Cada vez mais a busca por fontes de energia renováveis tem se intensificado. Isto não somente pela preocupação ambiental, mas também devido aos combustíveis fósseis serem limitados. Desta forma, o etanol de segunda geração (bioetanol) tem chamado a atenção por ser uma fonte de energia pouco poluente e que pode ser obtida a partir de resíduos agroindustriais. Resíduos lignocelulósicos agroindustriais, como a casca de arroz, são fontes abundantes e de baixo custo para produção biotecnológica de compostos de alto valor agregado. Esse processo biotecnológico tem o objetivo de promover o aproveitamento completo das frações celulósica (contém hexoses) e hemicelulósica (rica em pentoses) dos resíduos lignocelulósicos, para a obtenção de commodities. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade de conversão de hexoses e pentoses pela levedura Spathaspora arborariae, descrita recentemente como boa conversora de pentoses a etanol. Cultivos sobre meio semissintético e hidrolisado de casca de arroz, a 180 rpm e 28oC, foram realizados em agitador orbital utilizando frascos Erlemmeyers, utilizando leveduras fermentadoras de hexoses e pentoses, como Saccharomyces cerevisiae, Candida shehatae, Pichia stipitis e Spathaspora arborariae, respectivamente, em cultivos isolados e em co-cultivo. As cepas testadas isoladamente apresentaram valores de produtividade de etanol (YP/S) entre 0,35 e 0,46 g g-1, enquanto que o rendimento dos co-cultivos variou de 0,30 e 0,77 g g-1 de etanol, sobre ambos os susbstratos. Também foram realizados ensaios em frascos agitados em aerobiose (180 rpm) e anaerobiose (100 rpm) a 28oC utilizando como meio de cultura com diferentes açúcares individualmente (glicose, xilose ou arabinose). O cultivo realizado em anaerobiose, utilizando glicose como substrato foi o que apresentou maior índices de conversão de etanol (Y P/S) 0,26 g g-1. Cultivos foram conduzidos em biorreatores submersos utilizando S. arborariae sobre meio semissintético, contendo glicose e xilose, em condições anaeróbicas (150 rpm), aeróbicas (400 rpm e 2 vvm; 150 rpm e 0,5 vvm) e microaerofilia (180 rpm e 0,33 vvm). O maior rendimento de etanol foi obtido no cultivo anaeróbico com Y P/S=0,52 g g-1. / It is increasing the search for renewable energy sources due to environmental concerns and the possibility of fossil fuels shortage in the near future. Thus, the second generation ethanol (bioethanol) has drawn attention for being a renewable energy source and can be obtained from organic residues. Lignocellulosic agroindustrial residues such as rice hulls are abundant resources and have a low cost for the biotechnological production of compounds of high added value. This biotechnological process aims to promote the full exploitation of the cellulose fractions (containing hexoses) and hemicellulose (rich in pentoses) of lignocellulosic wastes to obtain commodities such as ethanol. This study aimed at studying the capability of the yeast Spathaspora arborariae, recently discovered, of converting hexoses and pentoses into ethanol. Cultures on semi synthetic medium and hydrolyzed rice hull at 180 rpm and 28oC, were performed in shaker, using fermenting yeast hesoxes and pentoses such as Saccharomyces cerevisiae, Candida shehatae, Pichia stipitis and Spathaspora arborariae, either isolated or in co-cultivations. The strains tested alone showed values of ethanol yields (YP/S) between 0.35 and 0.46 g g-1, while the yield of co-cultures varied from 0.30 to 0.77 g g-1 ethanol on both substrates. Experiments were also carried out in shake flasks under aerobic conditions (180 rpm) and anaerobic (100 rpm) at 280C using culture medium with different sugars individually (glucose, xylose, or arabinose). The yeasts cultivated in anaerobic conditions using glucose as substrate showed the highest ethanol yields (YP/S) 0.26 g g-1. Cultures were conducted in submerged bioreactors using S. arborariae on semi-synthetic medium containing glucose and xylose under anaerobic conditions (150 rpm), aerobic (400 rpm and 2 vvm, 150 rpm and 0.5 vvm) and micro-aerobiosis (180 rpm and 0.33 vvm). The highest ethanol yield was obtained in anaerobic cultivation with YP/S = 0.52 g g-1.

