A síndrome SPOAN (acrônimo do inglês spastic paraplegia, optic atrophy and neuropathy) é uma doença neurodegenerativa de herança autossômica recessiva que tem como achados clínicos a atrofia ótica congênita não progressiva, paraplegia espástica e neuropatia ambas progressivas. Ela havia sido mapeada na região cromossômica 11q13, porém a variante patogênica e o gene associados à síndrome não haviam sido identificados. Após execução do sequenciamento do genoma completo de um paciente foi detectada a deleção de 216-pb (chr11.hg19:g.66,024,557_66,024,773del) em homozigose localizada em região regulatória upstream do gene KLC2. Surpreendentemente, essa deleção causa superexpressão do KLC2, detectada em estudos de Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR (qRT-PCR) utilizando fibroblastos e neurônios motores de pacientes comparados com controles. Ensaios utilizando o Danio rerio como modelo in vivo mostraram que tanto o knockdown quanto a superexpressão do klc2 em embriões de zebrafish causa o fenótipo de cauda curvada (leve ou grave); fenótipo esse associado às doenças neurodegenerativas e HSPs. Superexpressão de um gene causada por uma pequena deleção em região regulatória é um novo mecanismo que até então não havia sido descrito na condição autossômica recessiva. Estudos funcionais por meio de gene reporter de LacZ avaliando o padrão de expressão espaço-temporal da região regulatória wild-type e com a deleção de 216-pb foram realizados nesse trabalho em modelo de camundongo, porém, não foi possível identificar um padrão de expressão reprodutível do gene reporter nesse modelo. Por fim, camundongos transgênicos para a superexpresão do KLC2 humano foram gerados, no entanto não foram realizados testes físicos e comportamentais para validar o transgênico como modelo para síndrome SPOAN / SPOAN (the acronym of its clinical symptoms) syndrome is a neurodegenerative disorder mainly characterized by a progressive spastic paraplegia, congenital non-progressive optic atrophy and progressive neuropathy. A potential causative gene was mapped at 11q13, but so far no gene and mutation were identified. Whole-genome sequencing allowed to detect a homozygous 216-bp deletion (chr11.hg19:g.66,024,557_66,024,773del) located at the regulatory upstream region of the KLC2 gene. Surprisingly, this deletion causes KLC2 overexpression detected by Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR (qRT-PCR) using fibroblasts and motor-neurons from patients compared with controls. Assays using Danio rerio as in vivo model showed that the klc2 knockdown either its overexpression in zebrafish embryos causes mild to severe curly-tail phenotype; phenotype that is already well defined as suggestive of a neurodegenerative disorder and HSP. Overexpression of a gene caused by a small deletion in the regulatory region is a novel mechanism, which to the best of our knowledge, was never reported before in a recessive condition. Functional studies using LacZ reporter assay evaluating the spatiotemporal expression pattern of wild-type regulatory region and with the deletion of 216-bp were performed in this work using mouse, but was not possible to identify an especific gene reporter expression pattern in this animal model. As a last experiment, transgenic mice for human KLC2 overexpression were generated, though behavioral tests were not performed to validate this transgenic animal as a model for SPOAN syndrome

A síndrome SPOAN (acrônimo do inglês spastic paraplegia, optic atrophy and neuropathy) é uma doença neurodegenerativa de herança autossômica recessiva que tem como achados clínicos a atrofia ótica congênita não progressiva, paraplegia espástica e neuropatia ambas progressivas. Ela havia sido mapeada na região cromossômica 11q13, porém a variante patogênica e o gene associados à síndrome não haviam sido identificados. Após execução do sequenciamento do genoma completo de um paciente foi detectada a deleção de 216-pb (chr11.hg19:g.66,024,557_66,024,773del) em homozigose localizada em região regulatória upstream do gene KLC2. Surpreendentemente, essa deleção causa superexpressão do KLC2, detectada em estudos de Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR (qRT-PCR) utilizando fibroblastos e neurônios motores de pacientes comparados com controles. Ensaios utilizando o Danio rerio como modelo in vivo mostraram que tanto o knockdown quanto a superexpressão do klc2 em embriões de zebrafish causa o fenótipo de cauda curvada (leve ou grave); fenótipo esse associado às doenças neurodegenerativas e HSPs. Superexpressão de um gene causada por uma pequena deleção em região regulatória é um novo mecanismo que até então não havia sido descrito na condição autossômica recessiva. Estudos funcionais por