O ambiente é um sistema dinâmico que está sempre mudando e a capacidade de reconhecimento dessas modificações é uma característica crucial para a vida. A família gênica RLK (do inglês Receptor-Like Kinase) engloba as proteínas receptoras do tipo quinase que estão aptas a reconhecer sinais ambientais, através de seu domínio extracelular, e ativar uma cascata de sinalização por modificações pós-traducionais em outras proteínas utilizando a atividade de fosforilação de seu domínio quinase. A subfamília WAK (do inglês The Wall-Associated Kinase) pertence a família gênica RLK, sendo que algumas proteínas desta subfamília foram identificados associados fisicamente à parede celular, sugerindo estes genes como fortes candidatos para agir como sensores, ligando diretamente o ambiente extracelular com o citoplasma e desencadeando sinais intracelulares. Os genes WAK formam uma grande subfamília em arroz, com 130 genes descritos para a subespécie japonica, em comparação aos 27 genes WAK descritos para arabidopsis. A ausência de dados sobre a expansão desta subfamília e suas implicações nas plantas justifica uma análise evolutiva e estrutural entre os membros da subfamília WAK de arabidopsis e arroz, com uma comparação mais extensiva entre os genomas das subespécies de arroz indica e japonica. Quando a organização e os resíduos conservados do domínio quinase das WAKs foram comparados com a superfamília de proteínas quinases de eucariotos, a identificação de dois grupos distintos de WAKs tornou- se evidente em arabidopsis e arroz. Um grupo é formado somente por OsWAKs que provavelmente se expandiu depois da separação entre monocotiledônea- dicotiledônea, os quais derivaram para a classe de quinases não-RD. O outro grupo corresponde à classe RD-quinase, sendo esta a classe de quinase mais frequente entre os eucariotos, formado por ambos os genes AtWAK e OsWAK. Além disso, com os resultados de comparação entre os genomas das subespécies indica e japonica foi possível identificar uma grande variação com relação aos domínios das proteínas e ao padrão de expressão entre os genes OsWAK dessas subespécies. O conjunto de resultados sugere que as WAKs constituem duas subfamílias evolutivamente relacionadas, mas independentes: OsWAK-RD e WAK-nonRD. O reconhecimento desta divisão poderá contribuir para a compreensão das funções e regulação das WAKs. / The environment is a dynamic system, which is always changing and the recognition of its modifications is a crucial feature for life. The RLK is a gene family of receptor quinase in plants that are able to recognize the environment signals, through its extracellular domain, and activating a signal cascade through the post-translational modifications of others protein using the phosphorylation activity from the quinase domain. The Wall-Associated Kinase (WAK) is a subfamily from RLK, with some members identified as associated to the cell wall, suggesting these genes are strong candidates to act as sensors directly linking the extracellular environment to the citoplasm and triggering intracellular signals. The WAK is a large subfamily in rice genome, with 130 genes being described in japonica, compared to the twenty-seven in A. thaliana. The absence of data about this gene subfamily expansion and their implications for plants, justify an evolutionary and structural analysis of A. thaliana and O. sativa members of the WAK subfamily, with a more extensive comparison between genomes of japonica and indica rice subspecies. When the organization of plant WAK domains and conserved residues are compared with those of other eukaryotes protein kinase superfamilies, the identification of two distinct groups of WAKs become evident in Arabidopsis and Rice. One group corresponds to a cluster containing just OsWAK that should have expanded after the monocot-dicot separation, which evolved to form a non-RD kinase class. The other group corresponds to the classical RD-kinases with both AtWAK and OsWAK representatives. Moreover, by comparing OsWAK from indica and japonica subspecies was possible to identify a large divergence in the protein domain features and gene pattern expression. We propose that plant WAKs constitutes two evolutionary related but independent subfamilies: the WAK-RD and the WAK- nonRD. The recognition of this division would contribute to the understanding of WAK function and regulation.

