Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-05T10:54:28Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 896783 bytes, checksum: da2d7082fa8f5e79329235b48767490e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-05T10:54:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 896783 bytes, checksum: da2d7082fa8f5e79329235b48767490e (MD5) Previous issue date: 2002-08-05 / O desdobramento no equilíbrio para a β-tripsina, induzido por desnaturação térmica, foi caracterizado termodinamicamente. O desdobramento foi acompanhado através de absorção no ultravioleta (UV) e espectroscopia de dicroísmo circular (DC) no UV próximo e distante. Além disso, experimentos utilizando a técnica de calorimetria diferencial de varredura (DSC) foram realizados. As curvas de transição térmica foram reversíveis mostrando um desdobramento altamente cooperativo, e os dados experimentais foram bem ajustados à um modelo de transição de dois-estados, para o desdobramento dessa proteína. O gráfico da fração desnaturada versus temperatura, calculado a partir das curvas de desnaturação térmica, em diferentes comprimentos de onda, mostra coincidência dessas curvas. Além disso, a razão entre a entalpia de desnaturação calorimétrica e a entalpia de van ́t Hoff, obtidas por DSC, é próxima à unidade, o que suporta o modelo de dois-estados. O espectro de DC da enzima nativa foi registrado na faixa espectral de 184 a 260 nm e utilizado para se estimar as porcentagens dos elementos da estrutura secundária, pelos métodos VARSCL e SELCON. A estimativa da estrutura secundária, em solução, correspondeu aos resultados de difração de raios-X. As mudanças na estrutura da β-tripsina, resultante de desnaturação por calor e por uréia foram monitoradas por meio de espectroscopia de DC no UV próximo e distante. A quantidade dos vários elementos de estrutura secundária foi estimada para essas mudanças espectrais, através dos espectros no UV distante, utilizando o método CCA (“Convex Constraint Algorithm”). De acordo com as estimativas, os estados desdobrados para essa proteína, ou seja, a 70 o C e em uréia 2,6 M, apresentaram quantidades consideráveis de estrutura secundária regular. Os espectros de fluorescência intrínsica dos resíduos de triptofano, registrados em diferentes concentrações de uréia, mostram a presença de um estado intermediário no equilíbrio, que apresenta grande afinidade pela sonda bis-ANS. Além disso, a ausência de contatos terciários e a presença de estrutura secundária para esse estado, verificados por meio de espectros de DC no UV próximo e distante, são consistentes com as características de um molten globule. As mudanças na atividade da β-tripsina foram observadas em concentrações de uréia nas quais não foram visualizadas nenhuma alteração espectroscópica da estrutura terciária da proteína. Os parâmetros cinéticos, k cat e K M , determinados na ausência e na presença de uréia, mostraram que o decréscimo na atividade da enzima, em baixas concentrações de uréia, foi provavelmente devido à formação do complexo EI, formado entre a β-tripsina e a uréia, um inibidor competitivo dessa enzima. / The unfolding equilibrium of β-trypsin induced by thermal denaturation was thermodynamically characterized. Thermal unfolding equilibrium were monitored using UV absorption and both far- and near-UV CD spectroscopy. In addition, experiments using differential scanning calorimetry (DSC), were performed. Thermal transition curves showed to be reversible and cooperative, and the data could be reasonably fitted using a two-state model for the unfolding of this protein. Plots of the fraction denatured, calculated from thermal denaturation curves at different wavelengths, versus temperature were coincident. In addition, the ratio of the enthalpy of denaturation obtained by scanning calorimetry to the van ́t Hoff enthalpy was close to one, which supports the two-state model. The dichroism circular (CD) spectrum of the native protein was taken over the wavelength range of 184- 260 nm, and the amount of various secondary structures were estimated using VARSLC and SELCON methods. The CD estimation of secondary strucutre, showed excellent agreement with X-ray results. The CD spectra of β-trypsin, as a function of temperature and urea, were monitored by far- and near-UV CD, and the relative proportions of secondary structures calculated by