Les protéines membranaires représentent environ 2/3 des cibles thérapeutiques. Le développement de nouveaux médicaments est toutefois limité par l'absence de données structurales pour de nombreuses protéines. Les protéines membranaires s'avèrent en effet difficiles à manipuler et à maintenir en solution ce qui complique leur étude structurale. Les protéines sont en général solubilisées grâce à des surfactants comme les détergents, les amphipols, les hémifluorés et les peptergents. Il est aussi possible de les étudier dans des conditions plus physiologiques en les insérant dans des membranes lipidiques telles que des liposomes, des bicelles, ou des nanodisques.Les nanodisques sont des particules protéolipidiques autoassemblées, composées de protéines d'assemblages et de lipides, qui constituent un système de membranes modèles très prometteur permettant de solubiliser des protéines membranaires dans un milieu dépourvu de détergent. D'autres avantages sont aussi la variabilité de la constitution en lipides et l'accessibilité des deux côtés de la membrane.Dans le cadre de ma thèse, j'ai mis au point l'insertion de plusieurs protéines membranaires en nanodisques afin de permettre leur caractérisation fonctionnelle, biophysique et structurale. Nous avons en particulier étudié le transporteur ABC BmrA impliqué dans la résistance aux antibiotiques et cherché à identifier les changements conformationnels de la protéine en nanodisques par microscopie électronique. Les interactions de la protéine YedZ, un homologue de NADPH oxydases, avec ses partenaires solubles potentiels ont été étudiés par différentes méthodes telles que le pontage chimique, la résonance plasmonique de surface et la spectrométrie de masse native. En parallèle, le mécanisme d'assemblage des nanodisques a été investigué. Une interaction entre les protéines d'assemblages et des cations divalents a été mise en évidence. Cette interaction a un effet sur l'oligomérisation de la protéine d'assemblage mais également sur l'homogénéité des nanodisques. Ces observations nous ont permis d'améliorer les conditions de préparation des nanodisques, condition déterminante pour le succès de nombreuses approches structurales. Nous avons pu en particulier explorer la possibilité de cristalliser ces particules en vue d'études cristallographiques. / Membrane proteins represent around 2/3 of therapeutic targets. However, the development of new drugs is hampered by the lack of structural data for many proteins. Membrane proteins are indeed difficult to handle and to maintain stable in solution, which complicates their study by structural methods. Proteins are usually stabilized by surfactants like detergents, amphipols, hemifluorinated compounds and peptergents. It is also possible to study those proteins in an environment mimicking their native conditions by incorporating them in lipid membranes such as liposomes, bicelles or nanodiscs.Nanodiscs are self-assembled proteolipidic particles, composed of a scaffold protein and lipids. This technology is a top-notch model membrane system, which provides a detergent free environment to study membrane proteins in solution. Further advantages are the possibility to vary the lipid composition and the accessibility of the incorporated protein from both sides of the membrane.During my PhD project, I have achieved the insertion of several membrane proteins into nanodiscs for functional, biophysical and structural characterizations. In particular, we have studied Bmra, an ABC transporter involved in multidrug resistance and tried to identify the conformational changes of the protein in nanodiscs by electron microscopy. The interaction of YedZ, a NADPH oxidase homologue, with potential soluble partners has been studied by various methods such as cross-linking, surface plasmon resonance and native mass spectrometry. In parallel, the mechanism of nanodiscs assembly has been investigated. An interaction between the scaffold protein and divalent cations has been revealed. This interaction influences the oligomerization of the scaffold protein but also the nanodiscs homogeneity. Those observations allowed us to improve the preparation of the nanodiscs, which was an essential step torward the success of many structural approaches. In particular, we were able to explore their accessibility to protein crystallography.