O ambiente é um sistema dinâmico que está sempre mudando e a capacidade de reconhecimento dessas modificações é uma característica crucial para a vida. A família gênica RLK (do inglês Receptor-Like Kinase) engloba as proteínas receptoras do tipo quinase que estão aptas a reconhecer sinais ambientais, através de seu domínio extracelular, e ativar uma cascata de sinalização por modificações pós-traducionais em outras proteínas utilizando a atividade de fosforilação de seu domínio quinase. A subfamília WAK (do inglês The Wall-Associated Kinase) pertence a família gênica RLK, sendo que algumas proteínas desta subfamília foram identificados associados fisicamente à parede celular, sugerindo estes genes como fortes candidatos para agir como sensores, ligando diretamente o ambiente extracelular com o citoplasma e desencadeando sinais intracelulares. Os genes WAK formam uma grande subfamília em arroz, com 130 genes descritos para a subespécie japonica, em comparação aos 27 genes WAK descritos para arabidopsis. A ausência de dados sobre a expansão desta subfamília e suas implicações nas plantas justifica uma análise evolutiva e estrutural entre os membros da subfamília WAK de arabidopsis e arroz, com uma comparação mais extensiva entre os genomas das subespécies de arroz indica e japonica. Quando a organização e os resíduos conservados do domínio quinase das WAKs foram comparados com a superfamília de proteínas quinases de eucariotos, a identificação de dois grupos distintos de WAKs tornou- se evidente em arabidopsis e arroz. Um grupo é formado somente por OsWAKs que provavelmente se expandiu depois da separação entre monocotiledônea- dicotiledônea, os quais derivaram para a classe de quinases não-RD. O outro grupo corresponde à classe RD-quinase, sendo esta a classe de quinase mais frequente entre os eucariotos, formado por ambos os genes AtWAK e OsWAK. Além disso, com os resultados de comparação entre os genomas das subespécies indica e japonica foi possível identificar uma grande variação com relação aos domínios das proteínas e ao padrão de expressão entre os genes OsWAK dessas subespécies. O conjunto de resultados sugere que as WAKs constituem duas subfamílias evolutivamente relacionadas, mas independentes: OsWAK-RD e WAK-nonRD. O reconhecimento desta divisão poderá contribuir para a compreensão das funções e regulação das WAKs. / The environment is a dynamic system, which is always changing and the recognition of its modifications is a crucial feature for life. The RLK is a gene family of receptor quinase in plants that are able to recognize the environment signals, through its extracellular domain, and activating a signal cascade through the post-translational modifications of others protein using the phosphorylation activity from the quinase domain. The Wall-Associated Kinase (WAK) is a subfamily from RLK, with some members identified as associated to the cell wall, suggesting these genes are strong candidates to act as sensors directly linking the extracellular environment to the citoplasm and triggering intracellular signals. The WAK is a large subfamily in rice genome, with 130 genes being described in japonica, compared to the twenty-seven in A. thaliana. The absence of data about this gene subfamily expansion and their implications for plants, justify an evolutionary and structural analysis of A. thaliana and O. sativa members of the WAK subfamily, with a more extensive comparison between genomes of japonica and indica rice subspecies. When the organization of plant WAK domains and conserved residues are compared with those of other eukaryotes protein kinase superfamilies, the identification of two distinct groups of WAKs become evident in Arabidopsis and Rice. One group corresponds to a cluster containing just OsWAK that should have expanded after the monocot-dicot separation, which evolved to form a non-RD kinase class. The other group corresponds to the classical RD-kinases with both AtWAK and OsWAK representatives. Moreover, by comparing OsWAK from indica and japonica subspecies was possible to identify a large divergence in the protein domain features and gene pattern expression. We propose that plant WAKs constitutes two evolutionary related but independent subfamilies: the WAK-RD and the WAK- nonRD. The recognition of this division would contribute to the understanding of WAK function and regulation.