CCA method. According to CD estimation, although the secondary structure changed upon denaturation, its denatured state still has considerable amounts of ordered structure. The intrinsic fluorescence emission spectra of β-trypsin, at different urea concentration, showed an intermediate equilibrium state, with great affinity by bis-ANS. Besides, the absence of terciary contacts and the presence of secondary structure for this state, are consistent with the molten globule characteristics. Changes on the activity of β-trypsin were observed at urea concentrations in which terciary structure changes were not detected. Kinetic parameters, k cat and K M , determined in the presence and absence of urea, showed that the decreases in enzyme activity, at low concentrations of urea, were probably due to a development of the enzyme-inhibitor complex between β-trypsin and urea, a competitive inhibitor of this enzyme. / Tese importada do Alexandria

Introdução e objetivos: β-glicosidases da família GH1 das glicosil-hidrolases possuem um dobramento do tipo barril (β/α)8. Propõe-se que proteínas com este dobramento, que usualmente classificam-se como tendo um único domínio, na verdade são compostas por dois domínios, cada um deles correspondendo a um \"meio barril\" (β/α)4. Assim, as proteínas com dobramento barril (β/α)8 seriam provenientes de uma duplicação e fusão gênica de um ancestral \"meio barril\" (β/α)4. O objetivo geral deste projeto é investigar a existência de dois domínios (β/α)4, as metades N- e C-terminal, na estrutura (β/α)8 barril da β-glicosidase A de Thermotoga maritima (bglTm) e β-glicosidase B de Paenibacillus polymyxa (bglB) por meio de análise da desnaturação térmica e química dessas enzimas. Resultados: Para atingir esse objetivo foram introduzidas mutações que rompem contatos não covalentes entre os supostos domínios destas β-glicosidases. Os segmentos de DNA que codificam as enzimas selvagem e mutantes foram clonados em plasmídeo de expressão pLATE51 e as enzimas recombinantes expressas em Escherichia coli BL21(DE3). Foram purificadas com sucesso as enzimas selvagens e duas mutantes de bglTm, denominadas T1 e T2, que possuem 2 e 4 mutações respectivamente em resíduos na interface inter-metades. Para confirmar o enovelamento destas proteínas recombinantes foi empregada a análise de estruturas secundárias por dicroísmo circular, também o espectro de fluorescência intrínseca de triptofano e sua supressão por acrilamida e finalmente foram determinados parâmetros cinéticos. Observou-se que não houve mudanças significativas na exposição dos triptofanos das proteínas recombinantes, sugerindo que se encontram enoveladas, o que está de acordo com a observação de que as proteínas recombinantes mantêm sua atividade catalítica. Já pela análise de dicroísmo circular concluiu-se que a mutante T1 possui dobramento semelhante à selvagem bglTm e que T2 apresenta diferenças significativas, sendo as porcentagens de α-hélice de 21%, 22% e 10% para bglTm, T1 e T2, respectivamente. Em seguida demonstrou-se que T1 mantém a termo estabilidade semelhante à selvagem, enquanto que T2 tem termo estabilidade reduzida, apresentando kobs de 0,3 min-1 em 80°C e de 0,06 min-1 em 75 °C.. O cálculo de Tm através de Differential Scanning Fluorimetry foi feito para bglB e T2 (42 e 81.7 °C respectivamente), enquanto que bglTm e T1 mantiveram-se estáveis na faixa de temperatura analisada (até 95°C). Na análise do efeito da temperatura sobre a estrutura das mutantes T1 e T2 não se observou nenhuma evidência da presença dos dois supostos domínios (β/α)4. A análise da desnaturação por cloreto de guanidina mostrou que o c50 diminuiu para T2 (2,4 M), mas não mostrou alteração para T1 (4,5 M) em comparação à bglTm (4,3 M). Coerentemente, a estabilidade da enzima selvagem e de T1 na ausência de desnaturante é a mesma (ΔGH2O = 5,2 kcal/mol), mas se reduziu para a T2 (ΔGH2O = 3,5 kcal/mol). Os cálculos do parâmetro m mostraram uma cooperatividade semelhante na desnaturação de bglTm, T1 e T2, não evidenciando independência entre os dois supostos domínios (β/α)4. Em conclusão, a análise estabilidade da β-glicosidase bglTm frente à temperatura e ao cloreto de guanidina não revelaram a presença dos domínios (β/α)4 que correspondem às metades N- e C-terminal desta β-glicosidase. / Introduction and Aims: β-glucosidases from the family GH1 of the