meio de gene reporter de LacZ avaliando o padrão de expressão espaço-temporal da região regulatória wild-type e com a deleção de 216-pb foram realizados nesse trabalho em modelo de camundongo, porém, não foi possível identificar um padrão de expressão reprodutível do gene reporter nesse modelo. Por fim, camundongos transgênicos para a superexpresão do KLC2 humano foram gerados, no entanto não foram realizados testes físicos e comportamentais para validar o transgênico como modelo para síndrome SPOAN / SPOAN (the acronym of its clinical symptoms) syndrome is a neurodegenerative disorder mainly characterized by a progressive spastic paraplegia, congenital non-progressive optic atrophy and progressive neuropathy. A potential causative gene was mapped at 11q13, but so far no gene and mutation were identified. Whole-genome sequencing allowed to detect a homozygous 216-bp deletion (chr11.hg19:g.66,024,557_66,024,773del) located at the regulatory upstream region of the KLC2 gene. Surprisingly, this deletion causes KLC2 overexpression detected by Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR (qRT-PCR) using fibroblasts and motor-neurons from patients compared with controls. Assays using Danio rerio as in vivo model showed that the klc2 knockdown either its overexpression in zebrafish embryos causes mild to severe curly-tail phenotype; phenotype that is already well defined as suggestive of a neurodegenerative disorder and HSP. Overexpression of a gene caused by a small deletion in the regulatory region is a novel mechanism, which to the best of our knowledge, was never reported before in a recessive condition. Functional studies using LacZ reporter assay evaluating the spatiotemporal expression pattern of wild-type regulatory region and with the deletion of 216-bp were performed in this work using mouse, but was not possible to identify an especific gene reporter expression pattern in this animal model. As a last experiment, transgenic mice for human KLC2 overexpression were generated, though behavioral tests were not performed to validate this transgenic animal as a model for SPOAN syndrome

Tuberous sclerosis complex (TSC) is an autosomal dominant disorder caused by pathogenic variants in either TSC1 or TSC2 tumor suppressor genes. It affects more often the brain, skin, kidneys, heart, lungs, and retina. The protein products of both genes, TSC1 (hamartin) and TSC2 (tuberin), interact, assembling a complex that inhibits mTORC1. Cells with bi-allelic inactivation of either TSC1 or TSC2 genes present hyperactivation of mTORC1, which phosphorylates downstream targets, up-regulating cell proliferation and growth. Moreover, a functional role as heat-shock protein (HSP) co-chaperone has been assigned to TSC1 protein. The first aim of the thesis was to analyze the nature, distribution and functional effects of TSC1 and TSC2 DNA variants from 100 patients with definite clinical diagnosis of TSC. We analyzed leukocyte DNA of 115 TSC patients from three Brazilian tertiary referral hospitals. Pathogenic DNA variants were detected in 99 (86,09%) unrelated individuals; 17 (17,17%) in TSC1 and 82 (82,82%) in TSC2. Clear loss-of-function mutations were detected in 87 patients, of which frameshift (29.29%) and nonsense (29.29%) variants were the most common types. In- frame deletions, missense and putative splicing DNA variants with uncertain clinical significance (VUS) have been functionally assessed. Five variants significantly increased phosphorylation of the reporter residue S6K Thr 389 . Forty-one novel pathogenic DNA variants and 19 novel single nucleotide variants have been detected. Among the 11 individuals with no mutation identified, seven presented rare putative missense, splicing or in- frame deletion DNA VUS. To understand the regulatory relationship of TSC1/2 gene expression, we aimed to evaluate TSC1 and TSC2 mRNA and protein levels in human cell lines with bi-allelic inactivation of each gene. We employed high throughput transcriptome analysis (RNA-Seq) and Western blotting of HEK293T and other six HEK293T-derived cell lines that had the genomic sequence of the TSC1 and or TSC2 genes edited by the CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-CAS9 system. In lack of either TSC1 or TSC2 protein, a significant reduction of the respective mRNA was observed, inferring no positive transcriptional feedback. Serum-deprived cell lines without TSC1 decreased TSC2 mRNA levels. Under these conditions, TSC1 mRNA levels were not negatively affected by the lack of TSC2. In one cell line with loss of TSC1 (1C2) TSC1/2 mRNA and TSC2 protein levels were consistently decreased independently on serum. RNA-Seq gene ontology analyses comparing 1C2 to HEK293T reference cell line disclosed