Description du sujet de recherche abordé: Le pied du cheval est composé de nombreuses structures anatomiques renfermées dans une boîte cornée rendant linvestigation de celles-ci plus compliquée (Dyson, 2003). Les méthodes dimagerie classiquement utilisées en médecine équine telle la radiographie et léchographie montrent de nombreuses limites dans linvestigation de cette région. Cest pourquoi, limagerie par résonance magnétique (IRM) est de plus en plus souvent utilisée pour linvestigation des boiteries du pied chez le cheval, permettant à la fois une investigation des structures osseuses et des tissus mous (Dyson et Murray, 2007c; b ; Werpy, 2009). De nombreuses études IRM ont été réalisées sur membres isolés afin de permettre un examen différé dans le temps et dans lespace voire dutiliser différentes techniques dinvestigation (Denoix, et al., 1993 ; Whitton, et al., 1998 ; Widmer, et al., 1999 ; Widmer, et al., 2000 ; Busoni, et al., 2005 ; Murray, et al., 2006 ; Spriet, et al., 2007). Le protocole de conservation varie dune étude à lautre, utilisant en général des membres congelés puis décongelés. Une étude décrit un protocole de conservation basé sur la congélation et la décongélation du membre (Widmer, et al., 1999). Cependant, ce protocole est fastidieux. De plus, plusieurs limites sont présentes dans cette étude. Dans une étude précédente sur des membres isolés, certains membres avaient été évalués ante-mortem (Murray, et al., 2006). Ceux-ci ont permis une comparaison qualitative des images ante-mortem et post-mortem dun même pied sans mise en évidence de changement de signal. Cependant, aucune étude quantitative na été réalisée et il nest pas précisé comment la comparaison a été réalisée et sur bases de quels critères. Différents systèmes sont maintenant disponibles pour lIRM du pied équin dont notamment une machine permettant lexamen des membres sur chevaux debout, uniquement sous sédation (Mair, et al., 2005) contrairement aux systèmes adaptés de la médecine humaine où lanesthésie générale est toujours nécessaire. Cependant, aucune étude sur des chevaux, na comparé la qualité des images obtenues sur des machines avec une intensité de champ magnétique différente si ce nest une étude sur le cartilage et los sous-chondral (Tapprest, et al., 2003). Cette étude a comparé un système de bas champ (low field - LF) pour chevaux couchés à un système de haut champ (high field HF). Elle a démontré une différence entre les 2 machines uniquement pour la détection de lésion cartilagineuse de bas grade. La comparaison dun système pour chevaux debout à un système de haut champ na jamais été réalisée si ce nest par le biais de la littérature humaine. Aucune unanimité sur les séquences et plans de coupe à utiliser lors dexamen IRM du pied équin na été établie dans la littérature. La majorité des études utilisent 3 séquences différentes (T1, T2, séquence avec suppression de la graisse) dans les 3 plans de coupe (Whitton, et al., 1998 ; Dyson, et al., 2003 ; Murray, et al., 2003 ; Dyson, et al., 2004 ; Zubrod, et al., 2004). Les objectifs suivants ont donc été établis : 1. évaluer le changement dans le temps du signal IRM du pied équin sain réfrigéré à 4°C (étude I : effets sur limage de la conservation des membres isolés), 2. évaluer leffet sur la qualité de limage IRM du pied équin sain du cycle de congélation/décongélation et du type de procédé de décongélation (étude II : effets sur limage de la conservation des membres isolés), 3. comparer qualitativement les images IRM de mêmes pieds sains isolés obtenues sur 3 systèmes avec une intensité de champ différente (0.27 Tesla (T), 1.5T et 3T) (étude III : effets sur limage du champ magnétique), 4. établir un ou plusieurs protocoles courts dexamen IRM du pied équin en choisissant les séquences les plus appropriées dans un nombre limité de plans de coupes, permettant de visualiser les différentes structures anatomiques les plus souvent atteintes lors de pathologie du pied équin (étude IV : effets sur limage des séquences et plans de coupe). Résultats: Les Etudes I et II ont permis de démontrer leffet de la conservation des pieds isolés sur la qualité de limage. Aucun changement de la qualité de limage na été mis en évidence lors de la réfrigération (Etude I). Une légère diminution de la taille des récessus synoviaux a été observée subjectivement. Aucun changement de signal na été noté subjectivement si ce nest pour la moelle osseuse, qui apparait légèrement plus hyperintense en séquence Short Tau Inversion Recovery (STIR) et légèrement plus hypointense en Turbo Spin Echo (TSE) pondérée en T2 après réfrigération comparé à T0. Lanalyse quantitative a démontré un changement significatif du rapport signal sur bruit (SNR) dans la moelle osseuse des membres réfrigérés lorsquils sont comparés à T0 en séquences STIR et en TSE pondérée en T2. Le réchauffement à température ambiante produit leffet inverse sur le SNR avec une augmentation significative du SNR en TSE pondérée en T2. Après 14 jours de réfrigération, une diminution du SNR a été observée dans la moelle osseuse avec les séquences TSE pondérée en T2 et Double Echo in Steady State (DESS). Le signal du tendon fléchisseur profond du doigt na pas montré de changement significatif avec la réfrigération. Aucun changement de netteté dimages na été observé dans létude II, si ce nest pour la partie dorsale et distale du sabot après congélation-décongélation. En effet, celle-ci apparaît hyperintense après congélation-décongélation dans toutes les séquences utilisées dans létude II mais de manière plus marquée en séquences TSE T2/PD et STIR. La liaison kéraphylle-podophylle est moins visible en séquences Gradient Echo (GE) T2* et TSE T2/PD après congélation-décongélation. A lexception du tendon, de