Este trabalho teve como objetivo avaliar a reação de transesterificação pelo método “Transesterification Double Step Process” (TDSP) modificado usando como insumos óleo de soja, catalisadores homogêneos e mistura etanol/metanol nas proporções v/v (50:50, 75:25, 90:10). Devido às diferenças de temperatura da reação de síntese do biodiesel metílico (80 °C) e etílico (60 °C), variou-se a temperatura da reação na síntese de biodiesel etílico/metílico utilizando uma mistura de álcoois de 50:50 v/v, de modo a determinar as melhores temperaturas de trabalho. Os demais experimentos foram realizados na melhor condição de ensaio (60 °C). O teor de ésteres obtido em cada caso, inicialmente foi analisado por 1HRMN e posteriormente pela técnica cromatográfica oficial via GC-FID. Segundo a análise por 1HRMN os graus de conversão foram satisfatórios e não apresentaram diferenças significativas quando as proporções iniciais etanol/metanol na reação eram variadas. Os valores obtidos foram de 97,9±0,8% para a proporção 50:50, 97,6±0,6% para a proporção 75:25 e 98,6±0,5% para a proporção 90:10 (etanol: metanol, v/v). Os rendimentos apresentaram valores igualmente altos: 94,4±0,4% (αBD50/50); 96,2±1,4% (αBD75/25) e 94,6±0,6% (αBD90/10). Já a análise cromatográfica não mostrou resultados satisfatórios para a análise dos ésteres e do diacilglicerol. Para a determinação dos teores de gliceróis livres e totais, bem como de monoacilgliceróis e triacilgliceróis, a análise cromatográfica revelou valores estabelecidos pela ANP. A análise qualitativa por GC-MS foi bem sucedida, permitindo a identificação dos ésteres obtidos, bem como tendências proporcionais aos graus obtidos por HRMN. Dos ensaios dos parâmetros de qualidade dos biodieseis (massa específica a 20 °C, viscosidade cinemática a 40 °C, teor de água, ponto de fulgor, resíduo de carbono, enxofre total, sódio e potássio, cálcio e magnésio, corrosividade ao cobre (3h a 50 °C), quantidade de metanol e/ou etanol, índice de iodo e estabilidade a oxidação a 110 °C), somente acusaram resultados fora das especificações da ANP, os parâmetros de enxofre total e teor de água. O conjunto de dados obtidos permite inferir que estudos de aperfeiçoamento da técnica de transesterificação pelo método TDSP modificado são necessários, bem como o desenvolvimento de métodos cromatográficos para análise de ésteres totais de biodieseis etílico/metílico. / The present work aimed the evaluation of the transesterification reaction carried out by a modified Double Step Process (TDSP) using soybean oil, homogeneous catalysts and mixtures ethanol/methanol (50:50, 75:25 and 90:10 v/v). Due to the temperature differences between the methyl biodiesel (80 °C) and the ethyl biodiesel (60 °C) reaction, experiments were carried out at varying temperatures for the ethyl/methyl biodiesel using a mixture of alcohols 50:50 v/v, in order to establish the best work temperature. The remaining experiments were carried out at the best working condition (60 °C). The ester content, in each case, was initially analyzed by 1HNMR and afterwards by the official chromatographic technique in GC-FID way. According to the 1HNMR analysis the obtained conversion degrees were satisfactory and do not presented significant differences when the starting ethanol/methanol proportion was varied. The conversion factor was 97.9±0.8% for 50:50 v/v, 97.6±0.6% for 75:25v/v and 98.6±0.5% for 90:10 v/v. The yields were also high: 94.4±0.4% (αBD50/50); 96.2±1.4% (αBD75/25) e 94.6±0.6% (αBD90/10). On the other hand, the chromatographic analysis did not show satisfactory results for the esters and diacylglycerol analyses. The chromatographic analysis of free and to-tal glycerols as well as monoacylglycerols and triacylglycerols results in the values esta-blished by ANP. The quantitative analysis by CG-MS was well succeeded allowing the identification of the obtained esters as well as tendencies proportional to the degrees which resulted from HNMR. Among the biodiesel quality parameters (specific gravity at 20 °C, kinematic viscosity at 40 °C, water content, flash point, carbon residue, total sulfur, sodium and potassium, calcium and magnesium, corrosivity to copper (3h at 50 °C), amount of methanol and/or ethanol, iodine index and stability to oxidation at 110 °C), only the values of total sulfur and water content were outside the ANP specifications. The obtained data allow to conclude that the improvements in the transesterification technique by TDSP method are necessary as well as the development of chromatographic methods of analysis of ethylic/methylic biodiesel total esters.

As mudanças climáticas, aliadas às necessidades estratégicas de produção de energia, têm motivado uma corrida sem precedentes à produção de combustíveis alternativos, preferencialmente de fontes renováveis. Em vista disso, o presente trabalho visou avaliar a biodiversidade e realizar a bioprospecção de micro-organismos provenientes de diversos ambientes florestais brasileiros e selecionar micro-organismos capazes de produção de enzimas do complexo celulolítico e sua capacidade para a produção de bioetanol. Duzentos e trinta e sete micro-organismos silvestres foram utilizados para os testes de atividade enzimática, quatro linhagens de leveduras e 10 isolados de solo de alambique apresentaram notável índice enzimático de atividade (IAE) em meio sólido. Dentre os isolados pré-selecionados, as leveduras apresentaram menor atividade celulásica em meio líquido, enquanto que dos isolados de solo de alambique, destacaram-se TE13 e T8a, por apresentarem maior atividade hidrolítica em cultivo líquido, contendo carboximetilcelulose. O TE13 foi o único micro-organismo a apresentar atividade na degradação da celobiose. No entanto, nenhum micro-organismo testado apresentou atividade FPase. A identificação molecular desses micro-organismos revelou que o isolado TE13 é pertencente ao gênero Aspergillus, enquanto que T8a foi identificado como pertencente ao gênero Penicillium. No estudo para avaliar a capacidade de produção de xilanases, nenhum dos micro-organismos testados mostrou resultados satisfatórios. Setenta micro-organismos foram selecionados por sua capacidade de assimilação da xilose, porém, apenas três mostraram capacidade de produção de etanol em níveis moderados. / Climate changes and the growing demand for energy have motivated an unprecedent number of studies for the production of fuels, particularly those from biorenewable sources. The work described herein is focused in the evaluation of biodiversity and bioprospection of Brazilian microorganisms able to produce cellulolytic enzymes and for the production of bioethanol. Two hundred thirty seven wild microorganisms were used for enzymatic studies, and four yeasts and 10 alambique soil isolates have shown significant levels of enzymatic activity in solid medium. Among the pre-selected strains, yeasts have shown lower levels of cellulosic activity in liquid medium, while the TE13 and T8a alambique soil isolates have shown good hydrolytic activity in liquid medium containing carboxymethylcellulose. TE13 was the only microorganism to present cellobiase activity. However, none of the microorganisms tested have displayed FPase activity. Molecular characterization of the microorganisms revealed that TE13 belongs to Aspergillus sp., while T8a was identified as Penicillium sp. In the xylanase activity studies, we were not able to achieve significant results with any of the microorganisms evaluated. Seventy microorganisms were selected by their ability to assimilate xylose, however, only three of them were able to produce ethanol in moderate levels.