glycosil-hidrolases presents a (β/α)8 barrel folding. These proteins are usually classified as single domain, however it has been alternatively proposed that they actually are formed by two \"half barrel\" (β/α)4. Thus, (β/α)8 barrel proteins had evolved from an \"half barrel\" ancestor that underwent a duplication-fusion event. The general goal of this project is the search for the two putative (β/α)4 domains, which form the N- and C-terminal ends of the β-glucosidase A from Thermotoga maritima (bglTm) and β-glucosidase B from Paenibacillus polymyxa (bglB), detecting their presence through the thermal and chemical stability of these (β/α)8 barrel proteins. Results: Site-directed mutagenesis was employed to replace residues forming non-covalent interaction between the putative (β/α)4 domains. DNA segments coding for bglB, bglTm and mutant bglTm were cloned into the pLATE51 expression vector and produced as recombinant proteins in E. coli BL21(DE3). The bglB, bglTm and two mutant bglTm, hereafter called T1 and T2, with 2 and 4 mutations respectively on residues in the interface between the protein halves, were purified. They were stable folded as shown by detecting their catalytic activity upon two different substrates and also by circular dichroism (CD) and tryptophan fluorescence analysis. Nevertheless, T2 showed a decrease in the α-helix content (10 %) in the CD analysis, whereas bglTm and T1 are similar (22 %). The wild-type bglTm and T1 are thermostable, whereas T2 was inactivated after pre-incubation at high temperature (kobs = 0,3 min-1 at 80 °C and 0,06 min-1 at 75 °C). The Differential Scanning Fluorimetry experiments revealed Tm of 42 e 81.7 °C for bglB and T2, respectively, whereas wild-type bglTm and mutant T1 did not showed any thermal transition up to 95 °C. Indeed, the analysis of the thermal stability of T1 and T2 did not reveal any evidence of the putative (β/α)4 domains. Following that, the analysis of the protein denaturation by guanidine hydrochloride showed that the c50 for T2 was reduced (2.4 M), whereas no modification was observed for bglTm and T1 (4,3 and 4,5 M, respectively). In agreement the stability of bglTm and T1 (ΔGH2O = 5,2 kcal/mol) is similar, but it was reduced for T2 (ΔGH2O = 3,5 kcal/mol). The m parameter showed a similar cooperative denaturation for wild-type bglTm and mutants T1 and T2, but no evidence of the independent unfolding of the putative (β/α)4 domains was found. Conclusion: In conclusion, the analysis of the thermal and chemical stability of the bglTm did not reveal the presence of the putative (β/α)4 domains that form the N- and C-terminal end of these β-glucosidase.

Introdução e objetivos: β-glicosidases da família GH1 das glicosil-hidrolases possuem um dobramento do tipo barril (β/α)8. Propõe-se que proteínas com este dobramento, que usualmente classificam-se como tendo um único domínio, na verdade são compostas por dois domínios, cada um deles correspondendo a um \"meio barril\" (β/α)4. Assim, as proteínas com dobramento barril (β/α)8 seriam provenientes de uma duplicação e fusão gênica de um ancestral \"meio barril\" (β/α)4. O objetivo geral deste projeto é investigar a existência de dois domínios (β/α)4, as metades N- e C-terminal, na estrutura (β/α)8 barril da β-glicosidase A de Thermotoga maritima (bglTm) e β-glicosidase B de Paenibacillus polymyxa (bglB) por meio de análise da desnaturação térmica e química dessas enzimas. Resultados: Para atingir esse objetivo foram introduzidas mutações que rompem contatos não covalentes entre os supostos domínios destas β-glicosidases. Os segmentos de DNA que codificam as enzimas selvagem e mutantes foram clonados em plasmídeo de expressão pLATE51 e as enzimas recombinantes expressas em Escherichia coli BL21(DE3). Foram purificadas com sucesso as enzimas selvagens e duas mutantes de bglTm, denominadas T1 e T2, que possuem 2 e 4 mutações respectivamente em resíduos na interface inter-metades. Para confirmar o enovelamento destas proteínas recombinantes foi empregada a análise de estruturas secundárias por dicroísmo circular, também o espectro de fluorescência intrínseca de triptofano e sua supressão por acrilamida e finalmente foram determinados parâmetros cinéticos. Observou-se que não houve mudanças significativas na exposição dos triptofanos das proteínas recombinantes, sugerindo que se encontram