petits changements de signaux ont été observés subjectivement dans toutes les structures investiguées mais pas dans toutes les séquences après un cycle congélation/décongélation. Lanalyse quantitative a démontré un changement de signal significatif dans la moelle osseuse en Spin Echo (SE) pondérée en T1 uniquement pour P3 lorsque les pieds sont décongelés à température ambiante avant lexamen. En ce qui concerne les pieds décongelés à 4°C, les changements de SNR de la moelle osseuse ont été observés dans toutes les structures osseuses et avec différentes séquences. Des changements de signal ont été significatifs dans le récessus synovial lorsque les extrémités digitées sont conservées à 4°C avant lexamen et ne sont pas retrouvés lorsque les pieds sont laissés à température ambiante pendant 24h. Les structures tissulaires telles le coussinet digital, la peau et le tissu sous-cutané, le DDFT ont montrés la plupart du temps une augmentation significative du SNR due à la congélation-décongélation et ceci avec les 2 types de décongélation (température ambiante vs. à 4°C). Ces changements étaient plus souvent présents avec les séquences GE qui semblent donc plus sensibles aux variations de signal induites par les conditions de conservation. En ce qui concerne leffet de lintensité du champ magnétique sur la qualité de limage (Etude III), les images obtenues dans chaque examen avec chaque machine étaient de valeur diagnostique à lexception des images de la boite cornée où des artéfacts considérables ont été observés avec le système de bas champ pour chevaux debout créant une distorsion et une perte de signal dorsalement et/ou distalement. Ces artéfacts étaient plus important en GE pondérée en T2*. Les valeurs de scores qualitatifs obtenues pour les différentes structures anatomiques à 3T et 1.5T (systèmes HF) étaient significativement plus grandes que les scores obtenus à 0.27T (système LF pour chevaux debout). Les scores des images obtenues à 3T étaient significativement plus grands que les scores obtenus à 1.5T. La moyenne des scores de chaque structure anatomique évaluée était statistiquement inférieure pour les images acquises avec le système LF pour chevaux debout par rapport aux images obtenues avec les 2 systèmes HF. La différence de moyenne des scores entre les 2 systèmes HF était inférieure à la différence de moyenne des scores entre les systèmes HF et le système LF pour chevaux debout. Cependant, la différence de moyenne des scores entre les systèmes HF était significative. La phalange distale, les cartilages unguéaux, los sésamoïde distal, le tendon fléchisseur profond du doigt, le ligament annulaire digital distal, le ligament sésamoïdien distal impair, le coussinet digital, le sabot et la couronne ont obtenus la plus grande différence en moyenne de scores (>1 point de score) entre le système LF et les systèmes HF. Le cartilage et los sous-chondral de larticulation interphalangienne distale (AIPD) sont les structures avec la moindre différence de moyenne de scores entre le système LF et les systèmes de HF (< 0.6 point de score entre le système de bas champ et 1 ou 2 des systèmes de haut champ). La différence de moyenne de scores entre les images obtenues à 1.5T et les images obtenues à 3T a été plus importante pour le cartilage de lAIPD et les cartilages unguéaux (> 0.2 point de score). Trois protocoles courts ont été proposés par lEtude IV. Le premier utilise principalement les séquences de SE, une séquence avec atténuation de la graisse et une séquence plus spécifique pour lévaluation du cartilage. Ces séquences sont: SE pondérée en T1 dans le plan transversal 2 (perpendiculaire au cortex palmaire de los sésamoïde distal), TSE dual echo pondérée en T2 et en PD dans le plan sagittal, STIR dans le plan sagittal, DESS 3D sans excitation selective de leau (sans WE) dans le plan dorsal 1 (parallèle à laxe de lextrémité digitée). Le deuxième protocole utilise en plus les séquences GE intéressantes pour mettre en évidence les sites dhémorragie et le cartilage articulaire. Les séquences utilisées sont : GE pondérée en T1 en 3D dans le plan dorsal 1, SE pondérée en T1 dans le plan transversal 2, GE 2D pondérée en T2* dans le plan transversal 2, TSE dual echo pondérée en T2 et en PD dans le plan sagittal, STIR dans le plan sagittal, DESS 3D sans WE dans le plan sagittal. Le troisième ajoute des plans de coupe particuliers : un perpendiculaire à linsertion distale du tendon fléchisseur profond du doigt (dorsal 3) et lautre perpendiculaire aux ligaments collatéraux de larticulation interphalangienne distale (transversal 3) ainsi quune séquence supplémentaire alliant visualisation du cartilage et suppression de la graisse. Les séquences utilisées sont : GE pondérée en T1 en 3D dans le plan dorsal 1, SE pondérée en T1 dans le plan transversal 2, GE pondérée en T2* en 2D dans le plan transversal 2, TSE dual echo pondérée en T2 et en PD dans le plan sagittal, STIR dans le plan transversal 2, TSE dual echo dans le plan dorsal 3, TSE dual echo dans le plan transversal 3, DESS 3D avec WE dans le plan sagittal. Conclusions et Perspectives: Les Etudes I et II ont permis de démontrer leffet de la conservation des pieds isolés sur la qualité de limage. Les changements de SNR significatifs rencontrés dans les études I et II démontrent que la conservation influence limage IRM et que lors des études ex vivo, les facteurs liés à la conservation et à la température du membre doivent être pris en considération pour interpréter tout résultat. Aussi bien sur les membres réfrigérés que sur ceux congelés, aucun changement de netteté dimages na été observé dans ce travail, si ce nest pour la partie dorsale et distale du sabot après congélation-décongélation. Etant donné ces changements, il sera conseillé