O zebrafish (Danio rerio) é um modelo experimental consolidado em diversas áreas da ciência, como a neurociências e toxicologia. O genoma desta espécie já está quase todo seqüenciado e estudos demonstraram que muitos genes deste peixe são similares ao de mamíferos, incluindo a espécie humana. Evidências demonstram que nucleotídeos e nucleosídeos, principalmente o ATP e a adenosina exercem diversos efeitos sinalizadores no espaço extracelular. No sistema nervoso, o neurotransmissor ATP é armazenado de forma vesicular e liberado na fenda sináptica, onde pode agir em receptores específicos localizados na membrana celular denominados receptores purinérgicos do tipo P2. Estes receptores são subdivididos em receptores ionotrópicos P2X e receptores metabotrópicos P2Y. A inativação do sinal mediado pelo ATP extracelular é realizada por uma família de enzimas denominadas ecto-nucleotidases. Dentre este grupo de enzimas, destacam-se as NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e a ecto-5’-nucleotidase. Após sofrer catabolismo pelas ectonucleotidases, o neurotransmissor ATP é hidrolisado ao neuromodulador adenosina. Este nucleosídeo exerce seus efeitos através dos receptores metabotrópicos denominados purinoceptores P1. Estudos do nosso laboratório demonstraram a presença de ectonucleotidases como as NTPDases e a ecto-5’-nucleotidase no SNC de zebrafish. Além disso, já foi descrito na literatura que esta espécie apresenta purinoceptores do tipo P2X e P2Y. A acetilcolina é um neurotransmissor secretado pelos nervos colinérgicos terminais, juntamente com o ATP. Após exercido seu sinal nos receptores nicotínicos e muscarínicos, a acetilcolina é inativada pela ação de uma enzima denominada acetilcolinesterase (AChE), que hidrolisa a acetilcolina até colina e acetato. O gene da AChE já foi clonado e seqüenciado e esta atividade enzimática foi detectada em cérebro de zebrafish. O metanol é um composto neurotóxico responsável por sérios danos ao SNC. Além de ser encontrado como um contaminante ambiental, este álcool é também empregado como componente de soluções crioprotetoras para embriões de zebrafish. Os efeitos do consumo agudo de etanol exercem uma variedade de modificações como coordenação motora, percepção sensorial e cognição. O etanol promove diversas alterações bioquímicas e fisiológicas em células do sistema nervoso central. Portanto, nós investigamos o efeito in vitro e in vivo dos álcoois metanol e etanol sobre as ectonucleotidases e acetilcolinesterase em SNC de zebrafish. Após o tratamento agudo com metanol a 0,5 e 1,0% houve uma redução significativa na hidrólise de ATP e ADP. Entretanto, não foram verificadas alterações na atividade da ecto-5´-nucleotidase em cérebro de zebrafish. Uma inibição significativa na atividade da AChE foi observada na faixa de 0,25 a 1,0% de exposição ao metanol. Quatro seqüências de NTPDase foram identificadas através de uma análise filogenética, na qual uma é similar a NTPDase1 e as outras a NTPDase2. O metanol foi capaz de inibir os transcritos para a NTPDase1, duas isoformas da NTPDase2 e AChE. Metanol a 1,5 e 3,0% inibiu in vitro a hidrólise de ATP, e a hidrólise de ADP somente a 3,0%. No entanto, a hidrólise de AMP e a atividade da AChE não foram alteradas. A exposição ao etanol a 0,5 e 1,0% diminuiu a hidrólise de ATP e ADP, enquanto que a atividade da AChE apresentou um aumento significativo a 1,0%. Nenhuma alteração foi observada na atividade da ecto-5’- nucleotidase. Etanol in vitro a 0,5 e 1,0% não alterou a hidrólise de ATP, ADP e a atividade da AChE, mas a hidrólise de AMP foi inibida. Acetaldeído in vitro, na faixa de 0,5-1,0%, inibiu a hidrólise de ATP e ADP, mas a hidrólise de AMP e acetiltiocolina foi reduzida a 0,25, 0,5 e 1,0%. Acetato in vitro não alterou a atividade destas enzimas. O tratamento com etanol reduziu os níveis de mRNA para AChE, NTPDase1 as três isoformas de NTPDase2. Estes resultados demonstram que a intoxicação aguda por metanol e etanol pode influenciar as enzimas envolvidas na degradação dos neurotransmissores ATP e acetilcolina, sugerindo que os sistemas purinérgico e colinérgico podem ser alvos para os efeitos neurotóxicos destes álcoois. / Zebrafish (Danio rerio) is a consolidated model system in many research areas, including neuroscience and toxicology. The genome of this specie is almost sequenced and studies have shown that many genes of this specie are similar to mammals, including the human specie. Evidence has shown that nucleotides and nucleosides, mainly ATP and adenosine, exert extracellular signaling effects. In the nervous system, the neurotransmitter ATP is stored in vesicles and released in the synaptic cleft, where can act on specific cellular membrane receptors named purinergic P2 receptors. These receptors are subdivided on ionotropic P2X receptors and metabotropic P2Y receptors. The inactivation of ATP extracellular signaling is mediated by a family of enzymes named ectonucleotidases. This group of enzymes includes NTPDases (nucleoside triphosphate diphosphohydrolases) and ecto-5’-nucleotidase. After the catabolism promoted by ectonucleotidases, the neurotransmitter ATP is hydrolyzed to the neuromodulator adenosine. This nucleoside exerts its effects by the activation of P1 metabotropic receptors. Studies from our laboratory have demonstrated the presence of NTPDases and ecto-5’-nucleotidase in CNS of zebrafish. Furthermore, P2X and P2Y purinoceptors