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Análise epidemiológica de cepas APEC e análise do regulador FNR na modulação da virulência de ExPECBarbieri, Nicolle Lima January 2014 (has links)
Escherichia coli é um bacilo Gram-negativo, anaeróbico facultativo e de distribuição cosmopolita. E. coli coloniza o intestino de humanos e outros animais endotérmicos logo após o nascimento, estabelecendo-se como um importante membro da microbiota intestinal. Algumas cepas de E. coli podem adquirir fatores de virulência, assumindo assim, uma natureza patogênica, como é o caso das E. coli patogênicas extraintestinais (ExPEC). As cepas ExPEC apresentam a capacidade de colonizar e se disseminar em diversos nichos no hospedeiro, e são divididas em UPEC (E. coli uropatogênica), NMEC (E. coli causadora de meningite neonatal) e APEC (E. coli patogênica para aves). UPEC, NMEC e APEC compartilham fatores associados à virulência. Para serem aptas a causar doença, cepas ExPEC devem apresentar pelo menos um fator associado à adesão, um fator para captação de ferro (sideróforo) e um fator de resistência ao soro, podendo, também, apresentar genes que codificam toxinas e invasinas. Embora sejam conhecidos muitos fatores de virulência associados à patogenicidade de cepas ExPEC, a regulação da expressão de tais fatores ainda não foi elucidada. Fumarato-nitrato-redutase (FNR) é uma proteína que atua como regulador global, agindo como um sensor da presença de oxigênio em bactérias gramnegativas. Já foi demonstrado que FNR está relacionada à regulação da virulência de bactérias patogênicas como Shigella flexneri e Salmonella enterica serovar Typhimurium. Este trabalho teve como objetivo a análise epidemiológica e caracterização de cepas APEC, bem como a investigação do controle da expressão de fatores associados à virulência de ExPEC pelo regulador global FNR. Os resultados da análise epidemiológica das cepas APEC mostram o perfil de resistência aos agentes antimicrobianos, a prevalência dos fatores de virulência e dos grupos filogenéticos (de acordo com a classificação EcoR) e a relação filogenética dos isolados, fornecendo um panorama da caracterização de E. coli patogênicas aviárias de lesões severas de celulite e de infecção sistêmica oriundas da região sul do Brasil. Em relação ao FNR, este estudo mostrou a influência deste regulador sobre importantes fatores associados à virulência, estando envolvido no controle de várias etapas do estabelecimento da infecção por cepas ExPEC. A deleção de fnr na cepa UPEC CFT 073 reduziu a motilidade, a expressão das fimbrias tipo I e tipo P, reduziu a expressão da hemolisina e controlou a expressão da ilha de patogenicidade do α- cetoglutarato. Além disso, a deleção de fnr fez tornou as bactérias incapazes de invadir células dos rins e da bexiga e de causar doença in vivo em camundongos de 6 semanas. FNR também foi capaz de controlar as etapas da infecção por NMEC 56. Uma vez deletado, as bactérias perderam a capacidade de causar bacteremia, de crescer no fluido cerebrospinal e de causar doença in vivo em ratos de 5 dias de idade. A deleção de fnr em APEC O1 resultou na diminuição da expressão da proteína OmpT plasmidial, da fímbria do tipo I e do auto-transportador AatA. A principal contribuição deste trabalho foi demonstrar que FNR atua na regulação da expressão de importantes fatores associados à virulência de cepas ExPEC (UPEC, NMEC e APEC), sendo importante para o estabelecimento da infecção por essas cepas. Neste trabalho, verificamos que, além da função já conhecida de regular os genes envolvidos na manutenção de um meio anaeróbico, FNR também atua no controle de genes associados à virulência de cepas ExPEC, refletindo na capacidade de causar doença que tais cepas apresentam. / Escherichia coli is a Gram-negative bacillus, facultative anaerobic and has cosmopolitan distribution. E. coli colonizes the intestine of humans and other endothermic animals immediately after birth, establishing as an important member of the intestinal microbiota. Some strains of E. coli can acquire virulence factors thereby assuming a pathogenic nature, as in the case of extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC). ExPEC strains have the ability to colonize and spread out in different niches of the host, and are divided into UPEC (uropathogenic E. coli), NMEC (newborn meningitis E. coli) and APEC (avian pathogenic E. coli). UPEC, NMEC and APEC share virulence factors. To be able to cause disease, ExPEC strains must produce virulence factors required for adherence, for iron uptake (siderophore) and for resistance to serum and may also contain genes encoding toxins and invasins. Although many virulence factors associated with the pathogenicity of ExPEC strains are known, the