dans le futur de réaliser les études concernant le sabot sur pieds frais ou réfrigérés. La réfrigération est une méthode simple de conservation ne nécessitant aucune planification de lexamen. Ceci est particulièrement attrayant car de nombreux examens à des fins expérimentales doivent être insérés entre les patients cliniques, voire reportés en fin de journée. De plus, si le flux de patients de la journée est plus élevé que prévu, lexamen de ces extrémités digitées peut être reporté au lendemain. La congélation du membre quant à elle nécessite une planification car une décongélation préalable est indispensable. En effet, les protons des structures gelées ne sont pas mobiles et nengendrent donc pas ou peu de signal (Widmer, et al., 1999). Une légère diminution de la taille des récessus synoviaux a été observée subjectivement après réfrigération mais pas après congélation-décongélation. Ceci peut être dû à lutilisation de gants pour recouvrir les pieds dans la seconde étude, or ceci navait pas été utilisé lors de la première étude. En effet, il a été démontré que la perte de poids de la viande par déshydratation à température basse lors du stockage est inférieur lorsque la viande est emballée (Bustabad, 1999). Aucun changement de signal na été noté subjectivement lors de réfrigération et ceci jusquà 14 jours, si ce nest pour la moelle osseuse. Lanalyse quantitative a démontré un changement significatif du SNR dans la moelle osseuse des membres réfrigérés lorsquils sont comparés à T0 en séquences STIR et TSE pondérée en T2 et le réchauffement à température ambiante a produit leffet inverse sur le SNR comparé à la réfrigération. Il faudra donc tenir compte des changements dus à la température du membre et si nécessaire ramener le spécimen à température ambiante si une étude ex vivo est entreprise sur des pieds réfrigérés. Le changement de signal en STIR avec la température démontré dans létude I ne semble pas avoir été décrit précédemment. Le TI optimal peut varier entre individus et entre différentes parties du corps (Shuman, et al., 1989 ; Shuman, et al., 1991). Comme le T1 de la moelle osseuse diminue légèrement à modérément avec une diminution de la température (Petrén-Mallmin, et al., 1993), une suppression incomplète de la graisse en STIR sur des membres réfrigérés a eu lieu suite au changement de température. De ce fait, une suppression incomplète du signal de la graisse doit être attendue dans les examens post-mortem sur pieds réfrigérés. Une technique a été décrite pour obtenir le TI optimal (Shuman, et al., 1991). Il peut donc être intéressant de faire varier le TI sur des membres réfrigérés afin dobtenir une suppression complète du signal de la graisse et ainsi améliorer la détection de lésion discrète. Après 14 jours de réfrigération, une diminution du SNR à été observée dans la moelle osseuse avec les séquences TSE pondérée en T2 et DESS. Il est donc préférable de garder des pieds isolés dans un frigo au maximum pendant 7 jours afin déviter cette chute du SNR due à la dégradation des tissus, même si la qualité de limage ne semble pas changé après 14 jours de réfrigération. Une congélation-décongélation sera préférée si une conservation des membres supérieure à 7 jours est nécessaire. Une décongélation à température ambiante semble aussi préférable car elle crée moins de changement de signal. Les résultats obtenus dans ce travail, en ce qui concerne le changement de signal en fonction de la conservation, sont très intéressants et il y a très peu de travaux publiés à ce sujet. Cependant, ces résultats entrainent de nombreuses autres questions. Ainsi, létablissement dune courbe en fonction de la température interne des tissus semble intéressant afin de mieux cerner à partir de quelle température les changements sopèrent. De plus, les résultats de cette étude pourraient également servir à lévaluation dexamen in vivo notamment pour les examens réalisés lors de température extérieure ou corporelle anormalement élevée ou basse qui pourrait avoir une influence sur le signal obtenu pour les différentes structures tel le phénomène de « cold-limb syndrome » retrouvé en scintigraphie (Dyson, 2007). Une évaluation du changement de signal du liquide synovial en fonction de la température et en fonction du temps semble également intéressante car celui-ci montre un comportement différent par rapport aux autres tissus. Comme les pieds examinés dans cette étude ne lont été que dans les 12h après la mort des animaux, une étude comparant le signal des différentes structures in vivo à ces mêmes structures ex vivo juste après la mort permettrait une évaluation des changements précoces obtenus après la mort. De même, il semble intéressant dévaluer ces méthodes de conservation sur des pieds pathologiques afin de voir si ce type de conservation ninfluence pas la qualité du diagnostic. En médecine humaine et vétérinaire, la préservation du sperme des ovocytes et dautres tissus reporte différents résultats en fonction de la température de congélation ainsi que de la vitesse de celle-ci et de la température de décongélation (Cui, et al., 2007 ; Luciano, et al., 2009). Une étude faisant varier ces paramètres permettrait lobtention de protocoles idéaux pour la préservation des pieds entre les examens. De même, une étude histologique lors de ces différents protocoles permettrait létablissement de protocole plus adapté à un examen histopathologique permettant une meilleure compréhension de la physiopathologie des lésions affectant le pied. LEtude III a démontré leffet de lintensité du champ magnétique (0.27T, 1.5T, 3T) sur la qualité des images de pieds normaux. Les images obtenues dans chaque système étaient de valeur diagnostique à lexception des images de la boite cornée où des artéfacts considérables