patients and in 8 healthy controls. Among the 12 microRNAs tested in MDS adults, seven presented an abnormal expression pattern in relation to the control group, and of the four microRNAs investigated in 28 children with MDS, miR193 and miR29b presented decreased expression in relation to the control group in approximately 70% of the analyzed patients and miR22 expression was higher in more than half of the analyzed samples, whereas diminished expression of miR26a was observed in 28 (100%) of the patients analyzed. Considering that the studied microRNAs may act as regulators of hematopoese, the data reveal the importance of microRNAS in the etiology of MDS, suggesting these as possible diagnostic biomarkers and prognostic of adult and infant MDS. / 88881.132788/2016-01

O meduloblastoma (MB) é um câncer do sistema nervoso central, de origem embrionária, que surge no cerebelo. É o tumor maligno cerebral mais frequente na infância e corresponde a aproximadamente 20% de todos os tumores intracranianos pediátricos. Atualmente, o tratamento é realizado com cirurgia, quimioterapia e radioterapia e está relacionado com diversos efeitos colaterais em médio e longo prazo. Diversos fatores contribuem para o seu desenvolvimento e progressão, entre estes, alterações nas vias de sinalização, como a Sonic Hedgehog (SHH) e Wingless. As modificações nos padrões epigenéticos, como a metilação do DNA, tem também um papel central na biologia deste tumor. Tais alterações comprometem funções básicas da célula como o controle da proliferação, sobrevivência celular e apoptose. Drogas epigenéticas como os inibidores de DNA metiltransferases (DNMTs) têm demonstrado efeitos antineoplásicos e resultados promissores para terapia do câncer. A Zebularina é um inibidor de DNMTs, que consequentemente reduz a metilação do DNA, e tem se mostrado uma importante droga antitumoral, com baixa toxicidade e atividade adjuvante à quimioterapia em tumores quimio-resistentes. Diversos estudos têm descrito seus efeitos em diferentes tipos de neoplasias, entretanto, não há relatos da sua ação em MB. Sendo assim, o presente trabalho teve como objetivo analisar os potenciais efeitos antineoplásicos da Zebularina em quatro linhagens de MB pediátrico (DAOY, ONS-76, UW402 e UW473). Foi observado que o tratamento com a Zebularina promoveu inibição da proliferação celular e da capacidade clonogênica, aumentou o número de células apoptóticas e células na fase S do ciclo celular (p<0,05). Adicionalmente, o tratamento induziu um aumento na expressão proteica de p53, p21 e Bax e uma diminuição da ciclina A, Bcl-2 e Survivina. Além disso, quando combinada com o quimioterápico vincristina agiu de modo sinérgico; e de modo antagônico quando combinada com a cisplatina. Através de análises de expressão gênica em larga escala (plataforma Agilent de microarray), foi encontrada diferentes vias moduladas pela droga, incluindo a dos Receptores Toll-Like e o aumento dos genes SUFU e BATF2. Aqui, foi encontrado que a Zebularina pode modular a ativação da via SHH, reduzindo os níveis de SMO, de GLI1 e de um de seus alvos, o PTCH1; contudo sem alterar os níveis de SUFU. Confirmou-se que o gene BATF2 é induzido pela Zebularina e possui regiões ricamente metiladas. Além disso, a baixa expressão do gene BATF2 está associada à um pior prognóstico em MB. Todos esses dados sugerem que a Zebularina pode ser uma droga em potencial para o tratamento adjuvante do MB / Medulloblastoma (MB) is an embryonal cerebellum tumor. It is the most common brain malignancy in children and accounts for approximately 20% of all pediatric intracranial tumors. Currently, treatment consists of surgery, chemotherapy and radiation and is associated to medium- and long-term side effects. Several factors contribute to the development and progression of MB, for instance, alterations in signaling pathways, such as Sonic Hedgehog (SHH) and Wingless. Epigenetic changes in DNA methylation patterns also play a central role in the biology of this tumor. Such changes are able to alter basic cell functions, controlling cell proliferation, survival and apoptosis. Epigenetic drugs as DNA methyltransferases (DNMTs) inhibitors have shown anticancer effects and promising results for cancer therapy. Zebularine is a low toxicity DNMTs inhibitor that induces DNA demethylation and has been reported as an important antitumor drug with adjuvant activity to chemotherapy in chemoresistant tumors. Studies have described its effects on different types of cancer, however, there are not data concerning its action in MB. Therefore, this study aimed to analyze the potential anticancer effects of Zebularine in four pediatric MB lines (UW402, UW473, ONS- 76 and DAOY). It was observed that treatment with Zebularine promoted inhibition of cell proliferation and clonogenic capacity, increased the number of apoptosis rate and cells in S phase of the cycle (p <0.05). In addition, the treatment induced an increasing in the protein expression of p53, p21 and Bax and a decreasing in cyclin A, Survivin and Bcl-2. Also, when combined with the chemotherapeutic agent vincristine acted synergistically but resulted in antagonism when combined with cisplatin. Through large-scale gene expression analysis (Agilent microarray platform), it was found different pathways modulated by Zebularine, including the Toll-Like Receptors pathway and the overexpression of SUFU and BATF2 genes. Zebularine was able to modulate SHH pathway activation, by reducing levels of SMO, GLI1 and one of its targets, PTCH1, whereas there were no changes in SUFU levels. It was confirmed that the gene BATF2 is induced by Zebularine and contains regions richly methylated. In addition, BATF2 low expression is associated with a worse prognosis in MB. All these data suggest that Zebularine may be a potential drug for the adjuvant treatment of MB