O valor adaptativo do sexo em patógenos unicelulares eucarióticos é um assunto de intenso debate, e os mecanismos genéticos envolvidos na reprodução sexual desses organismos são pouco desconhecidos. Diferenças nos sistemas de reprodução podem ajudar a explicar as diferenças nos modos de transmissão, amplitude de gêneros hospedeiros e resposta às mudanças ambientais, todas estreitamente relacionadas à patogenicidade e à virulência desses patógenos. Este trabalho tem como objetivo identificar os elementos genômicos que podem estar associados aos modos de reprodução e elucidar o papel dos ciclos sexuais em um microsporídeo. Microsporídeos fazem parte de um filo de fungos patogênicos intracelulares unicelulares. Estes parasitas são encontrados em praticamente todos os tipos de animais, sendo de importância para saúde e agricultura. Hamiltosporidium tvaerminnensis é um microsporídeo assexuado que é transmitido vertical e horizontalmente ao seu hospedeiro, o microcrustáceo Daphnia magna. H. tvaerminnensis possui uma espécie irmã, Hamiltosporidium magnivora, que difere por ser sexual e apenas verticalmente transmitida Nosso trabalho usa como referência um genoma draft de H. tvaerminnensis de 2009. É um genoma considerado grande para um microsporídeo, com tamanho estimado de 25 Mb. Contamos com sequências de Illumina de duas linhagens recentemente sequenciadas de H. magnivora, uma da Bélgica e outra de Israel, bem como um resequenciamento da mesma linhagem de H. tvaerminnensis, da Finlândia, usando tecnologia mais recente que a referência. Após a montagem e anotação, os nossos resultados apontam para genes chave de meiose ausentes na linhagem assexuada, bem como um enriquecimento de elementos transponíveis e transferência genética horizontal gênica derivada do hospedeiro nas linhagens sexuais. A presença exclusiva de certos genes da meiose bem como de outros genes de reparo a danos do DNA associados à maior presença de elementos móveis sugere uma possível perda de sexo concomitante à inativação de elementos móveis na linhagem assexuada. / The adaptive value of sex in eukaryotic unicellular pathogens is a matter of intense debate, and the genetic mechanisms involved in sexual reproduction of these organisms are largely unknown. Differences in reproduction systems could help explaining differences in modes of transmission, host range amplitude and response to environmental changes, all tightly related to pathogenicity and virulence of such pathogens. This work aims to identify genomic elements that could be associated with modes of reproduction, and further elucidate the role of sexual cycles in a microsporidian parasite. Microsporidia belong to a phylum of unicellular intracellular pathogenic Fungi. These parasites are found in virtually all types of animals, being of importance to health and agriculture. Hamiltosporidium tvaerminnensis is a microsporidian shown to be asexual and being both vertically and horizontally transmited to its host, the microcrustacean Daphnia magna. H. tvaerminnensis possesses a sister species, Hamiltosporidium magnivora, which differs by being sexual and only vertically transmitted Our work uses as reference a 2009 assembled draft genome of H. tvaerminnensis. It is an unusually large genome for a microsporidian, estimated to contain 25 Mb of sequence. We rely on Illumina sequencing reads from two recently resequenced linages of H. magnivora, one from Belgium and another from Israel, as well as a set from the same H. tvaerminnensis lineage as the reference, from Finland, using technology newer than the reference. After assembly and annotation, our results point to missing key meiosis genes in the asexual lineage, as well as an enrichment in transposable elements and host derived horizontal gene transfer in the sexual lineages. The exclusive presence of certain meiosis genes as well as other DNA damage repair genes associated to the larger presence of mobile elements hint to a possible loss of sex concomitant to the inactivation of mobile elements in the asexual lineage.