Cette thèse porte sur l'étude du processus de cristallisation de verres et l'élaboration de vitrocéramiques transparentes dans le visible. Ce travail a permis d'élaborer plusieurs vitrocéramiques complètement cristallisées et transparentes, ce qui constitue un résultat exceptionnel pour ce type de matériaux qui perd habituellement la transparence lors de la cristallisation. Ces matériaux originaux et novateurs ont fait l'objet d'un brevet sur des "Céramiques transparentes" (dépôt en France N° 1161025 et extension internationale PCT N° EP2012/074171) et de plusieurs articles (cf. page 162). Plusieurs verres dans les systèmes oxydes de terres rares-oxydes d'alcalino-terreux-Al2O3-SiO2 ont été élaborés au moyen d'un lévitateur aérodynamique couple a un chauffage par laser puis étudiés. Une recherche de la composition optimale du verre d'aluminosilicate d'yttrium parent qui permettrait d'avoir un maximum de cristaux de YAG sans formation d'impuretés lors de la cristallisation a été menée. L'étude de la cristallisation du YAG a partir des verres d'aluminosilicates d'yttrium choisis, réalisée principalement par RMN et diffraction des rayons X, a montré que les ions de silicium initialement présents dans la matrice vitreuse se trouvent incorporés dans les cristaux de YAG formes, en substitution des ions d'aluminium des sites tétraédriques. Les conséquences structurales de cette incorporation dans le YAG ont été étudiées. En particulier, la réduction de la maille cubique du YAG et des liaisons des sites tétraédriques a été mise en évidence par DRX et affinement Rietveld. Par RMN, la présence d'aluminium en coordinence IV, V et VI a été détectée dans le verre parent. Pour ce système, il est remarquable que la cristallisation du verre d'aluminate d'yttrium puisse avoir lieu au-dessous de sa température de transition vitreuse. Ce phénomène rarement rapporté pourrait être expliqué par la tendance élevée du verre à cristalliser et par la capacité de Si4+ à s'incorporer dans les cristaux de YAG comme cette étude le démontre. L'avancement de la cristallisation par recuit du verre au-dessous de Tg a été suivi ainsi que l'absorbance et la diffusion de l'irradiation IR par les vitrocéramiques en se basant sur le modèle de Rayleigh-Guns-Debye. Cette étude a révélé l'influence de la différence de l'indice de réfraction entre le verre et les cristaux sur la diffusion de la lumière. Les images MET et MEB de ces vitrocéramiques montrent des cristaux de YAG de tailles comprises entre 500 nm et 1300 nm. La cristallisation d'une autre famille de verres de terres rares a été étudiée. Il s'agit de verres d'aluminate de lanthane et de borate de lanthane. Dans les deux cas, une cristallisation démarrant à partir de la surface a été observée et étudiée. La cristallisation des phases LaAlO3 et LaBO3 dans ces verres a été suivie par DRX (Haute Température). L'ajout de SiO2 à la composition La2O3-Al2O3 a été nécessaire pour élaborer un verre avec un four classique. Une étude de cristallisation poussée a été également menée sur de nouveaux verres d'aluminates d'alcalinoterreux. Cette étude a compris une caractérisation des vitrocéramiques formées ainsi que la résolution de la structure de deux nouveaux polymorphes de BaAl4O7 formés par cristallisation des verres en se servant de la diffraction électronique, neutronique et synchrotron. Une étude par RMN de l'évolution de l'environnement de l'oxygène durant le recuit a été réalisée et a permis de mettre en évidence la présence des entités d'oxygène tri-coordinées dans les verres d'aluminate de baryum. Ce travail nous a finalement permis d'élaborer plusieurs vitrocéramiques complètement cristallisées et transparentes, ce qui constitue un résultat exceptionnel. La luminescence de ces vitrocéramiques a été caractérisée et les raisons de leur transparence sont discutées à la lumière de leurs microstructures.