enoveladas, o que está de acordo com a observação de que as proteínas recombinantes mantêm sua atividade catalítica. Já pela análise de dicroísmo circular concluiu-se que a mutante T1 possui dobramento semelhante à selvagem bglTm e que T2 apresenta diferenças significativas, sendo as porcentagens de α-hélice de 21%, 22% e 10% para bglTm, T1 e T2, respectivamente. Em seguida demonstrou-se que T1 mantém a termo estabilidade semelhante à selvagem, enquanto que T2 tem termo estabilidade reduzida, apresentando kobs de 0,3 min-1 em 80°C e de 0,06 min-1 em 75 °C.. O cálculo de Tm através de Differential Scanning Fluorimetry foi feito para bglB e T2 (42 e 81.7 °C respectivamente), enquanto que bglTm e T1 mantiveram-se estáveis na faixa de temperatura analisada (até 95°C). Na análise do efeito da temperatura sobre a estrutura das mutantes T1 e T2 não se observou nenhuma evidência da presença dos dois supostos domínios (β/α)4. A análise da desnaturação por cloreto de guanidina mostrou que o c50 diminuiu para T2 (2,4 M), mas não mostrou alteração para T1 (4,5 M) em comparação à bglTm (4,3 M). Coerentemente, a estabilidade da enzima selvagem e de T1 na ausência de desnaturante é a mesma (ΔGH2O = 5,2 kcal/mol), mas se reduziu para a T2 (ΔGH2O = 3,5 kcal/mol). Os cálculos do parâmetro m mostraram uma cooperatividade semelhante na desnaturação de bglTm, T1 e T2, não evidenciando independência entre os dois supostos domínios (β/α)4. Em conclusão, a análise estabilidade da β-glicosidase bglTm frente à temperatura e ao cloreto de guanidina não revelaram a presença dos domínios (β/α)4 que correspondem às metades N- e C-terminal desta β-glicosidase. / Introduction and Aims: β-glucosidases from the family GH1 of the glycosil-hidrolases presents a (β/α)8 barrel folding. These proteins are usually classified as single domain, however it has been alternatively proposed that they actually are formed by two \"half barrel\" (β/α)4. Thus, (β/α)8 barrel proteins had evolved from an \"half barrel\" ancestor that underwent a duplication-fusion event. The general goal of this project is the search for the two putative (β/α)4 domains, which form the N- and C-terminal ends of the β-glucosidase A from Thermotoga maritima (bglTm) and β-glucosidase B from Paenibacillus polymyxa (bglB), detecting their presence through the thermal and chemical stability of these (β/α)8 barrel proteins. Results: Site-directed mutagenesis was employed to replace residues forming non-covalent interaction between the putative (β/α)4 domains. DNA segments coding for bglB, bglTm and mutant bglTm were cloned into the pLATE51 expression vector and produced as recombinant proteins in E. coli BL21(DE3). The bglB, bglTm and two mutant bglTm, hereafter called T1 and T2, with 2 and 4 mutations respectively on residues in the interface between the protein halves, were purified. They were stable folded as shown by detecting their catalytic activity upon two different substrates and also by circular dichroism (CD) and tryptophan fluorescence analysis. Nevertheless, T2 showed a decrease in the α-helix content (10 %) in the CD analysis, whereas bglTm and T1 are similar (22 %). The wild-type bglTm and T1 are thermostable, whereas T2 was inactivated after pre-incubation at high temperature (kobs = 0,3 min-1 at 80 °C and 0,06 min-1 at 75 °C). The Differential Scanning Fluorimetry experiments revealed Tm of 42 e 81.7 °C for bglB and T2, respectively, whereas wild-type bglTm and mutant T1 did not showed any thermal transition up to 95 °C. Indeed, the analysis of the thermal stability of T1 and T2 did not reveal any evidence of the putative (β/α)4 domains. Following that, the analysis of the protein denaturation by guanidine hydrochloride showed that the c50 for T2 was reduced (2.4 M), whereas no modification was observed for bglTm and T1 (4,3 and 4,5 M, respectively). In agreement the stability of bglTm and T1 (ΔGH2O = 5,2 kcal/mol) is similar, but it was reduced for T2 (ΔGH2O = 3,5 kcal/mol). The m parameter showed a similar cooperative denaturation for wild-type bglTm and mutants T1 and T2, but no evidence of the independent unfolding of the putative (β/α)4 domains was found. Conclusion: In conclusion, the analysis of the thermal and chemical stability of the bglTm did not reveal the presence of the putative (β/α)4 domains that form the N- and C-terminal end of these β-glucosidase.