regulation of the expression of these factors has not yet been fully elucidated. Fumarate nitrate reductase (FNR) is a global regulatory protein, acting as a sensor of oxygen in Gram- negative bacteria. It has been shown that FNR relates virulence of pathogenic bacteria such as Shigella flexneri and Salmonella enterica serovar Typhimurium. The aim of this study was to do an epidemiological analysis and characterization of APEC strains as well as the investigation of regulation of ExPEC’s virulence factors by the global FNR regulator. The results of epidemiological analysis of APEC strains showed the profile of antimicrobial resistance , the prevalence of virulence factors and phylogenetic groups (according to the EcoR group) and the phylogenetic relationship of the isolates, providing an overview of the characterization of avian pathogenic E. coli causing severe cellulitis lesions and systemic infection originating from southern Brazil. In relation to FNR, this study showed the influence of this important regulator of virulence factors that is involved in controlling various stages of establishment of infection by ExPEC strains. Deletion of fnr in UPEC strain CFT 073 reduced motility and expression of type I and type P fimbriae, reduced the expression of hemolysin and control the expression of the pathogenicity island of α -ketoglutarate. Furthermore, fnr mutant strains were unable to invade cells of kidney and bladder, and to colonize the urinary tract of 6 weeks-old mice. FNR was also able to control the stages of infection of NMEC 56. The fnr mutant lost its ability to cause bacteremia, grow in cerebrospinal fluid, cause disease in 5 days old rats. Deletion of fnr in APEC O1 resulted in decreased expression of genes corresponding to the plasmid encoded OmpT protein, type I fimbriae and autotransporter AatA. The main contribution of this work was to demonstrate that FNR regulates expression of important virulence factors of ExPEC strains (UPEC, NMEC and APEC), which is important for the establishment of infection by these strains. In this work, we found that, besides the already known function in regulating genes involved in maintaining an anaerobic environment, FNR also acts in the control of virulenceassociated genes of ExPEC strains, reflecting the ability of these strains to cause disease.
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Escherichia coli Vacuolating Factor (ECVF) como fator associado a celulite aviária. / Escherichia coli Vacoulating Factor (ECVF) as a factor associated to avian cellulitis.Natália Galdi Quel 05 February 2014 (has links)
E. coli isoladas de lesões de celulite aviária em frangos de corte produzem uma citotoxina, denominada ECVF (E. coli Vacuolating Factor), que causa intensa vacuolização citoplasmática em células aviárias, mas não em células mamárias. A importância de ECVF na patogenia da celulite foi avaliada neste estudo. ECVF purificado foi inoculado subcutaneamente em frangos de corte, e induziu sinais de inflamação nos tecidos subcutâneo, adiposo e conjuntivo. Em ensaios de citotoxicidade, foi verificado que ECVF induz alterações citoplasmáticas e nucleares que podem afetar diretamente o metabolismo celular, entre elas condensação da cromatina e fragmentação nuclear, intensa vacuolização citoplasmática e desorganização do citoesqueleto, conduzindo à apoptose. Também foi verificada interação de ECVF com proteínas de células aviárias, em detrimento das de células de mamíferos, sugerindo uma especificidade da toxina a este tipo celular. Nossos resultados, apoiados por dados de estudos anteriores, permitem sugerir um importante papel de ECVF na patogenia da celulite aviária. / E. coli isolated from cellulitis lesions in broiler chickens produce a citotoxin, called ECVF (Escherichia coli Vacuolating Factor), which causes intense cytoplasm vacuolization in avian cells, but not in mammalian cells. The importance of ECVF in the pathogenesis of avian cellulitis was assessed in this study. Purified ECVF was inoculated subcutaneously in broiler chickens, and induced signs of inflammation on subcutaneous, adipose and connective tissues. In citotoxicity assays, we verified that ECVF induced cytoplasmic and nuclear alterations, which can affect cellular metabolism directly, such as chromatin condensation and nuclear fragmentation, intense cytoplasm vacuolization, and disorganization of cytoskeleton, leading to apoptosis. It was also verified the interaction of ECVF with proteins of avian cells, instead of those from mammalian cells, suggesting the specificity of this toxin to this cells. Our results, supported by data from previous studies, suggest an important role of ECVF in the pathogenesis of avian cellulitis.
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