L'hydrolyse de l'ATP en ADP constitue la principale source d'énergie de la cellule. Le transport de ce nucléotide depuis son lieu de synthèse vers le cytosol est essentiel pour la plupart des réactions métaboliques et nécessite un passage à travers les membranes. Ainsi, un grand nombre de transporteurs d'ATP/ADP sont présents dans les différents organites tels que les mitochondries, les chloroplastes, et autres types de plastides mais aussi chez les bactéries pathogènes (Rickettsia prowazekii, Protoclamydiae amoebophila) (Trentmann et al, 2007).L'équipe s'intéresse principalement à 2 types de transporteurs d'ADP et d'ATP, la famille des transporteurs mitochondriaux (MCF) et la famille des NTT (plastes et bactéries). Malgré des fonctions similaires, ces 2 familles de transporteurs possèdent des propriétés biochimiques et structurales différentes. De nos jours, il n'existe aucune information structurale disponible sur la famille des NTTs. La détermination de cette structure pourrait permettre de comprendre le mécanisme de transport de ces transporteurs mais plus généralement comprendre le transport de l'ATP et ADP dans les cellules.Une étude a été initiée sur la structure et la fonction de la famille des NTT plus particulièrement des transporteurs chloroplastiques d'Arabidopsis thaliana mais aussi des transporteurs bactériens. Toutefois, ma thèse concerne principalement les transporteurs chloroplastiques NTT1 et NTT2. Ces 2 isoformes sont localisées dans la membrane interne des chloroplastes et permettent de pourvoir le stroma en ATP lorsque la photosynthèse ne peut pas avoir lieu par manque de lumière.Nous avons déterminé et optimisé les conditions de surexpression des 2 isoformes dans un système hétérologue puis de purification en détergent). Nous avons mis au point des méthodes permettant de caractériser le transporteur en solution et de mesurer son activité dans le but d'aboutir à une étude structurale. Des pistes de cristallisation ont également étaient obtenues. / ATP is the main energy currency in the cell and its transport across membranes is essential for most of the metabolic reactions. A large number of ATP/ADP transporters are present in the different cell organelles such as mitochondria, chloroplasts, other types of plastids and some are also found in bacteria (Rickettsia prowazekii, Protoclamydiae amoebophila) (Trentmann et al, 2007). The team is mainly interested in two distinct transporters families, the mitochondrial carrier family (MCF) and the NTT family. Despite similar function, mitochondrial ADP/ATP transporters (Pebay-Peyroula et al, 2003) and NTT proteins exhibit different structural and biochemical properties. To date no structural information is available on the NTT family. The determination of a structure would help for understanding the transport mechanism of these carriers and more generally the different mechanisms of the transport of ADP and ATP within the cell.We initiated a structure-function study on the NTT family focusing on chloroplast transporters from Arabidopsis thaliana and also from bacteria. My thesis is focused on chloroplast NTT1 and NTT2. These isoforms are localized in the inner membrane of chloroplast. They transport ATP inside the chloroplast in order to supply the different reactions occurring in the stroma when the photosynthesis does not occur.We have determined and optimized conditions to overexpress these 2 isoforms in heterologous systems and to purify the protein in detergents. We have also set up tools to characterize the carrier in solution and to measure its transport activity opening the way to functional and structural studies. We obtained promising crystallization hits.

Cette thèse porte sur l’étude du processus de cristallisation de verres et l’élaboration de vitrocéramiques transparentes dans le visible. Ce travail a permis d’élaborer plusieurs vitrocéramiques complètement cristallisées et transparentes, ce qui constitue un résultat exceptionnel pour ce type de matériaux qui perd habituellement la transparence lors de la cristallisation. Ces matériaux originaux et novateurs ont fait l’objet d’un brevet sur des "Céramiques transparentes" (dépôt en France N° 1161025 et extension internationale PCT N° EP2012/074171) et de plusieurs articles (cf. page 162). Plusieurs verres dans les systèmes oxydes de terres rares-oxydes d’alcalino-terreux-Al2O3-SiO2 ont été élaborés au moyen d’un lévitateur aérodynamique couple a un chauffage par laser puis étudiés. Une recherche de la composition optimale du verre d’aluminosilicate d’yttrium parent qui permettrait d’avoir un maximum de cristaux de YAG sans formation d’impuretés lors de la cristallisation a été menée. L’étude de la cristallisation du YAG a partir des verres d’aluminosilicates d’yttrium choisis, réalisée principalement par RMN et diffraction des rayons X, a montré que les ions de silicium initialement présents dans la matrice vitreuse se trouvent incorporés dans les cristaux de YAG formes, en substitution des ions d’aluminium des sites tétraédriques. Les conséquences structurales de cette incorporation dans le YAG ont été étudiées. En particulier, la réduction de la maille cubique du YAG et des liaisons des sites tétraédriques a été mise en évidence par DRX et affinement Rietveld. Par RMN, la présence d’aluminium en coordinence IV, V et VI a été détectée dans le verre parent. Pour