already are described in this specie. Acetylcholine (ACh) is a neurotransmitter secreted by the cholinergic nerve endings and ATP is co-released with ACh. After exerts its signaling on nicotinic e muscarinic receptors, ACh is inactivated through an enzyme named acetylcholinesterase (AChE), that can hydrolyze ACh into choline and acetate. The AChE gene is already cloned and sequenced and this enzyme activity was detected in zebrafish brain. Methanol is a neurotoxic compound responsible for serious damage on CNS. Besides it can be found as an environmental contaminant, this alcohol is also employed as a component of cryoprotector solutions for zebrafish embryos. The effects of acute ethanol consumption promote several changes related to motor coordination, sensory perception and cognition. Ethanol promotes many biochemical and physiological alterations on nervous cells. Therefore, we investigated the in vitro and in vivo effect of alcohols methanol and ethanol on ectonucleotidases and acetilcholinesterase in CNS of zebrafish. After acute treatment, there was a significant decrease of ATP and ADP hydrolysis at 0.5 and 1.0%. However, no significant alteration on ecto-5´-nucleotidase activity was verified in zebrafish brain. A significant inhibition on AChE activity was observed in the range of 0.25 to 1.0% methanol exposure. Four NTPDase sequences were identified from phylogenetic analyses, which one is similar to NTPDase1 and the others to NTPDase2. Methanol was able to inhibit NTPDase1, two isoforms of NTPDase2 and AChE transcripts. Methanol inhibited in vitro ATP hydrolysis at 1.5 and 3.0% and ADP hydrolysis only at 3.0%. Nevertheless, AMP hydrolysis and AChE activity were not changed. Ethanol exposure decreased ATP and ADP hydrolysis at 0.5 and 1.0%, while the AChE activity presented a significant increased at 1.0%. No changes on ecto-5’-nucleotidase activity were observed in zebrafish brain membranes. Ethanol in vitro did not alter ATP, ADP hydrolysis and AChE activity, but AMP hydrolysis was inhibited at 0.5 and 1.0%. Acetaldehyde in vitro, in the range 0.5-1.0%, inhibited ATP and ADP hydrolysis, but AMP and acetylthiocholine hydrolysis were reduced at 0.25, 0.5 and 1.0%. Acetate in vitro did not alter these enzyme activities. Semi-quantitative expression analysis of NTPDase and ecto-5´- nucleotidase was performed. Ethanol treatment reduced AChE, NTPDase1 and three isoforms of NTPDase2 mRNA levels. These results demonstrate that acute methanol and ethanol intoxication may influence the enzymes involved in the degradation of neurotransmitters ATP and ACh, suggesting that the purinergic and colinergic system can be a target to the neurotoxic effects of these alcohols.

O zebrafish (Danio rerio) é um modelo experimental consolidado em diversas áreas da ciência, como a neurociências e toxicologia. O genoma desta espécie já está quase todo seqüenciado e estudos demonstraram que muitos genes deste peixe são similares ao de mamíferos, incluindo a espécie humana. Evidências demonstram que nucleotídeos e nucleosídeos, principalmente o ATP e a adenosina exercem diversos efeitos sinalizadores no espaço extracelular. No sistema nervoso, o neurotransmissor ATP é armazenado de forma vesicular e liberado na fenda sináptica, onde pode agir em receptores específicos localizados na membrana celular denominados receptores purinérgicos do tipo P2. Estes receptores são subdivididos em receptores ionotrópicos P2X e receptores metabotrópicos P2Y. A inativação do sinal mediado pelo ATP extracelular é realizada por uma família de enzimas denominadas ecto-nucleotidases. Dentre este grupo de enzimas, destacam-se as NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e a ecto-5’-nucleotidase. Após sofrer catabolismo pelas ectonucleotidases, o neurotransmissor ATP é hidrolisado ao neuromodulador adenosina. Este nucleosídeo exerce seus efeitos através dos receptores metabotrópicos denominados purinoceptores P1. Estudos do nosso laboratório demonstraram a presença de ectonucleotidases como as NTPDases e a ecto-5’-nucleotidase no SNC de zebrafish. Além disso, já foi descrito na literatura que esta espécie apresenta purinoceptores do tipo P2X e P2Y. A acetilcolina é um neurotransmissor secretado pelos nervos colinérgicos terminais, juntamente com o ATP. Após exercido seu sinal nos receptores nicotínicos e muscarínicos, a acetilcolina é inativada pela ação de uma enzima denominada acetilcolinesterase (AChE), que hidrolisa a acetilcolina até colina e acetato. O gene da AChE já foi clonado e seqüenciado e esta atividade enzimática foi detectada em cérebro de zebrafish. O metanol é um composto neurotóxico responsável por sérios danos ao SNC. Além de ser encontrado como um contaminante ambiental, este álcool é também empregado como componente de soluções crioprotetoras para embriões de zebrafish. Os efeitos do consumo agudo de etanol exercem uma variedade de modificações como coordenação motora, percepção sensorial e cognição. O etanol promove diversas alterações bioquímicas e fisiológicas em células do sistema nervoso central. Portanto, nós investigamos o efeito in vitro e in vivo dos álcoois metanol e etanol sobre as ectonucleotidases e acetilcolinesterase em SNC de zebrafish. Após o tratamento agudo com metanol a 0,5 e 1,0% houve uma redução significativa na hidrólise de ATP e ADP. Entretanto, não foram verificadas alterações na atividade da ecto-5´-nucleotidase em