ont été observés avec le système LF. Ces artéfacts sont dus aux inhomogénéités de champ et à des artéfacts métalliques. Ces artéfacts étaient plus important en GE pondérée en T2* car cette séquence est plus sensible aux inhomogénéités de champ (Kastler, 2003). Si une lésion est suspectée dans une région périphérique du pied, il est donc conseillé de placer cette région au centre de laimant dans le système LF pour chevaux debout. Ceci permettra davoir la région à investiguer dans la zone la plus homogène du champ magnétique et de réduire les artéfacts. Létude III confirme que dans les séquences SE, moins dartéfacts sont visibles dans le sabot. Une séquence SE est donc conseillée dans le système LF pour chevaux debout si une lésion périphérique du pied est suspectée. Avec les paramètres que nous avons utilisés pour lEtude III, la qualité subjective de limage et la visualisation des structures anatomiques du pied sain étaient meilleures sur les images obtenues avec les systèmes HF. Le système 3T offre la meilleure visualisation des structures anatomiques communément impliquées dans les boiteries du pied chez le cheval lorsque celle-ci est comparée aux systèmes 1.5T et 0.27T pour chevaux debout. Ce système 3T pourrait donc se révéler supérieur pour la détection de lésions plus discrètes telles des lésions cartilagineuses de bas grade, les lésions plus précoces ou la détection de lésion atteignant des structures anatomiques de petite taille telle le ligament annulaire digital distal, le ligament sésamoïdien distal impair. Les résultats obtenus lors de létude III sont en faveur des systèmes HF. Toutefois, en médecine humaine, même si les images avec les systèmes HF sont de meilleures qualités, plusieurs études montrent une efficacité diagnostique semblable avec un système LF (Barnett, 1993 ; Taouli, et al., 2004). Or, en médecine vétérinaire, le système LF pour chevaux debout prend une place de plus en plus importante aussi bien dans le diagnostic, le pronostic, le choix du traitement et le suivi des boiteries chez le cheval (Mair, et al., 2005). Ceci est dû au fait que de plus en plus de propriétaires acceptent de réaliser lexamen car aucune anesthésie du cheval nest nécessaire. De plus, en présence dun cheval de haute valeur, le choix dun traitement optimal est important pour le retour à une carrière équivalente. Cest pourquoi, il est particulièrement important dévaluer la qualité diagnostique de ce système LF, notamment en le comparant au système HF et ceci avec les mêmes pieds pathologiques. La plupart des pieds pathologiques ont souvent une combinaison de lésions atteignant plusieurs structures anatomiques sur un même pied (Busoni, et al., 2005 ; Murray, et al., 2006 ; Dyson et Murray, 2007a). Cest pourquoi le choix dun protocole permettant la visualisation de la plupart des structures anatomiques du pied est important. Loptimisation de quelques protocoles réalisée dans létude IV répond à un besoin de standardisation et à une recherche de données objectives sur lesquelles baser le choix de plans et séquences. Trois protocoles courts dexamen IRM ont été établis lors de lEtude IV. Les 2 premiers protocoles ont donné une priorité aux structures les plus souvent atteintes lors de douleurs du pied tel los sésamoïde distal et le tendon fléchisseur profond du doigt (Murray, et al., 2006 ; Dyson et Murray, 2007a), tout en permettant une évaluation des autres structures. Lutilisation dun plan de coupe transversal perpendiculaire au cortex palmaire de los sésamoïde distal sera préférée à un plan perpendiculaire à laxe digité. En effet, en utilisant ce plan, une plus grande partie du cartilage entre los sésamoïde distal et la phalange moyenne est visualisée. De même, lutilisation dun plan dorsal parallèle à laxe digité sera préférée à un axe parallèle au cortex palmaire de los sésamoïde distal permettant la visualisation dune plus grande partie du cartilage articulaire de AIPD et ceci dans sa partie la plus centrale. Lutilisation de séquence en 3D permet le reformatage des images et ainsi dobtenir des images dans un meilleur axe par rapport aux différentes structures telles les ligaments collatéraux de lAIPD (Dyson, et al., 2008 ; Gutierrez-Nibeyro, et al., 2009). Le troisième protocole permet une meilleure visualisation de structures impliquées moins fréquemment dans les boiteries du pied tel les ligaments collatéraux de lAIPD, le ligament sésamoïdien distal impair et les marges distales de la phalange distale (Murray, et al., 2006 ; Dyson, et al., 2008). Une séquence 3D réalisées dans le plan sagittal sest révélée meilleure pour le reformatage du cartilage entre los sésamoïde distal et la phalange moyenne. Les trois protocoles utilisent des séquences en différentes pondérations et une séquence avec saturation de graisse comme recommander précédemment (Tucker et Sampson, 2007). Le choix des séquences et des plans de coupes semble allier temps dexamen réduit et visualisation correcte de toutes les structures. Dun point de vue pratique, le choix des bonnes séquences et des bons plans permet de réduire le temps danesthésie sur les animaux anesthésié et permet de réduire le risque de mouvement sur chevaux sédatés lors dexamens réalisés sur chevaux debout. Cependant, la comparaison de lefficacité diagnostique entre un protocole court et un protocole long sur des pieds ou des chevaux pathologiques (contenant tous les plans pour chaque séquence) est nécessaire afin de confirmer lefficacité de ceux-ci. Ce travail a permis de démontrer le rôle essentiel joué par la conservation des membres lors des études ex vivo (études I et II) et de part lévaluation des différents systèmes, séquences et plans (études III et IV) permet une analyse critique de la littérature précédente et jette les bases nécessaires à une future standardisation des protocoles dIRM du pied équin. Références: BARNETT M.J. MR diagnosis of internal derangements of the knee: effect of field strength on efficacy. 