A síndrome SPOAN (acrônimo do inglês spastic paraplegia, optic atrophy and neuropathy) é uma doença neurodegenerativa de herança autossômica recessiva que tem como achados clínicos a atrofia ótica congênita não progressiva, paraplegia espástica e neuropatia ambas progressivas. Ela havia sido mapeada na região cromossômica 11q13, porém a variante patogênica e o gene associados à síndrome não haviam sido identificados. Após execução do sequenciamento do genoma completo de um paciente foi detectada a deleção de 216-pb (chr11.hg19:g.66,024,557_66,024,773del) em homozigose localizada em região regulatória upstream do gene KLC2. Surpreendentemente, essa deleção causa superexpressão do KLC2, detectada em estudos de Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR (qRT-PCR) utilizando fibroblastos e neurônios motores de pacientes comparados com controles. Ensaios utilizando o Danio rerio como modelo in vivo mostraram que tanto o knockdown quanto a superexpressão do klc2 em embriões de zebrafish causa o fenótipo de cauda curvada (leve ou grave); fenótipo esse associado às doenças neurodegenerativas e HSPs. Superexpressão de um gene causada por uma pequena deleção em região regulatória é um novo mecanismo que até então não havia sido descrito na condição autossômica recessiva. Estudos funcionais por meio de gene reporter de LacZ avaliando o padrão de expressão espaço-temporal da região regulatória wild-type e com a deleção de 216-pb foram realizados nesse trabalho em modelo de camundongo, porém, não foi possível identificar um padrão de expressão reprodutível do gene reporter nesse modelo. Por fim, camundongos transgênicos para a superexpresão do KLC2 humano foram gerados, no entanto não foram realizados testes físicos e comportamentais para validar o transgênico como modelo para síndrome SPOAN / SPOAN (the acronym of its clinical symptoms) syndrome is a neurodegenerative disorder mainly characterized by a progressive spastic paraplegia, congenital non-progressive optic atrophy and progressive neuropathy. A potential causative gene was mapped at 11q13, but so far no gene and mutation were identified. Whole-genome sequencing allowed to detect a homozygous 216-bp deletion (chr11.hg19:g.66,024,557_66,024,773del) located at the regulatory upstream region of the KLC2 gene. Surprisingly, this deletion causes KLC2 overexpression detected by Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR (qRT-PCR) using fibroblasts and motor-neurons from patients compared with controls. Assays using Danio rerio as in vivo model showed that the klc2 knockdown either its overexpression in zebrafish embryos causes mild to severe curly-tail phenotype; phenotype that is already well defined as suggestive of a neurodegenerative disorder and HSP. Overexpression of a gene caused by a small deletion in the regulatory region is a novel mechanism, which to the best of our knowledge, was never reported before in a recessive condition. Functional studies using LacZ reporter assay evaluating the spatiotemporal expression pattern of wild-type regulatory region and with the deletion of 216-bp were performed in this work using mouse, but was not possible to identify an especific gene reporter expression pattern in this animal model. As a last experiment, transgenic mice for human KLC2 overexpression were generated, though behavioral tests were not performed to validate this transgenic animal as a model for SPOAN syndrome

A síndrome SPOAN (acrônimo do inglês spastic paraplegia, optic atrophy and neuropathy) é uma doença neurodegenerativa de herança autossômica recessiva que tem como achados clínicos a atrofia ótica congênita não progressiva, paraplegia espástica e neuropatia ambas progressivas. Ela havia sido mapeada na região cromossômica 11q13, porém a variante patogênica e o gene associados à síndrome não haviam sido identificados. Após execução do sequenciamento do genoma completo de um paciente foi detectada a deleção de 216-pb (chr11.hg19:g.66,024,557_66,024,773del) em homozigose localizada em região regulatória upstream do gene KLC2. Surpreendentemente, essa deleção causa superexpressão do KLC2, detectada em estudos de Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR (qRT-PCR) utilizando fibroblastos e neurônios motores de pacientes comparados com controles. Ensaios utilizando o Danio rerio como modelo in vivo mostraram que tanto o knockdown quanto a superexpressão do klc2 em embriões de zebrafish causa o fenótipo de cauda curvada (leve ou grave); fenótipo esse associado às doenças neurodegenerativas e HSPs. Superexpressão de um gene causada por uma pequena deleção em região regulatória é um novo mecanismo que até então não havia sido descrito na condição autossômica recessiva. Estudos funcionais por meio de gene reporter de LacZ avaliando o padrão de expressão espaço-temporal da região regulatória wild-type e com a deleção de 216-pb foram realizados nesse trabalho em modelo de camundongo, porém, não foi possível identificar um padrão de expressão reprodutível do gene reporter nesse modelo. Por fim, camundongos transgênicos para a superexpresão do KLC2 humano foram gerados, no entanto não foram realizados testes físicos e comportamentais para validar o transgênico como modelo para síndrome SPOAN / SPOAN (the acronym of its clinical symptoms) syndrome is a neurodegenerative disorder mainly characterized by a progressive spastic paraplegia, congenital non-progressive optic atrophy and progressive neuropathy. A potential causative gene was mapped at 11q13, but so far no gene and mutation were identified. Whole-genome sequencing allowed to detect a homozygous 216-bp deletion (chr11.hg19:g.66,024,557_66,024,773del) located at the regulatory upstream region of the KLC2 gene. Surprisingly, this deletion causes KLC2 