Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-11-20T18:45:22Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao-SandraGrossiGava_Final.pdf: 2345943 bytes, checksum: 542baff1ce20827a286564ee6746784b (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-20T18:45:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao-SandraGrossiGava_Final.pdf: 2345943 bytes, checksum: 542baff1ce20827a286564ee6746784b (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou / A identificação e caracterização dos mecanismos e moléculas envolvidos em sinalização celular são essenciais para o entendimento da biologia parasitária do S. mansoni. Proteína quinases desempenham papel chave em vias de sinalização e tem sido propostas como potenciais alvos para o desenvolvimento de novas drogas anti-Schistosoma. Visto que a caracterização funcional em S. mansoni é dificultada por limitações nos métodos de transformação genética deste parasito, o presente estudo propõe o uso de C. elegans como um modelo para a expressão heteróloga de genes de S. mansonique codificam proteínas quinases. Genes que codificam proteína quinases em S. mansoni, homólogos aos identificados em C. elegans, foram selecionados pelo nosso grupo a partir do proteoma do parasito através de uma abordagem filogenômica. Inicialmente, foi selecionada a proteína quinase JNK, que participa da via de sinalização das MAP quinases para a realização das análises experimentais. Em C. elegans, a proteína JNK está relacionada ao aumento de longevidade e da resistência aos estresses térmico e oxidativo. Oligonucleotídeos específicos foram desenhados para amplificar a região promotora do gene em C. elegans bem como as regiões codificantes (CDS) em ambos os organismos. A região promotora foi amplificada a partir do DNA genômico extraído de C. elegans adultos. O RNA total foi extraído de esquistossômulos e C. elegans adultos. As CDS foram amplificadas a partir do cDNA sintetizado e os fragmentos de DNA resultantes foram clonados em E. coliDH5α. As construções obtidas foram digeridas com enzimas de restrição selecionadas de forma a linearizar o vetor contendo a região promotora e recuperar as CDS. Posteriormente, foram realizadas subclonagens através da ligação das CDS de C. elegans e S. mansoni com a construção contendo a região promotora. C. elegans N2 receberam as construções finais através de microinjeção. Foram obtidas três linhagens que expressam Ce_JNK-1, denominadas N2 Ex01[Ce_jnk-1], N2 Ex02[Ce_jnk-1]e N2 Ex03[Ce_jnk-1]e duas linhagens expressando Sm_JNK, denominadas N2 Ex04[Sm_jnk] e N2 Ex05[Sm_jnk]. Os níveis de expressão de Sm_JNK e Ce_JNK-1 nas linhagens transgênicas foram avaliados por RT-PCR quantitativo. Apesar do aumento da expressão de JNK observado nas linhagens transgênicas, não houve aumento na longevidade das mesmas. Embora esta seja a primeira utilização de expressão heteróloga em C. elegans para investigar a função de genes de S. mansoni, esta técnica tem sido utilizada com sucesso para nematóides parasitos e pode tornar-se uma abordagem alternativa para os estudos funcionais em outros parasitos. / The identification and characterization ofmechanisms and molecules involved in cell signaling are essential to the understanding of the S. mansoni parasite’s biology. Protein kinases play key roles in signaling pathways and have been proposed as potential targets for the development of new anti-schistosome drugs. Since functional characterization in S. mansoni is hampered by limitations in methods for genetic transformation in this parasite, the present study proposes to use C. elegans as a model for heterologous expression of S. mansoni genes encoding protein kinases. S. mansoniprotein kinase coding genes orthologous to those identified in C. elegans were selected from the parasite’s proteome by using a phylogenomic approach. Initially, the protein quinase JNK that participates in the MAP kinases signaling pathwaywas selected to perform the experimental analyses. In C. elegans, JNK is related to increased longevity and resistance to oxidative and thermal stress. Specific primers were designed to amplify promoter regions of the JNK gene in C. elegans as well as the protein coding regions (CDS) in both organisms. The promoter region was amplified from the adult nematode’s DNA. Total RNA was extracted from schistosomula and mature C. elegans. CDS were amplified from synthesized cDNA and the resulting DNA fragments were cloned in E. coli DH5α. The construction obtained was digested with restriction enzymes to linearize the vector containing the promoter region and recover the CDS. Subsequently, subcloning was performed by ligation of C. elegansand S. mansoni CDS with the final construct containing the promoter region. C. elegansN2 received the final constructions through microinjections. Weobtained three lineages that expresses Ce_JNK-1, named N2 Ex01[Ce_jnk-1], N2 Ex02[Ce_jnk-1]and N2 Ex03[Ce_jnk-1] and two line ages that express Sm_JNK, named N2 Ex04[Sm_jnk] and N2 Ex05[Sm_jnk]. The expression levels of Ce_JNK-1 and Sm_JNK in transgenic lineages were measured by quantitative RT-PCR. Despite the increased expression of the JNK gene in the transgenic lineages, increased longevity was not observed in these organisms. Although this is the first use of heterologous expression in C. elegans to investigate gene functions in S. mansoni, it has been used successfully for nematode parasites and may become an alternative approach to functional studies in other parasites.