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Equine coital exanthema (ECE), caused by equid herpesvirus 3 (EHV-3), is a contagious venereal disease characterised by the formation of painful papules, vesicles, pustules and ulcers on the external genitalia of both mares and stallions. EHV-3 is an alphaherpesvirus, distinct from the other equine herpesviruses, endemic in most horse breeding populations worldwide. EHV-3 is primarily transmitted through coitus, although there is also evidence supporting the possibility of non-coital spreading through infected fomites and contacts other than coitus. The infection does not usually result in systemic illness. Epidemiological observations and serological monitoring suggest the existence of latently infected animals from which EHV-3 is periodically reactivated and transmitted to cohorts but latency of EHV-3 has not been formerly demonstrated. The negative impacts of ECE on equine breeding enterprises are the forced, temporary disruption of the mating activities of mares and stallions, the additional care and supportive treatment in affected horses, and the risk of virus spread by either fresh or frozen semen as well as by artificial insemination and embryo transfer practices. In intensively managed stud operations, which have heavily-scheduled breeding dates for thoroughbred stallions, breeding disruptions may translate into significant end-of-season decreases in the number of entries into the mare book of affected stallions. Also, delayed foaling dates and/or reduced pregnancy rates may occur in mares that miss breeding opportunities due to the disease. Similarly, in the face of an ECE outbreak in artificial insemination and embryo transfer centres, both donor and recipient affected mares show such discomfort that they are reluctant to be inspected, inseminated or transferred, with the consequent loss of opportunity to become pregnant. The additional time and necessary precautions required to manage the donor and receptor mares due to the presence of the disease also have a substantial negative impact. Because ECE is a not a notifiable disease and the diagnosis is made on the basis of typical clinical signs, most cases and outbreaks of ECE remain unnoticed and its true prevalence and economic impact is difficult to assess and is probably underestimated. Therefore, as several aspects of EHV-3 infection are largely unknown and it has severe economic consequences to the horse industry, the general aim of this doctoral study was to increase the knowledge about the biology of EHV-3 infection. The specific objectives were to investigate the iatrogenic transmission of infection and to set up a protocol for experimental reproduction of the disease, to study the reactivation and re-excretion patterns from latency, to evaluate the epidemiological importance of subclinical infections, and to hypothesise about the ECE economic consequences in the current context of the equine industry. During the occurrence of an outbreak of ECE in an embryo transfer centre, approximately 32% (n=35) of the donor mares and 25% (n=125) of the recipient mares showed typical ECE lesions around the anus and on the perineal skin, discomfort, and anorectal lymphadenopathy. EHV-3 was detected in 7 (58%) of the affected mares and specific antibodies in 23 (88%) of the convalescent mares. Since no natural breeding had taken place on the affected mares, it could be hypothesised that the virus spread was a consequence of contamination by means of the gloves or the ultrasonography scanner used. Lymphadenopathy provides a new concern associated with ECE. EHV-3 was isolated from nasal swabs obtained during an outbreak of unilateral rhinitis affecting approximately 40 out of 2000 thoroughbred horses. The fact that an endoscopic examination had been performed in the week previous to the onset of the lesions to evaluate the respiratory tract function was a common finding in all the horses affected. EHV-3 was demonstrated as the etiologic agent of the unilateral rhinitis observed in those 40 thoroughbred horses. The endoscope used for respiratory tract examination was identified as the most likely cause of the spread of the infection. This case is an example of non-genital iatrogenic transmission and reinforces the importance of strict application of hygienic measures in order to reduce the risk of spread of infectious diseases. The virus isolated from this field outbreak as well as that isolated from others were characterized by means of restriction endonuclease (RE) fragment patterns, plaque size and gG gene partial nucleotide sequencing. In the 25 isolates included in the study, different RE patterns were found: two with BamHI (one of them identical to the one of the reference strain), two with Hind III (both different from the one of the reference strain) and one with Eco RI (different from the one of the reference strain). The plaque size was homogeneous between the isolates, and 1.64 and 2.88 times larger than that of the reference strain. Three base substitutions in the gG gene were found at positions 904, 1103 and 1264, which resulted in strains CAT (Australia), AAT (the United States and Brazil), CAG (Argentina) and ACT (Argentina). The RE pattern and the nucleotide sequence of the gG gene obtained revealed that there are genetically distinguishable EHV-3 strains in circulation. Not only the RE patterns, as previously described, but also the nucleotide sequence of the gG gene, could be useful tools for epidemiological studies. The biological implications of these changes are still