ce système, il est remarquable que la cristallisation du verre d’aluminate d’yttrium puisse avoir lieu au-dessous de sa température de transition vitreuse. Ce phénomène rarement rapporté pourrait être expliqué par la tendance élevée du verre à cristalliser et par la capacité de Si4+ à s’incorporer dans les cristaux de YAG comme cette étude le démontre. L’avancement de la cristallisation par recuit du verre au-dessous de Tg a été suivi ainsi que l’absorbance et la diffusion de l’irradiation IR par les vitrocéramiques en se basant sur le modèle de Rayleigh-Guns-Debye. Cette étude a révélé l’influence de la différence de l’indice de réfraction entre le verre et les cristaux sur la diffusion de la lumière. Les images MET et MEB de ces vitrocéramiques montrent des cristaux de YAG de tailles comprises entre 500 nm et 1300 nm. La cristallisation d’une autre famille de verres de terres rares a été étudiée. Il s’agit de verres d’aluminate de lanthane et de borate de lanthane. Dans les deux cas, une cristallisation démarrant à partir de la surface a été observée et étudiée. La cristallisation des phases LaAlO3 et LaBO3 dans ces verres a été suivie par DRX (Haute Température). L’ajout de SiO2 à la composition La2O3-Al2O3 a été nécessaire pour élaborer un verre avec un four classique. Une étude de cristallisation poussée a été également menée sur de nouveaux verres d’aluminates d’alcalinoterreux. Cette étude a compris une caractérisation des vitrocéramiques formées ainsi que la résolution de la structure de deux nouveaux polymorphes de BaAl4O7 formés par cristallisation des verres en se servant de la diffraction électronique, neutronique et synchrotron. Une étude par RMN de l’évolution de l’environnement de l’oxygène durant le recuit a été réalisée et a permis de mettre en évidence la présence des entités d’oxygène tri-coordinées dans les verres d’aluminate de baryum. Ce travail nous a finalement permis d’élaborer plusieurs vitrocéramiques complètement cristallisées et transparentes, ce qui constitue un résultat exceptionnel. La luminescence de ces vitrocéramiques a été caractérisée et les raisons de leur transparence sont discutées à la lumière de leurs microstructures. / This thesis concerns the crystallization and the structural study of different alumino-silicate glasses. This study has led to several completely crystallized and transparent glass-ceramics, which is an original result for this type of material that usually loses transparency during crystallization. These innovative materials were the subject of a patent entitled “Transparent ceramics” (French deposit number: N° 1161025 and international extension number : PCT N° EP2012/074171) and different articles (cf. page 162). Numerous glasses in the systems rare earth oxides, alkaline earth oxides-Al2O3-SiO2 were prepared by an aerodynamic levitator coupled to a laser heating system and studied. The study of the YAG crystallization from the yttrium alumino-silicate glasses was achieved mainly by double resonance 27Al/29Si NMR spectroscopy and by (lab and synchrotron) X-ray diffraction. This study showed that the silicon ions that are initially present in the glassy matrix are incorporated during crystallization in the formed YAG crystals on the 4-fold coordination Al site. The structural consequences of this incorporation were studied. In particular, the reduction of the YAG cubic lattice and the bonds of the tetrahedral sites have been evidenced. Upon post synthesis annealing, the glass was observed to exhibit crystallization below the glass transition temperature. This unusual behaviour was examined using XRD and infrared spectroscopy to follow crystallinity and optical absorbance as a function of annealing treatment. This rarely reported phenomenon could be explained by the high tendency of our glass to crystallize compared to glasses elaborated by classical furnaces and by the ability of Si4+ to be accommodated into the YAG crystal structure as we have demonstrated. This study also revealed the influence of the refractive index difference between the glass and the crystals on the scattering of light. TEM and SEM images show that the YAG crystals sizes range between 500 nm and 1300 nm. Furthermore, the crystallization of a family of lanthanum aluminate and lanthanum borate glasses was studied. In both cases, the crystallization started from the surface. The formation of LaAlO3 LaBO3 phases in these glasses was followed by XRD (High Temperature). The addition of SiO2 to the Al2O3-La2O3 composition was found necessary for the vitrification with a conventional oven. Finally, a crystallization study was also conducted on new alkaline-earth aluminate glasses. This study included a characterization of the parent glasses with the formed glass-ceramics and the structure resolution of two new polymorphs of BaAl4O7 formed by crystallization, using electron neutron and synchrotron diffraction. An NMR study of the environment evolution of the oxygen during annealing was performed. This allowed to evidence the presence of tri-coordinated oxygen entities in the parent glasses. This work has finally allowed us to develop fully crystallized and transparent glass-ceramics, which is an exceptional result. The luminescence of these glass-ceramics was characterized and the reasons for their transparency were discussed in light of their microstructures.