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-11-30T12:31:35Z No. of bitstreams: 1 Tese_DIP_WanderdeJesusJeremias.pdf: 10066652 bytes, checksum: ebdb6e40220315595222399b0ea10c0c (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-11-30T12:31:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_DIP_WanderdeJesusJeremias.pdf: 10066652 bytes, checksum: ebdb6e40220315595222399b0ea10c0c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-30T12:31:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_DIP_WanderdeJesusJeremias.pdf: 10066652 bytes, checksum: ebdb6e40220315595222399b0ea10c0c (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Rene Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Dentre as formas evolutivas do Schistosoma mansoni, o esquistossômulo é uma das mais estudadas para desenvolvimento de novos fármacos e sistemas diagnósticos. Embora a transformação in vitro seja vantajosa, é importante discutir as limitações do uso de resultados obtidos a partir de parasitos cultivados in vitro em relação aos obtidos no processo natural de infecção. No presente trabalho, esquistossômulos obtidos in vivo e in vitro foram comparados em relação a capacidade de captar sondas fluorescentes, específicas para estruturas internas celulares ou membranas superficiais do parasito. As sondas empregadas para membranas e estruturas internas mostraram marcação similar entre parasitos obtidos in vitro, por transformação mecânica (Mec) e por penetração em pele (Pel). No entanto, diferenças foram observadas quando estes parasitos foram comparados a outros obtidos in vivo pelo método de Clegg (Clegg et al, 1965), sendo detectado um aumento da permeabilidade de membranas. Os dados sugerem que nos esquistossômulos cultivados in vivo o metabolismo é mais ativo nas células superficiais e que durante sua permanência por até 72 horas na pele há um extenso turnover da superfície do parasito, envolvendo moléculas internas e um aumento da liberação de imunógenos. A aumentada permeabilidade pode permitir ainda a captação de moléculas, capazes de estimular o crescimento do parasito. Além disso, bibliotecas de esquistossômulos Mec cultivados em soro portal (SPO3h e SPO12h) e soro periférico de hamster (SPE3h, SPE12h) foram comparadas utilizando sequenciamento de nova geração (NGS) e análise da expressão de genes específicos. Após o sequenciamento e análise dos genes expressos uma alta similaridade entre as réplicas foi encontrada. Comparando as amostras SPO3h versus SPO12h 58 transcritos se mostraram diferencialmente expressos. De acordo com as anotações de termos de ontologia gênica (GO) os genes diferencialmente expressos após 12 horas de contato com o soro portal de hamster, estão ligados a processos importantes ao desenvolvimento até vermes adultos. Assim, este estudo viabilizou um maior entendimento de mecanismos de controle sobre a internalização de moléculas pelo parasito no estádio larvário intravascular, bem como da regulação de sua expressão de genes quando o mesmo se encontra no sistema porta hepático do hospedeiro, onde as formas adultas são essenciais para desenvolvimento da doença. / Among the different forms of the Schistosoma mansoni, the schistosomulum is widely explored in a broad range of survey, aiming to the development of new drugs and diagnostic methods. In spite of the advantages inherent to in vitro transformation, it is important to discuss the limitations in take the results achieved from parasites cultured in vitro as representative of those obtained from the natural infection. In present work, schistosomula obtained in vivo and in vitro were compared in their ability to capture fluorescent probes for specific internal structures or surface membranes. The probes showed similar staining in parasite obtained by both methods, mechanical transformation (Mec) and by active skin penetration (Pel). However, differences were observed when those parasites were compared to other obtained in vivo, through the Clegg’s method (Clegg et al., 1965). The membrane permeability was shown to be increased. The data suggest that in schistosomula obtained in vivo and kept inside the skin for a period of time up to 72 hours the metabolism is more active in cells of the surface and, further there is a huge turnover in the surface of the parasite, involving internal molecules and increasing in immunogens release. The increased permeability can also allow it to capture molecules, capable of stimulate the parasite growing. Furthermore, replicates of cDNA libraries obtained from mechanical schistosomula cultured in presence of serum from portal blood (SPO3h, SPO12h) and serum from peripheral blood (SPE3h, SPE12h) of hamster were also compared by using next generation sequencing (NGS) and gene expression analysis of specific genes. After sequencing and statistical analysis of gene expression, it was observed a high similarity among the libraries. When comparing the samples from SPO3h versus SPO12h libraries, 58 genes were found differentially expressed. According to the annotation data of the gene ontology (GO), the differentially expressed genes in schistosomula, after 12 hours of the contact with serum from hamster portal blood, are related to processes important to its development to adult worm. Thereby, this work improved the knowledge of mechanisms evolved in internalization of molecules by the parasite of the intravascular stage, as well as highlighted the regulation of the gene expression when it is within portal venous system of the host, where adult forms are essential for the disease development.