down-regulation of translational pathways independently on serum; and up-regulation of protein folding and stability pathways upon serum withdrawal. Our data are consistent with the role of TSC1 as HSP co-chaperone, and suggest that TSC1 mRNA may be regulated at both transcriptional and decay levels / O complexo de esclerose tuberosa (TSC) é um distúrbio autossômico dominante causado por variantes patogênicas em um de dois genes supressores de tumor TSC1 ou TSC2. Afeta mais frequentemente o cérebro, a pele, os rins, o coração, os pulmões e a retina. Os produtos proteicos de ambos os genes, TSC1 (hamartina) e TSC2 (tuberina), interagem formando um complexo que inibe o mTORC1. As células com inactivação bi- alélica dos genes TSC1 ou TSC2 apresentam hiperactivação de mTORC1, que fosforila alvos a jusante, regulando positivamente a proliferação e o crescimento celular. Além disso, o papel funcional da co-chaperona da proteína de choque térmico (HSP) foi atribuído à proteína TSC1. O primeiro objetivo dessa tese foi analisar a natureza, distribuição e os efeitos funcionais das variantes de DNA de TSC1 e TSC2 de 100 pacientes com diagnóstico clínico definitivo de TSC. Analisamos o DNA de leucócitos de 115 pacientes com TSC de três hospitais brasileiros de referência. Variantes de DNA patogênico foram detectadas em 99 (86,09%) indivíduos não relacionados; 17 (17,17%) em TSC1 e 82 (82,82%) em TSC2. Mutações de perda de função foram detectadas em 87 pacientes, dos quais as variantes frameshift (29,29%) e nonsense (29,29%) foram os tipos mais comuns. Deleções in-frame, variantes missense e variantes de splicing com significância clínica incerta (VUS) foram avaliadas funcionalmente. Cinco variantes aumentaram significativamente a fosforilação do resíduo repórter S6K Thr 389 . Quarenta e uma novas variantes de DNA patogênico e 19 novas variantes de nucleotídeo único foram detectadas. Entre os 11 indivíduos sem mutação identificada, sete apresentaram variantes raras missense, splicing ou deleções in-frame do tipo VUS. Para entender a relação regulatória da expressão do gene TSC1/2, tivemos com segundo objetivo avaliar os níveis de mRNA e proteína de TSC1 e TSC2 em linhagens de células humanas com inativação bi-alélica de cada gene. Empregamos uma análise de transcriptoma de alto rendimento (RNA-Seq) e Western blotting de HEK293T e outras seis linhagens celulares derivadas de HEK293T que possuíam a sequência genomica dos genes TSC1 e/ou TSC2 editados por CRISPR- CAS9. Na falta da proteína TSC1 ou TSC2, foi observada uma redução significativa do respectivo mRNA, inferindo ausência de feedback transcricional positivo. Linhagens celulares privadas de soro TSC1 -/- diminuíram os níveis de mRNA de TSC2. Sob estas condições, os níveis de mRNA de TSC1 não foram afetados negativamente pela falta de TSC2. Numa linhagem celular com a perda de TSC1 (1C2), os RNAm de TSC1/2 e os níveis de proteína de TSC2 foram consistentemente diminuídos independentemente no soro. Análise de RNA-Seq comparando a linhagens celular de 1C2 com a referência HEK293T revelou uma regulação negativa de vias de tradução independentemente no soro; e supra-regulação das vias de enrolamento e estabilidade das proteínas após a retirada do soro. Nossos dados são consistentes com o papel do TSC1 como co-chaperona de HSP, e sugerem que o mRNA de TSC1 pode ser regulador nos níveis de transcrição

As malformações craniofaciais (MCFs) compreendem uma vasta e heterogênea gama de doenças que envolvem o acometimento de tecidos do crânio e da face, sendo que indivíduos afetados enfrentam morbidade e deficiências funcionais relevantes. O entendimento da etiologia das MCFs é de extrema importância, pois poderá levar ao desenvolvimento ou melhoria de estratégias preventivas e terapêuticas. As MCFs são oriundas principalmente de distúrbios no desenvolvimento da crista neural cranial e seus derivados mesenquimais. Neste contexto, modelos baseados em células derivadas de crista neural são de grande potencial para o entendimento das MCFs, já que estudos funcionais podem ser realizados nestas células para averiguar fenótipos diretamente relacionados às doenças. Neste trabalho, nós empregamos esta estratégia na investigação de três tipos de MCFs: fissuras labiopalatinas não sindrômicas (FLP NS), síndrome de Richieri-Costa-Pereira (SRCP) e síndrome de Treacher Collins (STC). As FLP NS foram investigadas por meio de ensaios transcriptômicos e funcionais em células-tronco de polpa de dente decíduo, que são células mesenquimais adultas derivadas de crista neural cranial. Identificamos uma assinatura de expressão gênica específica às FLP NS, com desregulação de uma rede gênica responsável pelo reparo de quebras duplas no DNA, resultando no acúmulo