cérebro de zebrafish. Uma inibição significativa na atividade da AChE foi observada na faixa de 0,25 a 1,0% de exposição ao metanol. Quatro seqüências de NTPDase foram identificadas através de uma análise filogenética, na qual uma é similar a NTPDase1 e as outras a NTPDase2. O metanol foi capaz de inibir os transcritos para a NTPDase1, duas isoformas da NTPDase2 e AChE. Metanol a 1,5 e 3,0% inibiu in vitro a hidrólise de ATP, e a hidrólise de ADP somente a 3,0%. No entanto, a hidrólise de AMP e a atividade da AChE não foram alteradas. A exposição ao etanol a 0,5 e 1,0% diminuiu a hidrólise de ATP e ADP, enquanto que a atividade da AChE apresentou um aumento significativo a 1,0%. Nenhuma alteração foi observada na atividade da ecto-5’- nucleotidase. Etanol in vitro a 0,5 e 1,0% não alterou a hidrólise de ATP, ADP e a atividade da AChE, mas a hidrólise de AMP foi inibida. Acetaldeído in vitro, na faixa de 0,5-1,0%, inibiu a hidrólise de ATP e ADP, mas a hidrólise de AMP e acetiltiocolina foi reduzida a 0,25, 0,5 e 1,0%. Acetato in vitro não alterou a atividade destas enzimas. O tratamento com etanol reduziu os níveis de mRNA para AChE, NTPDase1 as três isoformas de NTPDase2. Estes resultados demonstram que a intoxicação aguda por metanol e etanol pode influenciar as enzimas envolvidas na degradação dos neurotransmissores ATP e acetilcolina, sugerindo que os sistemas purinérgico e colinérgico podem ser alvos para os efeitos neurotóxicos destes álcoois. / Zebrafish (Danio rerio) is a consolidated model system in many research areas, including neuroscience and toxicology. The genome of this specie is almost sequenced and studies have shown that many genes of this specie are similar to mammals, including the human specie. Evidence has shown that nucleotides and nucleosides, mainly ATP and adenosine, exert extracellular signaling effects. In the nervous system, the neurotransmitter ATP is stored in vesicles and released in the synaptic cleft, where can act on specific cellular membrane receptors named purinergic P2 receptors. These receptors are subdivided on ionotropic P2X receptors and metabotropic P2Y receptors. The inactivation of ATP extracellular signaling is mediated by a family of enzymes named ectonucleotidases. This group of enzymes includes NTPDases (nucleoside triphosphate diphosphohydrolases) and ecto-5’-nucleotidase. After the catabolism promoted by ectonucleotidases, the neurotransmitter ATP is hydrolyzed to the neuromodulator adenosine. This nucleoside exerts its effects by the activation of P1 metabotropic receptors. Studies from our laboratory have demonstrated the presence of NTPDases and ecto-5’-nucleotidase in CNS of zebrafish. Furthermore, P2X and P2Y purinoceptors already are described in this specie. Acetylcholine (ACh) is a neurotransmitter secreted by the cholinergic nerve endings and ATP is co-released with ACh. After exerts its signaling on nicotinic e muscarinic receptors, ACh is inactivated through an enzyme named acetylcholinesterase (AChE), that can hydrolyze ACh into choline and acetate. The AChE gene is already cloned and sequenced and this enzyme activity was detected in zebrafish brain. Methanol is a neurotoxic compound responsible for serious damage on CNS. Besides it can be found as an environmental contaminant, this alcohol is also employed as a component of cryoprotector solutions for zebrafish embryos. The effects of acute ethanol consumption promote several changes related to motor coordination, sensory perception and cognition. Ethanol promotes many biochemical and physiological alterations on nervous cells. Therefore, we investigated the in vitro and in vivo effect of alcohols methanol and ethanol on ectonucleotidases and acetilcholinesterase in CNS of zebrafish. After acute treatment, there was a significant decrease of ATP and ADP hydrolysis at 0.5 and 1.0%. However, no significant alteration on ecto-5´-nucleotidase activity was verified in zebrafish brain. A significant inhibition on AChE activity was observed in the range of 0.25 to 1.0% methanol exposure. Four NTPDase sequences were identified from phylogenetic analyses, which one is similar to NTPDase1 and the others to NTPDase2. Methanol was able to inhibit NTPDase1, two isoforms of NTPDase2 and AChE transcripts. Methanol inhibited in vitro ATP hydrolysis at 1.5 and 3.0% and ADP hydrolysis only at 3.0%. Nevertheless, AMP hydrolysis and AChE activity were not changed. Ethanol exposure decreased ATP and ADP hydrolysis at 0.5 and 1.0%, while the AChE activity presented a significant increased at 1.0%. No changes on ecto-5’-nucleotidase activity were observed in zebrafish brain membranes. Ethanol in vitro did not alter ATP, ADP hydrolysis and AChE activity, but AMP hydrolysis was inhibited at 0.5 and 1.0%. Acetaldehyde in vitro, in the range 0.5-1.0%, inhibited ATP and ADP hydrolysis, but AMP and acetylthiocholine hydrolysis were reduced at 0.25, 0.5 and 1.0%. Acetate in vitro did not alter these enzyme activities. Semi-quantitative expression analysis of NTPDase and ecto-5´- nucleotidase was performed. Ethanol treatment reduced AChE, NTPDase1 and three isoforms of NTPDase2 mRNA levels. These results demonstrate that acute methanol and ethanol intoxication may influence the enzymes involved in the degradation of neurotransmitters ATP and ACh, suggesting that the purinergic and colinergic system can be a target to the neurotoxic effects of these alcohols.