O ambiente é um sistema dinâmico que está sempre mudando e a capacidade de reconhecimento dessas modificações é uma característica crucial para a vida. A família gênica RLK (do inglês Receptor-Like Kinase) engloba as proteínas receptoras do tipo quinase que estão aptas a reconhecer sinais ambientais, através de seu domínio extracelular, e ativar uma cascata de sinalização por modificações pós-traducionais em outras proteínas utilizando a atividade de fosforilação de seu domínio quinase. A subfamília WAK (do inglês The Wall-Associated Kinase) pertence a família gênica RLK, sendo que algumas proteínas desta subfamília foram identificados associados fisicamente à parede celular, sugerindo estes genes como fortes candidatos para agir como sensores, ligando diretamente o ambiente extracelular com o citoplasma e desencadeando sinais intracelulares. Os genes WAK formam uma grande subfamília em arroz, com 130 genes descritos para a subespécie japonica, em comparação aos 27 genes WAK descritos para arabidopsis. A ausência de dados sobre a expansão desta subfamília e suas implicações nas plantas justifica uma análise evolutiva e estrutural entre os membros da subfamília WAK de arabidopsis e arroz, com uma comparação mais extensiva entre os genomas das subespécies de arroz indica e japonica. Quando a organização e os resíduos conservados do domínio quinase das WAKs foram comparados com a superfamília de proteínas quinases de eucariotos, a identificação de dois grupos distintos de WAKs tornou- se evidente em arabidopsis e arroz. Um grupo é formado somente por OsWAKs que provavelmente se expandiu depois da separação entre monocotiledônea- dicotiledônea, os quais derivaram para a classe de quinases não-RD. O outro grupo corresponde à classe RD-quinase, sendo esta a classe de quinase mais frequente entre os eucariotos, formado por ambos os genes AtWAK e OsWAK. Além disso, com os resultados de comparação entre os genomas das subespécies indica e japonica foi possível identificar uma grande variação com relação aos domínios das proteínas e ao padrão de expressão entre os genes OsWAK dessas subespécies. O conjunto de resultados sugere que as WAKs constituem duas subfamílias evolutivamente relacionadas, mas independentes: OsWAK-RD e WAK-nonRD. O reconhecimento desta divisão poderá contribuir para a compreensão das funções e regulação das WAKs. / The environment is a dynamic system, which is always changing and the recognition of its modifications is a crucial feature for life. The RLK is a gene family of receptor quinase in plants that are able to recognize the environment signals, through its extracellular domain, and activating a signal cascade through the post-translational modifications of others protein using the phosphorylation activity from the quinase domain. The Wall-Associated Kinase (WAK) is a subfamily from RLK, with some members identified as associated to the cell wall, suggesting these genes are strong candidates to act as sensors directly linking the extracellular environment to the citoplasm and triggering intracellular signals. The WAK is a large subfamily in rice genome, with 130 genes being described in japonica, compared to the twenty-seven in A. thaliana. The absence of data about this gene subfamily expansion and their implications for plants, justify an evolutionary and structural analysis of A. thaliana and O. sativa members of the WAK subfamily, with a more extensive comparison between genomes of japonica and indica rice subspecies. When the organization of plant WAK domains and conserved residues are compared with those of other eukaryotes protein kinase superfamilies, the identification of two distinct groups of WAKs become evident in Arabidopsis and Rice. One group corresponds to a cluster containing just OsWAK that should have expanded after the monocot-dicot separation, which evolved to form a non-RD kinase class. The other group corresponds to the classical RD-kinases with both AtWAK and OsWAK representatives. Moreover, by comparing OsWAK from indica and japonica subspecies was possible to identify a large divergence in the protein domain features and gene pattern expression. We propose that plant WAKs constitutes two evolutionary related but independent subfamilies: the WAK-RD and the WAK- nonRD. The recognition of this division would contribute to the understanding of WAK function and regulation.