unknown. Two sets of experimental infection with EHV-3 were carried out under controlled conditions. In the first experiment, two seronegative mares were topically inoculated in the vagina and perineal area with EHV-3. The same protocol was followed in the second experiment in two seronegative and two seropositive mares (the mares which had been included in the first experiment were used six months later). Clinical samples consisted of swabs from the vagina and perineal area, and blood samples were obtained for virological, serological and haematological studies. A scoring system was designed and used for daily clinical evaluation and rectal temperature records from each mare. Neither hyperthermia nor haematological changes were recorded in the mares analyzed. Typical ECE lesions were observed in seronegative animals: the clinical score was 172 and 90 (average score: 131) for the mares included in the first experiment and 160 and 92 (average score: 124) for the mares included in the second experiment. Only slight lesions were observed in the seropositive mares, being the clinical score 53 and 41 (average score: 47). Also, differences were detected in the duration and intensity of virus shedding, being 15 and 9 days (duration) and 105 versus 104 (the highest virus load detected) in the seropositive and seronegative mares, respectively. In one study designed to demonstrate EHV-3 latency and to study reactivation and re-excretion patterns, virus shedding, seroconversion and the presence of a small ECE lesion were observed in one out of two previously naturally infected mares after corticosteroid treatment. EHV-3 was isolated from perineal vaginal swabs of one of the mares, both on day 14 after corticosteroid treatment and along the following 10 days. A small and rounded area of erosion was observed on the left labia of the vulva of the same mare on day 19 after corticosteroid treatment and 5 days after the virus shedding was detected. A significant (four-fold) increase in the antibody titre was found in the mare which shed the virus 28 days after corticosteroid treatment and 14 days after the beginning of virus re-excretion. In concordance with epidemiological observation and serological studies, and in common with other members of the subfamily Alphaherpesvirinae, this study indicates that a state of latency is established after natural infection of EHV-3. A study was carried out to estimate the prevalence of excretion of EHV-3 under field conditions. The virus was detected in perineal-vaginal swabs by real time PCR and specific antibodies were identified by seroneutralization in 14 (6%) and 105 (48%) respectively of 220 thoroughbred mares without clinical signs at the time of breeding. In order to assess the re-excretion patterns of spontaneous reactivation, two seropositive (presumably latently infected) polo mares were kept in isolation for 11 months. Virological investigations on perineal vaginal swabs obtained on a daily basis revealed re-excretion of EHV-3 on two occasions, 3 months apart (each for a 3-day interval) in one of the mares, and on only 1 day in the other mare. Antibodies against EHV-3 were detected with only slight variation during the entire period in both mares. Clear evidence of the existence of EHV-3 shedders in a healthy mare population under both field and isolation conditions is provided. Furthermore, despite the small number of animals included (only two), the study in mares kept in isolation demonstrated that at least two periods of EHV-3 spontaneous reactivation and re-excretion in the presence of serum antibodies were possible in the same animal in an 11-month interval. In conclusion, EHV-3 infections and ECE are still a threat for the equine industry. In the present study, EHV-3 was found in several field outbreaks of ECE in thoroughbred breeding farms; the disease was reported by the veterinarians as a true sanitary problem and thus demands additional preventive measures. In addition, EHV-3 was detected as a not rare event in clinically healthy mares, which constitutes the most relevant finding from an epidemiological perspective. ECE is also a sanitary problem of concern for embryo transfer and routine veterinary practices. The population of EHV-3 latently infected mares which reach up to 50% at the time of breeding deserves special attention. Reactivation of the latent virus is not preventable and those mares can spontaneously reactivate the virus and become a source of infection for highly valuable horses like « shuttle stallions », with the consequent economically negative impact on the equine enterprises. Finally, there is an important need for finding out additional preventive measures including « pen side » diagnostic tools that allow the detection of subclinically EHV-3 shedding mares in order to segregate them from natural breeding and give them an appropriate antiviral treatment before being covered by stallions.