Orientador: Ana Paula de Souza Pardo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-24T15:42:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Planello_AlineCristiane_D.pdf: 1888206 bytes, checksum: 00e43f6f072e313fafc04b5a4406af8b (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A inflamação crônica é conhecida por induzir alterações epigenéticas, em particular, alterações na metilação do DNA. A ilha CpG do gene SOCS1 tem sido observada hipermetilada em diferentes tipos de câncer e em doenças associadas à inflamação. No entanto, pouco se sabe sobre essas alterações epigenéticas associadas à periodontite crônica. A fim de abordar essa questão, nós investigamos a metilação do DNA no exon 2 da Ilha CpG do SOCS1 e sua relevância funcional para a periodontite crônica em 90 amostras de tecidos gengivais usando a técnica de comparação de melting sensível a metilação (MS-HRM). Nós observamos que a região analisa se encontra hipermetilada quando comparada com amostras de indivíduos saudáveis. Alterações na expressão no SOCS1 não foram encontradas. Posteriormente foram realizadas investigações da sequencia do SOCS1 que revelaram marcadores de enhancer na região. Analise de sítios hipersensíveis a Dnase I (Dnase I hipersensitivity site ¿ DHS), que são associados com região regulatória, mostraram um DHS dentro do exon2 do SOCS1, que cobre a mesma região estudada na técnica MS-HRM. Esse DHS correlacionou-se com vários promotores na vizinhança do SOCS1, sendo considerados os genes alvos. Fragmentos desmetilados e metilados cobrindo a região encontrada com diferença de metilação no SOCS1 foram clonados em um plasmídeo repórter que possui um promotor e é livre de qualquer CpG.. Os fragmentos desmetilados aumentaram a atividade da luciferase, demonstrando a atividade de enhancer da região. Já os fragmentos metilados, além de não exercerem atividade de enhancer, foram capazes de reprimir a função do promotor. Corroborando essas informações, foi observada correlação negativa entre a metilação no SOCS1 nas amostras com inflamação e a expressão de genes. Os dados apresentados indicam que a função principal da metilação do DNA em um enhancer é controlar sua função regulatória e consequentemente os níveis de transcrição dos genes alvo, o que pode ser evidenciado pela hipermetilação do exon do SOCS1 na inflamação crônica / Abstract: Chronic inflammation is known to induce epigenetic alterations, in particular alterations in DNA methylation. SOCS1 CpG island (CGI) has been demonstrated hypermethylated in many types of cancer and inflammation-associated diseases. However, little is known about the epigenetic changes associated with chronic periodontitis. In order to address this question, we investigated DNA methylation of oxon 2 of SOCS1 CGI and its functional relevance to chronic periodontitis in 90 gingival tissue samples using methylation sensitive high resolution melting (MS-HRM). We found this region to be hypermethylated when compared with healthy controls. No changes in gene expression were observed. Further investigations of SOCS1 sequence showed enhancer marker at SOCS1 region. Correlation analysis of Dnase I hypersensitivity site (DHS), which is associated with regulatory region, showed a DHS inside exon2 SOCS1 correlated with several promoter in the neighboring region, considered target genes. Fragments harboring the SOCS1 region found to be differentially methylated, were cloned into a CpG free-Luc reporter vector just upstream the promoter. Unmethylated and methylated fragments were tested. The unmethyalted fragment enhanced the promoter activity of the promoter. Strikingly, not only the exon2 of SOCS1 CGI presented enhancer activity but also it had its activity disrupted by DNA methylation. Accordingly, negative correlation between SOCS1 methylation and expression of neighboring genes was observed in chronic inflammation. The data indicate that the primary function of enhancer DNA methylation is to control its regulatory function and the transcription levels of enhancer target genes, which can be evidenced by exon 2 SOCS1 CGI hypermethylation on chronic inflammation / Doutorado / Histologia e Embriologia / Doutora em Biologia Buco-Dental

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