As mudanças climáticas, aliadas às necessidades estratégicas de produção de energia, têm motivado uma corrida sem precedentes à produção de combustíveis alternativos, preferencialmente de fontes renováveis. Em vista disso, o presente trabalho visou avaliar a biodiversidade e realizar a bioprospecção de micro-organismos provenientes de diversos ambientes florestais brasileiros e selecionar micro-organismos capazes de produção de enzimas do complexo celulolítico e sua capacidade para a produção de bioetanol. Duzentos e trinta e sete micro-organismos silvestres foram utilizados para os testes de atividade enzimática, quatro linhagens de leveduras e 10 isolados de solo de alambique apresentaram notável índice enzimático de atividade (IAE) em meio sólido. Dentre os isolados pré-selecionados, as leveduras apresentaram menor atividade celulásica em meio líquido, enquanto que dos isolados de solo de alambique, destacaram-se TE13 e T8a, por apresentarem maior atividade hidrolítica em cultivo líquido, contendo carboximetilcelulose. O TE13 foi o único micro-organismo a apresentar atividade na degradação da celobiose. No entanto, nenhum micro-organismo testado apresentou atividade FPase. A identificação molecular desses micro-organismos revelou que o isolado TE13 é pertencente ao gênero Aspergillus, enquanto que T8a foi identificado como pertencente ao gênero Penicillium. No estudo para avaliar a capacidade de produção de xilanases, nenhum dos micro-organismos testados mostrou resultados satisfatórios. Setenta micro-organismos foram selecionados por sua capacidade de assimilação da xilose, porém, apenas três mostraram capacidade de produção de etanol em níveis moderados. / Climate changes and the growing demand for energy have motivated an unprecedent number of studies for the production of fuels, particularly those from biorenewable sources. The work described herein is focused in the evaluation of biodiversity and bioprospection of Brazilian microorganisms able to produce cellulolytic enzymes and for the production of bioethanol. Two hundred thirty seven wild microorganisms were used for enzymatic studies, and four yeasts and 10 alambique soil isolates have shown significant levels of enzymatic activity in solid medium. Among the pre-selected strains, yeasts have shown lower levels of cellulosic activity in liquid medium, while the TE13 and T8a alambique soil isolates have shown good hydrolytic activity in liquid medium containing carboxymethylcellulose. TE13 was the only microorganism to present cellobiase activity. However, none of the microorganisms tested have displayed FPase activity. Molecular characterization of the microorganisms revealed that TE13 belongs to Aspergillus sp., while T8a was identified as Penicillium sp. In the xylanase activity studies, we were not able to achieve significant results with any of the microorganisms evaluated. Seventy microorganisms were selected by their ability to assimilate xylose, however, only three of them were able to produce ethanol in moderate levels.

Cada vez mais a busca por fontes de energia renováveis tem se intensificado. Isto não somente pela preocupação ambiental, mas também devido aos combustíveis fósseis serem limitados. Desta forma, o etanol de segunda geração (bioetanol) tem chamado a atenção por ser uma fonte de energia pouco poluente e que pode ser obtida a partir de resíduos agroindustriais. Resíduos lignocelulósicos agroindustriais, como a casca de arroz, são fontes abundantes e de baixo custo para produção biotecnológica de compostos de alto valor agregado. Esse processo biotecnológico tem o objetivo de promover o aproveitamento completo das frações celulósica (contém hexoses) e hemicelulósica (rica em pentoses) dos resíduos lignocelulósicos, para a obtenção de commodities. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade de conversão de hexoses e pentoses pela levedura Spathaspora arborariae, descrita recentemente como boa conversora de pentoses a etanol. Cultivos sobre meio semissintético e hidrolisado de casca de arroz, a 180 rpm e 28oC, foram realizados em agitador orbital utilizando frascos Erlemmeyers, utilizando leveduras fermentadoras de hexoses e pentoses, como Saccharomyces cerevisiae, Candida shehatae, Pichia stipitis e Spathaspora arborariae, respectivamente, em cultivos isolados e em co-cultivo. As cepas testadas isoladamente apresentaram valores de produtividade de etanol (YP/S) entre 0,35 e 0,46 g g-1, enquanto que o rendimento dos co-cultivos variou de 0,30 e 0,77 g g-1 de etanol, sobre ambos os susbstratos. Também foram realizados ensaios em frascos agitados em aerobiose (180 rpm) e anaerobiose (100 rpm) a 28oC utilizando como meio de cultura com diferentes açúcares individualmente (glicose, xilose ou arabinose). O cultivo realizado em anaerobiose, utilizando glicose como substrato foi o que apresentou maior índices de conversão de etanol (Y P/S) 0,26 g g-1. Cultivos foram conduzidos em biorreatores submersos utilizando S. arborariae sobre meio semissintético, contendo glicose e xilose, em condições anaeróbicas (150 rpm), aeróbicas (400 rpm e 2 vvm; 150 rpm e 0,5 vvm) e microaerofilia (180 rpm e 0,33 vvm). O maior rendimento de etanol foi obtido no cultivo anaeróbico com Y P/S=0,52 g g-1. / It is increasing the search for renewable energy sources due to environmental concerns and the possibility of fossil fuels shortage in the near future. Thus, the second generation ethanol (bioethanol) has drawn attention for being a renewable energy source and can be obtained from organic residues. Lignocellulosic agroindustrial residues such as rice hulls are abundant resources and have a low cost for the biotechnological production of compounds of high added value. This biotechnological process aims to promote the full exploitation of the cellulose fractions (containing hexoses) and hemicellulose (rich in pentoses) of lignocellulosic wastes to obtain commodities such as ethanol. This study aimed at studying the capability of the yeast Spathaspora arborariae, recently discovered, of converting hexoses and pentoses into ethanol. Cultures on semi synthetic medium and hydrolyzed rice hull at 180 rpm and 28oC, were performed in shaker, using fermenting yeast hesoxes and pentoses such as Saccharomyces cerevisiae, Candida shehatae, Pichia stipitis and Spathaspora arborariae, either isolated or in co-cultivations. The strains tested alone showed values of ethanol yields (YP/S) between 0.35 and 0.46 g g-1, while the yield of co-cultures varied from 0.30 to 0.77 g g-1 ethanol on both substrates. Experiments were also carried out in shake flasks under aerobic conditions (180 rpm) and anaerobic (100 rpm) at 280C using culture medium with different sugars individually (glucose, xylose, or arabinose). The yeasts cultivated in anaerobic conditions using glucose as substrate showed the highest ethanol yields (YP/S) 0.26 g g-1. Cultures were conducted in submerged bioreactors using S. arborariae on semi-synthetic medium containing glucose and xylose under anaerobic conditions (150 rpm), aerobic (400 rpm and 2 vvm, 150 rpm and 0.5 vvm) and micro-aerobiosis (180 rpm and 0.33 vvm). The highest ethanol yield was obtained in anaerobic cultivation with YP/S = 0.52 g g-1.