O valor adaptativo do sexo em patógenos unicelulares eucarióticos é um assunto de intenso debate, e os mecanismos genéticos envolvidos na reprodução sexual desses organismos são pouco desconhecidos. Diferenças nos sistemas de reprodução podem ajudar a explicar as diferenças nos modos de transmissão, amplitude de gêneros hospedeiros e resposta às mudanças ambientais, todas estreitamente relacionadas à patogenicidade e à virulência desses patógenos. Este trabalho tem como objetivo identificar os elementos genômicos que podem estar associados aos modos de reprodução e elucidar o papel dos ciclos sexuais em um microsporídeo. Microsporídeos fazem parte de um filo de fungos patogênicos intracelulares unicelulares. Estes parasitas são encontrados em praticamente todos os tipos de animais, sendo de importância para saúde e agricultura. Hamiltosporidium tvaerminnensis é um microsporídeo assexuado que é transmitido vertical e horizontalmente ao seu hospedeiro, o microcrustáceo Daphnia magna. H. tvaerminnensis possui uma espécie irmã, Hamiltosporidium magnivora, que difere por ser sexual e apenas verticalmente transmitida Nosso trabalho usa como referência um genoma draft de H. tvaerminnensis de 2009. É um genoma considerado grande para um microsporídeo, com tamanho estimado de 25 Mb. Contamos com sequências de Illumina de duas linhagens recentemente sequenciadas de H. magnivora, uma da Bélgica e outra de Israel, bem como um resequenciamento da mesma linhagem de H. tvaerminnensis, da Finlândia, usando tecnologia mais recente que a referência. Após a montagem e anotação, os nossos resultados apontam para genes chave de meiose ausentes na linhagem assexuada, bem como um enriquecimento de elementos transponíveis e transferência genética horizontal gênica derivada do hospedeiro nas linhagens sexuais. A presença exclusiva de certos genes da meiose bem como de outros genes de reparo a danos do DNA associados à maior presença de elementos móveis sugere uma possível perda de sexo concomitante à inativação de elementos móveis na linhagem assexuada. / The adaptive value of sex in eukaryotic unicellular pathogens is a matter of intense debate, and the genetic mechanisms involved in sexual reproduction of these organisms are largely unknown. Differences in reproduction systems could help explaining differences in modes of transmission, host range amplitude and response to environmental changes, all tightly related to pathogenicity and virulence of such pathogens. This work aims to identify genomic elements that could be associated with modes of reproduction, and further elucidate the role of sexual cycles in a microsporidian parasite. Microsporidia belong to a phylum of unicellular intracellular pathogenic Fungi. These parasites are found in virtually all types of animals, being of importance to health and agriculture. Hamiltosporidium tvaerminnensis is a microsporidian shown to be asexual and being both vertically and horizontally transmited to its host, the microcrustacean Daphnia magna. H. tvaerminnensis possesses a sister species, Hamiltosporidium magnivora, which differs by being sexual and only vertically transmitted Our work uses as reference a 2009 assembled draft genome of H. tvaerminnensis. It is an unusually large genome for a microsporidian, estimated to contain 25 Mb of sequence. We rely on Illumina sequencing reads from two recently resequenced linages of H. magnivora, one from Belgium and another from Israel, as well as a set from the same H. tvaerminnensis lineage as the reference, from Finland, using technology newer than the reference. After assembly and annotation, our results point to missing key meiosis genes in the asexual lineage, as well as an enrichment in transposable elements and host derived horizontal gene transfer in the sexual lineages. The exclusive presence of certain meiosis genes as well as other DNA damage repair genes associated to the larger presence of mobile elements hint to a possible loss of sex concomitant to the inactivation of mobile elements in the asexual lineage.

O valor adaptativo do sexo em patógenos unicelulares eucarióticos é um assunto de intenso debate, e os mecanismos genéticos envolvidos na reprodução sexual desses organismos são pouco desconhecidos. Diferenças nos sistemas de reprodução podem ajudar a explicar as diferenças nos modos de transmissão, amplitude de gêneros hospedeiros e resposta às mudanças ambientais, todas estreitamente relacionadas à patogenicidade e à virulência desses patógenos. Este trabalho tem como objetivo identificar os elementos genômicos que podem estar associados aos modos de reprodução e elucidar o papel dos ciclos sexuais em um microsporídeo. Microsporídeos fazem parte de um filo de fungos patogênicos intracelulares unicelulares. Estes parasitas são encontrados em praticamente todos os tipos de animais, sendo de importância para saúde e agricultura. Hamiltosporidium tvaerminnensis é um microsporídeo assexuado que é transmitido vertical e horizontalmente ao seu hospedeiro, o microcrustáceo Daphnia magna. H. tvaerminnensis possui uma espécie irmã, Hamiltosporidium magnivora, que difere por ser sexual e apenas verticalmente transmitida Nosso trabalho usa como referência um genoma draft de H. tvaerminnensis de 2009. É um genoma considerado grande para um microsporídeo, com tamanho estimado de 25 