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Introduction: Obesity and its related comorbidities such as insulin dysregulation (ID), laminitis and hperlipaemia are increasing health issues in equines. In human medicine obesity is linked with a systemic inflammation deriving from adipose tissue (AT). Especially abdominal AT produces inflammatory cytokines and is therefore a risk factor for metabolic diseases in humans. However, in equines systemic inflammation linked to obesity is still controversial. Changes in lipid metabolism with increasing obesity are not well documented in equines. Aim of the study: The aim of the present study was to evaluate the following hypotheses: (1) ID develops with the long-term intake of a hypercaloric diet and alters lipid metabolism. (2) In the development of obesity macrophages are infiltrating AT and amounts of inflammatory cytokines in AT increase. These alterations are more pronounced in the subcutaneous (sc) AT depots compared to abdominal AT depots. Additionally, the amount of markers of lipid transport are influenced by BW gain in AT. (3) Ponies are more prone to produce inflammatory markers in AT, which may explain the higher predisposition for metabolic alterations. Materials and Methods: 19 healthy and normal weight geldings were included in this study (age at the start of the study: 8 ± 3 years): 10 Shetland ponies and 9 Warmblood horses. Over a period of two years equines received 200% of their maintenance energy requirements of metabolizable energy. 60% of the energy was provided by hay and 40% by a compound feed. Monthly energy requirements were calculated according to the increasing BW and rations were adjusted accordingly. During hypercaloric diet body weight (BW), body condition score (BCS) and cresty neck score (CNS) were assessed weekly. Before and after one and two year(s) of hypercaloric diet a combined glucose insulin test (CGIT) was performed and blood and AT samples (abdominal AT: retroperitoneal, mesocolon descendens; sc AT: nuchal crest, lateral to the tail head) were taken. AT samples were taken under general anesthesia 3-5 days after CGIT and 15 hours after a low-dose endotoxin infusion. Glucose was analysed in natrium fluoride plasma. Serum amyloid A (SAA), insulin, non-esterified fatty acids (NEFA) and triglycerides were measured in serum. Levels of inflammatory parameters (CD68, IL-1β, IL-6, TNFα) and markers of lipid metabolism (FABP4, LPL) were analyzed in AT samples by RT-qPCR. The project was approved by the Ethics Committee for Animal Rights Protection of the Leipzig District Government (No. TVV 32/15). Data were analysed for normal distribution by Shapiro-Wilks test. Statistical tests were applicated accordingly. Results: Ponies and horses showed a significant increase in BW (24%), BCS and CNS with hypercaloric diet. Two years of hypercaloric diet induced ID in 3 out of 19 equines (two horses, one pony). Two of these equines additionally developed laminitis (one horse, one pony) during the second year of hypercaloric diet. Basal serum NEFA concentrations increased in ponies by 290% but not in horses with BW gain. Laminitic equines showed an altered development of serum NEFA levels during CGIT with a delayed rise at the end of CGIT. The BW gain had no impact on SAA concentration of ponies and horses. CD68 mRNA levels increased in several AT depots of both breed types with BW gain. IL-1β, IL-6 and TNFα showed similar or decreased mRNA levels after BW gain compared to basal measurements in all AT. CD68 mRNA level were higher in abdominal AT compared to sc AT at the end of the study. However, IL-1β, IL-6 and TNFα mRNA levels were higher in sc AT. LPL and FABP4 mRNA levels were higher or similar after BW gain. Higher levels of LPL and FABP4 mRNA were detected in sc AT depots compared to abdominal AT. Breed related differences were seen but were not consistent. Conclusions: A BW gain of 24% over two years does not necessarily lead to ID in horses or ponies. However, laminitis might be correlated with changes of NEFA curve during a CGIT. Equine obesity is linked with macrophage infiltration of AT that is more pronounced in abdominal AT depots in equines. However, infiltrating macrophages are not linked with a systemic inflammation.:1 Introduction 1 2 Literature review 3 2.1 Obesity in equines 3 2.1.1 Objective measurements of obesity 3 2.1.1.1 Body condition score 3 2.1.1.2 Cresty neck score 4 2.1.1.3 Morphometric measurements 4 2.2 Insulin dysregulation 4 2.2.1 Laboratory diagnosis 5 2.2.1.1 Basal measurements 6 2.2.1.2 Dynamic testing 7 2.2.1.2.1 Oral tests..................................................................................7 2.2.1.2.2 Intravenous tests......................................................................7 2.3 Obesity related inflammation 9 2.3.1 Interleukin-1β 9 2.3.2 Interleukin-6 10 2.3.3 Tumor necrosis factor α 11 2.4 White adipose tissue 13 2.4.1 Structure and Cell types 13 2.4.2 Adipokines 13 2.4.3 Changes with obesity 13 2.4.4 Depot differences 14 2.5 Lipid metabolism 14 2.5.1 Non-esterified fatty acids 15 2.5.2 Triglycerides 16 2.5.3 Lipoprotein lipase 16 2.5.4 Fatty acid binding protein 4 16 3 Published articles 17 3.1 Effects of body weight gain on insulin and lipid metabolism in equines 17 3.2 The influence of equine body weight gain on inflammatory cytokine expressions of adipose tissue in response to endotoxin challenge 27 4 Discussion 45 4.1 Insulin and glucose metabolism 45 4.2 Lipid metabolism 45 4.2.1 Serum NEFA and TG concentrations 45 4.2.2 Adipose tissue mRNA levels of lipid metabolism marker 46 4.3 Adipose tissue inflammation parameters 47 4.3.1 Effect of body weight gain 47 4.3.2 Adipose tissue depot effect 48 4.3.3 Breed effect in obese equines 48 4.4 Laminitic equines 49 4.5 Conclusion 50 5 Zusammenfassung 51 6 Summary 53 7 References 55 8 Appendix 65 8.1 Presentations as part of this thesis 65 8.2 Co-authorship 66 8.3 Original data 67 / Einleitung: Zunehmend leiden Pferde an Adipositas und deren Folgeerkrankungen wie Insulindysregulation (ID), Hufrehe, aber auch Hyperlipidämien. Bei adipösen Menschen wird ein chronischer Entzündungszustand beobachtet, wobei Entzündungsparameter hauptsächlich im Fettgewebe (FG) produziert werden. Durch die erhöhte Produktion von Entzündungs-parametern im abdominalen FG ist besonders dieses Fettdepot mit einem erhöhten Risiko für metabolische Krankheiten verbunden. Der Zusammenhang von Adipositas und einem systemischen Entzündungszustand wird bei Pferden aktuell noch kontrovers diskutiert. Studien zu den Veränderungen des Lipidmetabolismus