Este trabalho teve como objetivo avaliar a reação de transesterificação pelo método “Transesterification Double Step Process” (TDSP) modificado usando como insumos óleo de soja, catalisadores homogêneos e mistura etanol/metanol nas proporções v/v (50:50, 75:25, 90:10). Devido às diferenças de temperatura da reação de síntese do biodiesel metílico (80 °C) e etílico (60 °C), variou-se a temperatura da reação na síntese de biodiesel etílico/metílico utilizando uma mistura de álcoois de 50:50 v/v, de modo a determinar as melhores temperaturas de trabalho. Os demais experimentos foram realizados na melhor condição de ensaio (60 °C). O teor de ésteres obtido em cada caso, inicialmente foi analisado por 1HRMN e posteriormente pela técnica cromatográfica oficial via GC-FID. Segundo a análise por 1HRMN os graus de conversão foram satisfatórios e não apresentaram diferenças significativas quando as proporções iniciais etanol/metanol na reação eram variadas. Os valores obtidos foram de 97,9±0,8% para a proporção 50:50, 97,6±0,6% para a proporção 75:25 e 98,6±0,5% para a proporção 90:10 (etanol: metanol, v/v). Os rendimentos apresentaram valores igualmente altos: 94,4±0,4% (αBD50/50); 96,2±1,4% (αBD75/25) e 94,6±0,6% (αBD90/10). Já a análise cromatográfica não mostrou resultados satisfatórios para a análise dos ésteres e do diacilglicerol. Para a determinação dos teores de gliceróis livres e totais, bem como de monoacilgliceróis e triacilgliceróis, a análise cromatográfica revelou valores estabelecidos pela ANP. A análise qualitativa por GC-MS foi bem sucedida, permitindo a identificação dos ésteres obtidos, bem como tendências proporcionais aos graus obtidos por HRMN. Dos ensaios dos parâmetros de qualidade dos biodieseis (massa específica a 20 °C, viscosidade cinemática a 40 °C, teor de água, ponto de fulgor, resíduo de carbono, enxofre total, sódio e potássio, cálcio e magnésio, corrosividade ao cobre (3h a 50 °C), quantidade de metanol e/ou etanol, índice de iodo e estabilidade a oxidação a 110 °C), somente acusaram resultados fora das especificações da ANP, os parâmetros de enxofre total e teor de água. O conjunto de dados obtidos permite inferir que estudos de aperfeiçoamento da técnica de transesterificação pelo método TDSP modificado são necessários, bem como o desenvolvimento de métodos cromatográficos para análise de ésteres totais de biodieseis etílico/metílico. / The present work aimed the evaluation of the transesterification reaction carried out by a modified Double Step Process (TDSP) using soybean oil, homogeneous catalysts and mixtures ethanol/methanol (50:50, 75:25 and 90:10 v/v). Due to the temperature differences between the methyl biodiesel (80 °C) and the ethyl biodiesel (60 °C) reaction, experiments were carried out at varying temperatures for the ethyl/methyl biodiesel using a mixture of alcohols 50:50 v/v, in order to establish the best work temperature. The remaining experiments were carried out at the best working condition (60 °C). The ester content, in each case, was initially analyzed by 1HNMR and afterwards by the official chromatographic technique in GC-FID way. According to the 1HNMR analysis the obtained conversion degrees were satisfactory and do not presented significant differences when the starting ethanol/methanol proportion was varied. The conversion factor was 97.9±0.8% for 50:50 v/v, 97.6±0.6% for 75:25v/v and 98.6±0.5% for 90:10 v/v. The yields were also high: 94.4±0.4% (αBD50/50); 96.2±1.4% (αBD75/25) e 94.6±0.6% (αBD90/10). On the other hand, the chromatographic analysis did not show satisfactory results for the esters and diacylglycerol analyses. The chromatographic analysis of free and to-tal glycerols as well as monoacylglycerols and triacylglycerols results in the values esta-blished by ANP. The quantitative analysis by CG-MS was well succeeded allowing the identification of the obtained esters as well as tendencies proportional to the degrees which resulted from HNMR. Among the biodiesel quality parameters (specific gravity at 20 °C, kinematic viscosity at 40 °C, water content, flash point, carbon residue, total sulfur, sodium and potassium, calcium and magnesium, corrosivity to copper (3h at 50 °C), amount of methanol and/or ethanol, iodine index and stability to oxidation at 110 °C), only the values of total sulfur and water content were outside the ANP specifications. The obtained data allow to conclude that the improvements in the transesterification technique by TDSP method are necessary as well as the development of chromatographic methods of analysis of ethylic/methylic biodiesel total esters.

