Submitted by Alison Vanceto (alison-vanceto@hotmail.com) on 2017-05-02T12:12:25Z No. of bitstreams: 1 DissNLG.pdf: 8153268 bytes, checksum: d6e08bab696e4cda4275474ec2fa4b5a (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-05-04T12:25:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissNLG.pdf: 8153268 bytes, checksum: d6e08bab696e4cda4275474ec2fa4b5a (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-05-04T12:25:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissNLG.pdf: 8153268 bytes, checksum: d6e08bab696e4cda4275474ec2fa4b5a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-04T12:40:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissNLG.pdf: 8153268 bytes, checksum: d6e08bab696e4cda4275474ec2fa4b5a (MD5) Previous issue date: 2016-06-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Aspergillus fumigatus is an opportunistic pathogenic filamentous fungus, and the causative agent of aspergillosis, including the invasive pulmonary aspergillosis in immunocompromised individuals, most lethal form of the disease. As in all eukaryotes, the plasma membrane of A. fumigatus is composed of sterols, glycolipids and sphingolipids. The sphingolipids molecules are structural elements that participate in the regulation of the actin cytoskeleton endocytosis, and cell growth. In Saccharomyces cerevisiae, the sphingolipid synthesis is regulated by proteins such as the "AGC kinases" known as Ypk1p and Ypk2p that inactivate Orm1p and Orm2p, which are inhibitory proteins of the serine palmitoyltransferase (SPT) enzyme, the first enzyme that participates in biosynthetic pathway of sphingolipids. Thus, Ypk1/2p are responsible for stimulating the production of sphingolipids in response to several cellular stress factors, such as cell wall stress and heat stress. Here, we aimed to expand the study of sphingolipid biosynthesis in A. fumigatus by functional characterization of the ypkAYPK1 gene by establishing its role in the regulation of sphingolipid synthesis and in the maintenance of cell integrity. To accomplish this goal, one null mutant strain ΔypkAypk1 and a conditional mutant strain niiA::ypkA of A. fumigatus were obtained. The mutant strains were characterized by phenotypic tests aimed at understanding the role of this gene in sphingolipid synthesis, virulence and pathogenicity of this fungus. Subsequently real time RT-PCR experiments were performed to quantify the expression of this gene in conditions of heat stress. The results indicated that deletion of the gene ypkA promotes changes in the development of the fungus, which presents severe defects in the vegetative growth and absence of conidia. In addition, the conditional mutant shows increased sensitivity to lipid synthesis inhibitory drugs. The results also indicate that there is no interaction between genetic ypkA and pathway genes of the cell wall. Thus, we propose that protein kinase YpkA in A. fumigatus is related to vegetative growth and participates in the sphingolipid biosynthesis in A. fumigatus, contributing to the development and integrity of the fungal cell. / Aspergillus fumigatus é um fungo filamentoso patogênico oportunista, e o agente etiológico da aspergilose, que em imunocomprometidos pode vir a ocasionar a forma mais letal da doença, a aspergilose pulmonar invasiva. Como em todos os eucariotos, a membrana plasmática de A. fumigatus é composta por esteróis, glicolipídios e esfingolipídios. As moléculas de esfingolipídios são elementos estruturais que participam da regulação da endocitose, do citoesqueleto de actina e do crescimento celular. Em Saccharomyces cerevisiae, a síntese de esfingolipídios é regulada pelas proteínas do tipo “AGC quinases” conhecidas como Ypk1p e Ypk2p, que inativam Orm1p e Orm2p, as quais são proteínas inibidoras da enzima serina palmitoil-transferase (SPT), a primeira enzima que participa da via de biossíntese dos esfingolipídios. Dessa forma Ypk1/2p são responsáveis por estimular a produção de esfingolipídios na membrana plasmática em resposta a diversos fatores de estresse celular, como por exemplo o estresse de parede celular, estresse térmico entre outros. Diante disso, este trabalho teve como objetivo ampliar o estudo da biossíntese de esfingolipídios em A. fumigatus através da caracterização funcional do gene ypkAYPK1, de forma a estabelecer sua função na regulação da síntese de esfingolipídios e na manutenção da integridade celular. Para cumprir esse objetivo, uma linhagem mutante nulo ΔypkAypk1 e uma linhagem mutante condicional niiA::ypkA em A. fumigatus foram obtidas. As linhagens mutantes foram caracterizadas através de ensaios fenotípicos visando a compreensão do papel desse gene na síntese de esfingolipídios, na virulência e patogenicidade desse fungo. Posteriormente, foram realizados experimentos de RT-PCR em tempo real para a quantificação da expressão desse gene em condições de estresse térmico. Os resultados indicaram que a deleção do gene ypkA promove alterações no desenvolvimento vegetativo do fungo, o qual cresce na forma de colônias pequenas as quais não formam conídios. Ainda, o mutante condicional, quando reprimido, apresenta sensibilidade a drogas inibidoras da síntese de lipídeos e esfingolipídios. Os resultados indicam também que não há interação genética entre ypkA e os genes da via da integridade da parede celular. Assim, podemos propor que a proteína quinase YpkA de A. fumigatus está relacionada com o crescimento vegetativo e participa da biossíntese de esfingolipídios em A. fumigatus, contribuindo com o desenvolvimento e integridade da célula fúngica.