im Verlaufe einer zunehmenden Gewichtszunahme liegen bislang bei Equiden nicht vor. Ziel der Studie: Die Studie diente dazu folgende Hypothesen zu untersuchen: (1) ID entwickelt sich mit der Langzeitfütterung einer hyperkalorischen Ration und beeinflusst den Lipidmetabolismus. (2) Durch die Gewichtszunahme kommt es zu einer Infiltration von Makrophagen und zu einem Anstieg von Entzündungsparametern im FG. Marker für den Lipidtransport im FG werden durch eine Körpergewichtszunahme beeinflusst. (3) Ponys produzieren mehr Entzündungs-parameter im FG und zeigen einen veränderten Lipidmetabolismus im Vergleich zu Pferden. Material und Methoden:19 gesunde, normalgewichtige Wallache (Alter zu Beginn der Studie: 8 ± 3 Jahre) wurden für diese Studie genutzt: 10 Shetlandponys und 9 Warmblutpferde. Diese Tiere erhielten über 2 Jahre 200% ihres Erhaltungsbedarfs an umsetzbarer Energie. 60% der Energie wurden durch Heu und 40% durch ein Ergänzungsfutter gedeckt. Monatlich wurde der Energiebedarf an das aktuelle Körpergewicht angepasst. Wöchentlich wurde das Körper-gewicht, der Body Condition Score (BCS) und der Cresty Neck Score (CNS) erfasst. Zu Beginn der Studie, nach einem und nach zwei Jahren der hyperkalorischen Fütterung wurde ein kombinierter Glukose-Insulin-Test (CGIT) sowie Blut- und FG-proben (abdominales FG: retroperitoneal, Mesocolon descendens; subkutanes FG: Nackenkamm und lateral der Schweifrübe) entnommen. Die FG-Probennahme erfolgte unter Allgemeinanästhesie 3-5 Tage nach dem CGIT und 15 Stunden nach einer moderat dosierten Endotoxininfusion. In den Blut-proben vom CGIT wurde Glukose im Natrium-Fluorid Plasma gemessen. Im Serum wurde Amyloid A (SAA), Insulin, freie Fettsäuren and Triglyceride analysiert. Im FG wurden die Level von Entzündungsparametern (CD68, IL-1β, IL-6, TNFα) und Lipidstoffwechselmarker (FABP4, LPL) mittels RT-qPCR analysiert. Der Tierversuch wurde genehmigt durch die Landesdirektion mit Sitz in Leipzig (TVV 32/15). Die Daten wuden mittels des Shapiro-Wilks Tests auf Normalverteilung getestet und die entsprechenden Tests wurden angewandt. Ergebnisse: Durch die hyperkalorische Ration haben Ponys und Pferde 24% ihres Körper-gewichts zugnommen. BCS und CNS sind währen der Studie angestiegen. Die Gewichts-zunahme hat in 3 von 19 Tieren eine ID ausgelöst (zwei Pferde, ein Pony). Zwei dieser Tiere (ein Pferd, ein Pony) entwickelten zusätzlich eine Hufrehe im zweiten Jahr der Studie. Basale freie Fettsäuren sind mit der Körpergewichtszunahme bei den Ponys angestiegen (290%), während sie bei den Pferden unverändert geblieben sind. Die freie Fettsäuren Kurve währen des CGITs war bei den Tieren mit Hufrehe durch einen verzögerten Anstieg am Ende des Tests im Vergleich zu den gesunden Tieren gekennzeichnet. Die SAA Konzentration blieben durch die Körper-gewichtszunahme unverändert. Bei beiden Rassen kam es mit der Körper-gewichtszunahme zu einem Anstieg des CD68 mRNA Levels in verschiedenen FG Depots. IL-1β, IL-6 und TNFα zeigten nach der Körpergewichtszunahme niedrigere oder unveränderte mRNA Level im Vergleich zu Basalwerten. Im Depotvergleich nach zweijähriger Körper-gewichtszunahme zeigte CD68 höhere mRNA Level in den abdominalen FG Depots ver-glichen mit beiden subkutanen FG Depots. IL-1β, IL-6 und TNFα hingegen wiesen zu diesem Zeitpunkt höhere mRNA-Expressionen in den subkutanen FG Depots auf. LPL und FABP4 mRNA Level stiegen an oder blieben unverändert im im Verlauf der Studie. Am Ende der Studie waren die mRNA Level von LPL und FABP4 in subkutanen FG Depots höher ver-glichen mit den abdominalen FG Depots. Eindeutige Rasseunterschiede konnten nicht charakterisiert werden. Schlussfolgerungen: Eine Gewichtszunahme von 24% der Körpermasse führte nicht bei allen Tieren zu einer ID. Jedoch erscheint das Auftreten einer Hufrehe von Veränderungen der freien Fettsäuren während des CGITs begleitet zu sein. Die Entwicklung der Adipositas war mit einer Makrophageninfiltration in das abdominale FG verbunden, allerdings war die Makrophageninfiltration nicht mit einem systemischen Entzündungsstatus assoziiert.:1 Introduction 1 2 Literature review 3 2.1 Obesity in equines 3 2.1.1 Objective measurements of obesity 3 2.1.1.1 Body condition score 3 2.1.1.2 Cresty neck score 4 2.1.1.3 Morphometric measurements 4 2.2 Insulin dysregulation 4 2.2.1 Laboratory diagnosis 5 2.2.1.1 Basal measurements 6 2.2.1.2 Dynamic testing 7 2.2.1.2.1 Oral tests..................................................................................7 2.2.1.2.2 Intravenous tests......................................................................7 2.3 Obesity related inflammation 9 2.3.1 Interleukin-1β 9 2.3.2 Interleukin-6 10 2.3.3 Tumor necrosis factor α 11 2.4 White adipose tissue 13 2.4.1 Structure and Cell types 13 2.4.2 Adipokines 13 2.4.3 Changes with obesity 13 2.4.4 Depot differences 14 2.5 Lipid metabolism 14 2.5.1 Non-esterified fatty acids 15 2.5.2 Triglycerides 16 2.5.3 Lipoprotein lipase 16 2.5.4 Fatty acid binding protein 4 16 3 Published articles 17 3.1 Effects of body weight gain on insulin and lipid metabolism in equines 17 3.2 The influence of equine body weight gain on inflammatory cytokine expressions of adipose tissue in response to endotoxin challenge 27 4 Discussion 45 4.1 Insulin and glucose metabolism 45 4.2 Lipid metabolism 45 4.2.1 Serum NEFA and TG concentrations 45 4.2.2 Adipose tissue mRNA levels of lipid metabolism marker 46 4.3 Adipose tissue inflammation parameters 47 4.3.1 Effect of body weight gain 47 4.3.2 Adipose tissue depot effect 48 4.3.3 Breed effect in obese equines 48 4.4 Laminitic equines 49 4.5 Conclusion 50 5 Zusammenfassung 51 6 Summary 53 7 References 55 8 Appendix 65 8.1 Presentations as part of this thesis 65 8.2 Co-authorship 66 8.3 Original data 67