Este trabalho teve por objetivo avaliar a destilação de misturas hidroalcoólicas em um destilador piloto, constituído em formato híbrido, possuindo pratos e recheio nas seções de esgotamento e retificação, respectivamente. O estudo se aplica ao caso da produção de etanol em pequena escala em microdestilarias, que carecem de rendimentos maiores na etapa de destilação. As etapas desenvolvidas nessa pesquisa compreenderam o levantamento de informações técnicas de microdestilarias, a simulação do processo de destilação, o estudo da influência dos componentes do óleo fúsel na separação etanol-água, o projeto, construção e pré-operação de um destilador piloto, além do estudo de viabilidade econômica preliminar da tecnologia proposta. As simulações foram realizadas no software iiSE (VRTech) e envolveram três casos distintos quanto à composição da alimentação e quanto aos equipamentos. Na análise experimental da influência do óleo fúsel, misturas de etanol (6,0 a 6,5 % em massa) e água (93,0 a 94 % em massa) contendo diferentes concentrações (zero a 0,5 % em massa) de 3-metil-1-butanol, 2-metilpropan-1-ol, propan-1-ol e propan-2-ol foram destilados em um destilador de bancada. O dimensionamento considerou diferentes correlações empíricas aplicadas para as seções de esgotamento e de retificação. A análise de viabilidade econômica considerou o cenário atual da produção de etanol em pequena escala e também avaliou a competitividade do etanol hidratado combustível (EHC) produzido frente a variações no preço da matéria-prima e também na tecnologia de destilação. As simulações realizadas demonstraram que a concentração máxima de EHC obtida em uma única coluna de destilação, na presença de alcoóis superiores na alimentação, foi 91,5 % em massa, necessitando de uma elevada razão de refluxo (6,0). Assim, a obtenção de EHC com concentração acima de 92,5 % em massa, em conformidade com a legislação, só foi possível utilizando-se duas colunas de destilação. Os resultados em refluxo total demonstraram a possibilidade de obtenção de EHC acima de 92,5 % em massa. A concentração desejada não foi obtida durante a operação contínua, mesmo na ausência dos alcoóis superiores. Todos os experimentos resultaram em elevada perda de etanol no produto de fundo, decorrente de condições operacionais diferenciadas. Os resultados demonstram que há interferência dos componentes do óleo fúsel na destilação, porém não comprometendo a separação etanol-água. A análise de viabilidade econômica mostrou a competitividade do EHC produzido em pequena escala e também que a nova tecnologia proposta favorece a redução do custo final do EHC. Foi realizada a prova de conceito do destilador piloto, buscando-se a obtenção de dados operacionais de acordo com os parâmetros de qualidade previamente definidos. Os melhores resultados foram obtidos utilizando-se oito pratos e recheio do tipo IMTP®, nas seções de esgotamento e retificação, respectivamente. Os resultados comprovaram a eficácia e a viabilidade técnica do sistema de destilação proposto, além de seu potencial de utilização na produção de etanol em pequena escala. / This study aimed to evaluate distillation of ethanol-water mixtures in a pilot distiller set up on hybrid format, with trays and packing in striping and rectification sections, respectively. The study applies to the case of ethanol production on small scale, which demands higher yields on distillation operation. Steps developed in this study comprised a survey of technical information for small-scale ethanol production, the simulation of the distillation process, the study on influence of fusel oil components in ethanol-water separation, evaluation of correlations applied to design of distillation columns and design, construction, and pre-operation tests of a pilot distiller. Simulations were performed in iiSE software (VRTech) and involved three cases differentiated in relation to the composition of feed and equipment configuration. In experimental analysis of fusel oil influence, ethanol (from 6.0 to 6.5 %w/w) and water (93.0 to 94 %w/w) containing different concentrations (zero to 0.5 %w/w) 3-methyl-1-butanol, 2- methylpropan-1-ol, propan-1-ol and propan-2-ol were distilled in a bench distiller. Design considered different empirical correlations applied to striping and rectification sections. Economic feasibility analysis considered the current scenario of small scale ethanol production and evaluated the competitiveness of hydrous ethanol fuel (HEF) considering fluctuations in the feedstock price and two distillation technologies. Simulations showed that HEF maximum concentration obtained in a single distillation column in the presence of higher alcohols in the feed was 91.5 %w/w, requiring a high reflux ratio (6.0). Therefore, obtaining HEF concentration up to 92.5 %w/w in accordance with legislation, was possible only using two distillation columns. Experimental results for total reflux demonstrated the possibility of obtaining HEF above 92.5% by mass. The desired concentration was not achieved during continuous operation, even in the absence of higher alcohols. All experiments resulted in high loss of ethanol in the bottom product, due to different operating conditions. Results demonstrate that there is no interference of fusel oil components to the point of preventing ethanol-water separation in accordance with legislation. Economic feasibility analysis showed the competitiveness of HEF produced on small scale and also that the new proposed technology reduced the final cost of the HEF. A proof of concept was performed to obtain operational data according to quality standards defined previously. Best results were obtained by using eight trays and IMTP® packing in stripping and rectification sections, respectively. Results confirmed effectiveness and technical viability of the system proposed, in addition of its potential of being used in ethanol production on small scale.

Made available in DSpace on 2014-06-12T17:21:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6614_1.pdf: 808486 bytes, checksum: 1621b512bbfaf363de68133e608ef1c8 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / O mundo passa por um momento de transição em suas Matrizes Energéticas, com uma inexorável tendência de reposicionamento de consumo, com claras evidências de que o consumidor do terceiro milênio passe a privilegiar as energias limpas, sobretudo face aos perversos efeitos do aquecimento do planeta, em muito derivados da presença, constante, do maléfico, efeito estufa. Por conseguinte, face as suas dimensões territoriais, e, por nossa tradição de eficiência em agricultura tropical (agroenergia), sabemos que o Brasil pode liderar a nova ordem das Energias do Planeta, até porque já utiliza 46% de energias renováveis, sendo cerca de 29% a partir da biomassa e aproximadamente 15% de fontes hidráulicas, bem como 2% de outras. Além do mais o País foi Pioneiro, com o PROÁLCOOL em 1975 (novembro de 1975), na utilização do etanol de cana-de-açúcar em finalidades automotoras, consolidando nessas três décadas um grande conhecimento acumulado na produção de energias com origem no sol, na terra e no consumo racional da água. Atualmente, só o Brasil consegue obter até 8.000 litros de etanol de cana por hectare cultivado, assim como até 80 kw por hora de Bioeletricidade por tonelada de bagaço de cana, gerando-se por conseqüência Externalidades Ambientais, totalmente em linha com as matrizes requeridas pelas Conferências Internacionais do clima