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2014-01-21T12:33:06Z No. of bitstreams: 1 T_54.pdf: 3536931 bytes, checksum: 59552db3345f3f24dce1136cf6f46d7c (MD5) / Made available in DSpace on 2014-01-21T12:33:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 T_54.pdf: 3536931 bytes, checksum: 59552db3345f3f24dce1136cf6f46d7c (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou / Apesar do grande esforço na tentativa de controlar a esquistossomose, esta doença continua sendo uma das mais prevalentes no mundo. Novas intervenções são uma prioridade importante para a eliminação da esquistossomose, uma vez que o controle da doença tem sido baseado essencialmente na quimioterapia, a qual não previne a reinfecção. O desenvolvimento de uma vacina para a esquistossomose para proteção a longo prazo, bem como de um novo teste de diagnóstico, constituirá um grande avanço para o controle da doença. A compreensão da resposta imunológica associada com os estados de infecção/proteção pode constituir a base da descoberta de novos antígenos biomarcadores para vacina e diagnóstico para a esquistossomose. Recentes avanços na área pós-genômica têm permitido uma busca mais racional por biomarcadores. Inicialmente, eletroforese bidimensional (2-DE) de extrato proteico total de diferentes fases de desenvolvimento do Schistosoma mansoni foi realizada, obtendo-se um perfil de separação de spots proteicos com boa resolução com os extratos de todas as fases, mas com um perfil distinto entre eles. Posteriormente, proteínas do extrato proteico de verme adulto, total e de tegumento, foram separaradas por 2-DE e, então, incubadas com amostras de soro de indivíduos infectados (INF) e não infectados de área endêmica (NE) e de indivíduos não infectados de área não endêmica (NI) para esquistossomose em experimento de Western-blotting bidimensional (2D-WB). No total, 47 proteínas imunogênicas foram identificadas por espectrometria de massas. Embora a maioria dos spots proteicos sejam imunogênicos aos diferentes pools de soro, nove spots proteicos reagiram exclusivamente com o pool de soro INF e um com o pool de soro NE. Algumas glicoproteínas foram identificadas no extrato proteico total de verme adulto de S. mansoni usando o método Periodic Acid-Schiff e lectina-blotting. No entanto, o tratamento com periodato/borohidreto indicou que a porção glicídica não tem influência sobre a reatividade das proteínas aos diferentes pools de soro utilizados nos experimentos de 2D-WB. Western-blotting de duas proteínas recombinantes, selecionadas dos experimentos de 2D-WB, mostrou um perfil de reconhecimento pelos diferentes pools de soro semelhante ao das proteínas nativas. Dentre as proteínas imunogênicas identificadas nos experimentos de 2D-WB, 27 foram expressas in vitro com sucesso, as quais serão utilizadas em experimentos futuros em um microarranjo de proteínas. A associação de eletroforese bidimensional e Western-blotting permitiu a seleção de um painel de antígenos proteicos capazes de distinguir os estados de suscetibilidade e resistência à esquistossomose mansônica. Estes antígenos poderão ser utilizados como biomarcadores no desenvolvimento de uma vacina e/ou de um novo teste diagnóstico para a doença. / Despite intensive efforts towards schistosomiasis control, the disease is still one of the most prevalent in the world. New interventions are a high priority for the elimination of schistosomiasis, since the disease control has been essentially based on the use of chemotherapy, which does not prevent re-infection. The development of a long term protection and an effective diagnostic assay would be a major breakthrough for schistosomiasis control. Understanding which aspects of the immune responses are associated with infection/protection status may constitute the basis for the understanding of a successful vaccine and could also indicate new diagnostic candidates. Progress on post-genomic technologies resulted in the development of rational and global approaches for the discovery of new biomarkers. Initially, two-dimensional electrophoresis (2-DE) of different developmental stages protein extracts of Schistosoma mansoni were conducted. It was obtained a good separation pattern of the spots that was distinguishable in all the stages evaluated. Subsequently, two-dimensional electrophoresed S. mansoni adult worm protein extracts, total and tegumental, were probed with pooled sera of infected (INF), non-infected individuals from endemic area (NE) and non-infected individuals from non-endemic schistosomiasis area (NI) in a two-dimensional Western-blotting experiment (2D-WB). A total of 47 immunoreactive proteins were identified by mass spectrometry. Although most of the protein spots were immunoreactive to all of the serum pools, nine reacted exclu sively with the INF serum pool, and one with the NE serum pool. Glycoproteins were identified in the S. mansoni adult worm total protein extract using Periodic Acid–Schiff base method and lectin-blotting. However, periodate/borohydride treatment indicated that the glycoprotein glycan portion had no influence on the immunoreaction obtained in the 2D-WB experiments using different serum pools. Western-blotting of two 2D-WB selected recombinant proteins showed a similar serum recognition profile of the native protein. A total of 27 immunoreactive proteins identified by 2D-WB approach were successfully in vitro expressed and will be used in future experiments of protein microarray. The association of two-dimensional electrophoresis and Western-blotting assays allowed the selection of a protein antigens panel capable to diagnose the schistosomiasis mansoni susceptibility/resistance status. These antigens may be used as biomarkers for the development of a vaccine and/or a new diagnostic test for the disease