deste tipo de lesão em células de indivíduos afetados pela doença. Estes achados revelam um novo mecanismo patogênico para as FLP NS e corroboram observações prévias que sugeriam sobreposição de etiologias entre esta doença e o câncer. A SRCP e a STC foram investigadas com o uso de uma nova metodologia para a geração de células de crista neural a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (induced pluripotent stem cells; iPSCs) para recapitular o desenvolvimento craniofacial. Realizamos triagem de fenótipos celulares e identificamos desregulação de diferenciação osteogênica em células mesenquimais derivadas de crista neural de pacientes com SRCP, o que foi corroborado por ensaios de RNA de interferência. Além disso, mostramos que células mesenquimais de crista neural de pacientes com STC apresentam apoptose elevada aliada a alterações durante diferenciação osteogênica e condrogênica. Estes resultados revelam que células mesenquimais de crista neural estão alteradas na SRCP e STC, colaborando para o esclarecimento dos mecanismos patogênicos responsáveis por estas síndromes. Assim sendo, nós evidenciamos a aplicabilidade da modelagem de MCFs por meio de células oriundas da crista neural, e esses achados inéditos contribuirão para um melhor entendimento da etiologia das MCFs, e servem de base para futuras estratégias de pesquisa na área de doenças craniofaciais / Craniofacial malformations (CFMs) comprise a large and heterogeneous group of disorders in which tissues of the skull and face are affected. Affected subjects suffer from significant functional impairment and morbidity, and understanding the aetiology of these disorders is of great importance, as it may lead to the development or improvement of preventive and therapeutic strategies in the future. CFMs are largely considered to arise from developmental disturbances in the cranial neural crest and its cranioskeletal and cartilaginous mesenchymal derivatives. Neural crest-derived cell models have the potential to provide invaluable insight into the pathogenesis of CFMs, as functional studies can be to assess phenotypes in disease-relevant cell lineages. In this work, we applied this strategy to investigate three craniofacial disorders: non-syndromic cleft lip/palate (NSCL/P), Richieri-Costa-Pereira syndrome (RCPS), and Treacher Collins syndrome (TCS). NSCL/P was investigated through transcriptomic and functional assays on stem cells from human exfoliated deciduous teeth, which are neural crest-derived, adult mesenchymal cells. We identified a NSCL/P-specific dysregulated transcriptional signature involving a gene network responsible for DNA double-strand break repair that results in accumulation of DNA damage in patients\' cells. These findings revealed a novel pathogenetic mechanism for NSCL/P and support previous observations pointing towards an aetiological overlap between this disease and cancer. RCPS and TCS were investigated with the use of a novel approach to generate neural crest cells from patient-specific induced pluripotent stem cells (iPSCs) as a means to recapitulate craniofacial development. We demonstrated that RCPS and TCS somatic cells can be successfully used to generate iPSCs and iPSC-derived neural crest cells and their mesenchymal derivatives. Phenotype screening showed that RCPS neural crest-derived mesenchymal cells display dysregulation of osteogenic differentiation, which was supported by confirmatory knockdown assays. Further, we report elevated apoptosis in TCS neural crest-derived mesenchymal cells, which was allied to alterations in chondrogenic and osteogenic differentiation. These results will aid in clarifying the pathogenic mechanism determining RCPS and TCS, revealing that neural crest mesenchymal cells are altered in these syndromes. In conclusion, we attested the applicability of NC-derived cell types to provide clues regarding the pathogenetic mechanisms leading to CFMs, and these novel findings will aid in dissecting the aetiology of CFMs by providing grounds to direct future efforts in craniofacial research