A leishmaniose é uma doença parasitária de ampla distribuição, para a qual se dispõe de um limitado arsenal terapêutico. Trabalhos recentes mostraram que tamoxifeno é eficaz no tratamento de leishmaniose experimental. Nesse trabalho, avaliamos a terapia combinada de tamoxifeno com os fármacos utilizados atualmente no tratamento desta enfermidade. A interação entre os fármacos mostrou-se aditiva, tanto in vitro como in vivo. Em paralelo, analisamos os efeitos de tamoxifeno na biossíntese de esfingolipídios em Leishmania, sendo identificada a redução da síntese de fosfatidilinositol e inositolfosforil ceramida (IPC) e acúmulo de ceramida acilada. A redução na biossíntese de IPC não pode ser atribuída a redução no transporte de inositol, mas provavelmente está relacionada à inibição da enzima IPC sintase. Estes resultados indicam novas estratégias para superar as deficiências encontradas no tratamento de leishmaniose utilizando tamoxifeno, um fármaco clinicamente bem conhecido que exerce ações em múltiplos alvos em Leishmania. / Leishmaniasis is a parasitic disease with wide distribution and limited treatment. Recent reports demonstrate that tamoxifen is an effective drug for experimental leishmaniasis treatment. In this work, we evaluated the combined therapy of tamoxifen with current drugs used in leishmaniasis chemotherapy. The drug interaction was additive both, in vitro and in vivo. We also evaluated tamoxifen effect on in Leishmania sphingolipids biosynthesis. We found a reduction in phosphatidylinositol and inositol phosphorylceramide (IPC) synthesis and an accumulation of acilceramide. The reduction in IPC biosynthesis could not be assigned to the reduction observed in inositol transport, but probably is related to IPC synthase inhibition. These results show new strategies to circumvent shortcomings of leishmaniasis treatment using tamoxifen, a multitarget drug in Leishmania and widely used in the chemotherapy of breast cancer.

A leishmaniose é uma doença parasitária de ampla distribuição, para a qual se dispõe de um limitado arsenal terapêutico. Trabalhos recentes mostraram que tamoxifeno é eficaz no tratamento de leishmaniose experimental. Nesse trabalho, avaliamos a terapia combinada de tamoxifeno com os fármacos utilizados atualmente no tratamento desta enfermidade. A interação entre os fármacos mostrou-se aditiva, tanto in vitro como in vivo. Em paralelo, analisamos os efeitos de tamoxifeno na biossíntese de esfingolipídios em Leishmania, sendo identificada a redução da síntese de fosfatidilinositol e inositolfosforil ceramida (IPC) e acúmulo de ceramida acilada. A redução na biossíntese de IPC não pode ser atribuída a redução no transporte de inositol, mas provavelmente está relacionada à inibição da enzima IPC sintase. Estes resultados indicam novas estratégias para superar as deficiências encontradas no tratamento de leishmaniose utilizando tamoxifeno, um fármaco clinicamente bem conhecido que exerce ações em múltiplos alvos em Leishmania. / Leishmaniasis is a parasitic disease with wide distribution and limited treatment. Recent reports demonstrate that tamoxifen is an effective drug for experimental leishmaniasis treatment. In this work, we evaluated the combined therapy of tamoxifen with current drugs used in leishmaniasis chemotherapy. The drug interaction was additive both, in vitro and in vivo. We also evaluated tamoxifen effect on in Leishmania sphingolipids biosynthesis. We found a reduction in phosphatidylinositol and inositol phosphorylceramide (IPC) synthesis and an accumulation of acilceramide. The reduction in IPC biosynthesis could not be assigned to the reduction observed in inositol transport, but probably is related to IPC synthase inhibition. These results show new strategies to circumvent shortcomings of leishmaniasis treatment using tamoxifen, a multitarget drug in Leishmania and widely used in the chemotherapy of breast cancer.