overexpression detected by Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR (qRT-PCR) using fibroblasts and motor-neurons from patients compared with controls. Assays using Danio rerio as in vivo model showed that the klc2 knockdown either its overexpression in zebrafish embryos causes mild to severe curly-tail phenotype; phenotype that is already well defined as suggestive of a neurodegenerative disorder and HSP. Overexpression of a gene caused by a small deletion in the regulatory region is a novel mechanism, which to the best of our knowledge, was never reported before in a recessive condition. Functional studies using LacZ reporter assay evaluating the spatiotemporal expression pattern of wild-type regulatory region and with the deletion of 216-bp were performed in this work using mouse, but was not possible to identify an especific gene reporter expression pattern in this animal model. As a last experiment, transgenic mice for human KLC2 overexpression were generated, though behavioral tests were not performed to validate this transgenic animal as a model for SPOAN syndrome

A idade da mutação e a ancestralidade local de segmentos cromossômicos que contém mutações associadas a doenças autossômicas recessivas em populações miscigenadas brasileiras continuam desconhecidas. Adicionalmente, a determinação dos níveis de endogamia continua grosseiramente estimados por abordagem genealógica e nada se sabe sobre a linhagem materna das famílias com indivíduos com doenças autossômicas recessivas. A tese está dividida em dois estudos. O primeiro visou calcular os níveis de endogamia pela abordagem de grandes regiões em homozigose, estimar a idade da mutação e inferir a ancestralidade local para determinar a origem de cada segmento cromossômico contendo mutações em KLC2, IMPA1, MED25 e WNT7A. Foram genotipadas amostras de 19 pacientes com doenças autossômicas recessivas. Os dados genotipados passaram por distintos procedimentos de filtragem para estimar os níveis de endocruzamento por abordagem molecular, para calcular a idade das mutações por meio de haplótipos, para inferir a ancestralidade global utilizando ADMIXTURE e Análise de Componentes Principais, e de forma refinada foi inferida a ancestralidade local pelo software RFMix combinando os dados de nossas amostras com os dados do projeto 1000 genomas (one thousand genome project - 1KGP) e projeto de diversidade genômica Simons (Simons genomic diversity project - SGDP). Os resultados apresentados não diferiram bastante do esperado para populações endogâmicas e miscigenadas do nordeste brasileiro de acordo com a literatura. A mutação em KLC2 mostrou-se mais antiga em relação às demais. Em um segundo estudo, para os indivíduos com mutação em KLC2 prosseguimos com a inferência dos haplogrupos de DNA mitocondrial para determinar a origem da linhagem materna das famílias. Onze pacientes com mutação em KLC2 foram escolhidos para sequenciamento de Sanger da região controle do DNA mitocondrial para determinação da matrilinhagem. Foi encontrado um possível haplogrupo fundador que pode corroborar narrativas históricas de entrada de mães sefarditas no litoral do Nordeste junto com os holandeses. Ambos trabalhos apresentam como novidade a contribuição para identificar a origem e entender como essas doenças são mantidas e dispersas em populações do Brasil e do mundo. Em especial, a matrilinhagem exibiu evidências de ligação entre as mães de famílias com indivíduos com mutação em KLC2 e mães de judeus sefarditas portugueses / The mutation age and local ancestry of chromosomal segments harbouring mutations associated with autosomal recessive (AR) disorders in Brazilian admixed populations remain unknown; additionally, inbreeding levels for these affected individuals continue to be roughly estimated by genealogical approach, and the maternal lineage of the families with affected individuals is unknown. The thesis is divided into two studies. The first one aimed to calculate inbreeding levels by runs of homozygosity approach, estimating the age of the mutation and inferring the local ancestry to determine the origin of each chromosomal segment containing mutations in KLC2, IMPA1, MED25 e WNT7A. Samples from 19 patients with autosomal recessive diseases were genotyped. The genotyped data underwent different filtering procedures to estimate the inbreeding levels by molecular approach, to calculate the age of the mutations by means of haplotypes, to infer the global ancestry using ADMIXTURE and Principal Component Analysis, and to infer refined the local ancestry by the RFMix software combining the data from our samples with the one thousand genome project (1KGP) and the Simons genomic diversity project (SGDP). The results presented did not differ significantly from those expected for inbred and admixed populations of the Brazil Northeast according to the literature. The mutation in KLC2 was older in relation to the others. In a second study, for individuals with a KLC2 mutation, we proceeded with the inference of mitochondrial DNA haplogroups to determine the origin of the families\' maternal lineage. Eleven patients with mutation in KLC2 were chosen for Sanger sequencing of the mitochondrial DNA control region for determination of matrilineage. It was found a possible founding haplogroup that can corroborate historical narratives of Sephardic mothers\' influx along the coast of the Northeast with the Dutch. Both papers present as a novelty the identification of the origin and the understanding of how these diseases are maintained and dispersed in populations of Brazil and the world. In particular, the matrilineage exhibited an evidence of kinship among mothers of families with individuals with mutation in KLC2 and mothers of portuguese Sephardic jews