As malformações craniofaciais (MCFs) compreendem uma vasta e heterogênea gama de doenças que envolvem o acometimento de tecidos do crânio e da face, sendo que indivíduos afetados enfrentam morbidade e deficiências funcionais relevantes. O entendimento da etiologia das MCFs é de extrema importância, pois poderá levar ao desenvolvimento ou melhoria de estratégias preventivas e terapêuticas. As MCFs são oriundas principalmente de distúrbios no desenvolvimento da crista neural cranial e seus derivados mesenquimais. Neste contexto, modelos baseados em células derivadas de crista neural são de grande potencial para o entendimento das MCFs, já que estudos funcionais podem ser realizados nestas células para averiguar fenótipos diretamente relacionados às doenças. Neste trabalho, nós empregamos esta estratégia na investigação de três tipos de MCFs: fissuras labiopalatinas não sindrômicas (FLP NS), síndrome de Richieri-Costa-Pereira (SRCP) e síndrome de Treacher Collins (STC). As FLP NS foram investigadas por meio de ensaios transcriptômicos e funcionais em células-tronco de polpa de dente decíduo, que são células mesenquimais adultas derivadas de crista neural cranial. Identificamos uma assinatura de expressão gênica específica às FLP NS, com desregulação de uma rede gênica responsável pelo reparo de quebras duplas no DNA, resultando no acúmulo deste tipo de lesão em células de indivíduos afetados pela doença. Estes achados revelam um novo mecanismo patogênico para as FLP NS e corroboram observações prévias que sugeriam sobreposição de etiologias entre esta doença e o câncer. A SRCP e a STC foram investigadas com o uso de uma nova metodologia para a geração de células de crista neural a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (induced pluripotent stem cells; iPSCs) para recapitular o desenvolvimento craniofacial. Realizamos triagem de fenótipos celulares e identificamos desregulação de diferenciação osteogênica em células mesenquimais derivadas de crista neural de pacientes com SRCP, o que foi corroborado por ensaios de RNA de interferência. Além disso, mostramos que células mesenquimais de crista neural de pacientes com STC apresentam apoptose elevada aliada a alterações durante diferenciação osteogênica e condrogênica. Estes resultados revelam que células mesenquimais de crista neural estão alteradas na SRCP e STC, colaborando para o esclarecimento dos mecanismos patogênicos responsáveis por estas síndromes. Assim sendo, nós evidenciamos a aplicabilidade da modelagem de MCFs por meio de células oriundas da crista neural, e esses achados inéditos contribuirão para um melhor entendimento da etiologia das MCFs, e servem de base para futuras estratégias de pesquisa na área de doenças craniofaciais / Craniofacial malformations (CFMs) comprise a large and heterogeneous group of disorders in which tissues of the skull and face are affected. Affected subjects suffer from significant functional impairment and morbidity, and understanding the aetiology of these disorders is of great importance, as it may lead to the development or improvement of preventive and therapeutic strategies in the future. CFMs are largely considered to arise from developmental disturbances in the cranial neural crest and its cranioskeletal and cartilaginous mesenchymal derivatives. Neural crest-derived cell models have the potential to provide invaluable insight into the pathogenesis of CFMs, as functional studies can be to assess phenotypes in disease-relevant cell lineages. In this work, we applied this strategy to investigate three craniofacial disorders: non-syndromic cleft lip/palate (NSCL/P), Richieri-Costa-Pereira syndrome (RCPS), and Treacher Collins syndrome (TCS). NSCL/P was investigated through transcriptomic and functional assays on stem cells from human exfoliated deciduous teeth, which are neural crest-derived, adult mesenchymal cells. We identified a NSCL/P-specific dysregulated transcriptional signature involving a gene network responsible for DNA double-strand break repair that results in accumulation of DNA damage in patients\' cells. These findings revealed a novel pathogenetic mechanism for NSCL/P and support previous observations pointing towards an aetiological overlap between this disease and cancer. RCPS and TCS were investigated with the use of a novel approach to generate neural crest cells from patient-specific induced pluripotent stem cells (iPSCs) as a means to recapitulate craniofacial development. We demonstrated that RCPS and TCS somatic cells can be successfully used to generate iPSCs and iPSC-derived neural crest cells and their mesenchymal derivatives. Phenotype screening showed that RCPS neural crest-derived mesenchymal cells display dysregulation of osteogenic differentiation, which was supported by confirmatory knockdown assays. Further, we report elevated apoptosis in TCS neural crest-derived mesenchymal cells, which was allied to alterations in chondrogenic and osteogenic differentiation. These results will aid in clarifying the pathogenic mechanism determining RCPS and TCS, revealing that neural crest mesenchymal cells are altered in these syndromes. In conclusion, we attested the applicability of NC-derived cell types to provide clues regarding the pathogenetic mechanisms leading to CFMs, and these novel findings will aid in dissecting the aetiology of CFMs by providing grounds to direct future efforts in craniofacial research