Mb. Contamos com sequências de Illumina de duas linhagens recentemente sequenciadas de H. magnivora, uma da Bélgica e outra de Israel, bem como um resequenciamento da mesma linhagem de H. tvaerminnensis, da Finlândia, usando tecnologia mais recente que a referência. Após a montagem e anotação, os nossos resultados apontam para genes chave de meiose ausentes na linhagem assexuada, bem como um enriquecimento de elementos transponíveis e transferência genética horizontal gênica derivada do hospedeiro nas linhagens sexuais. A presença exclusiva de certos genes da meiose bem como de outros genes de reparo a danos do DNA associados à maior presença de elementos móveis sugere uma possível perda de sexo concomitante à inativação de elementos móveis na linhagem assexuada. / The adaptive value of sex in eukaryotic unicellular pathogens is a matter of intense debate, and the genetic mechanisms involved in sexual reproduction of these organisms are largely unknown. Differences in reproduction systems could help explaining differences in modes of transmission, host range amplitude and response to environmental changes, all tightly related to pathogenicity and virulence of such pathogens. This work aims to identify genomic elements that could be associated with modes of reproduction, and further elucidate the role of sexual cycles in a microsporidian parasite. Microsporidia belong to a phylum of unicellular intracellular pathogenic Fungi. These parasites are found in virtually all types of animals, being of importance to health and agriculture. Hamiltosporidium tvaerminnensis is a microsporidian shown to be asexual and being both vertically and horizontally transmited to its host, the microcrustacean Daphnia magna. H. tvaerminnensis possesses a sister species, Hamiltosporidium magnivora, which differs by being sexual and only vertically transmitted Our work uses as reference a 2009 assembled draft genome of H. tvaerminnensis. It is an unusually large genome for a microsporidian, estimated to contain 25 Mb of sequence. We rely on Illumina sequencing reads from two recently resequenced linages of H. magnivora, one from Belgium and another from Israel, as well as a set from the same H. tvaerminnensis lineage as the reference, from Finland, using technology newer than the reference. After assembly and annotation, our results point to missing key meiosis genes in the asexual lineage, as well as an enrichment in transposable elements and host derived horizontal gene transfer in the sexual lineages. The exclusive presence of certain meiosis genes as well as other DNA damage repair genes associated to the larger presence of mobile elements hint to a possible loss of sex concomitant to the inactivation of mobile elements in the asexual lineage.

O ditelureto de difenila (DTDF) é um composto organotelurado simples e estável e é um potencial candidato de protótipos para o desenvolvimento de novas moléculas biologicamente ativas. Então, é importante avaliar os efeitos tóxicos desse composto. No presente estudo, foram avaliadas as propriedades citotóxicas, genotóxicas e mutagênicas do DTDF em vários modelos biológicos: em células de fibroblastos de pulmão de hamster chinês, em linhagens da levedura S. cerevisiae proficientes e deficientes em algumas vias de reparação de DNA e na bactéria Salmonela typhimurium. O DTDF pode induzir alteração no quadro de leitura em S. typhimurium e em linhagen selvagem haplóide de S. cereviviae. Assim, o DTDF apresenta um comportamento similar a um agente intercalante. Os mutantes de S. cerevisiae defectivos na reparação por excisão de bases e na reparação recombinacional mostraram elevada sensibilidade ao DTDF. Em células V79 tratadas com concentrações crescentes de DTDF, a atividade citotóxica, foi determinada usando ensaio de lactato desidrogenase no meio extracelular, ocorre na concentração de 1 µM após 2 h de exposição. Consistentemente, o tratamento das células por 2 h com concentrações de DTDF citotóxicas aumentaram os níveis de TBARS e diminuíram os níveis de GSH/GSSH em levedura e em células V79, indicando que DTDF pode levar ao aumento da peroxidação lipídica e da oxidação da glutationa intracelular, caracterizando um estado de estresse oxidatívo. Nas concentrações mais elevadas, o DTDF induziu a formação de quebras simples e duplas de DNA em células V79, como evidenciado pelo ensaio cometa, nas versões alcalina e neutra, na presença e ausência de ativação metabólica. O DTDF induziu a danos oxidativos ao DNA, determinados pelo ensaio cometa modificado empregando as endonucleases formamidopirimidina DNA-glicosilase (Fpg) e endonuclease III (endoIII) com e sem ativação metabólica. O tratamento também induziu aumento no número de células binucleadas no teste micronúcleo em células V79, demonstrando potencial mutagênico dessa molécula em altas concentrações. Finalmente, o pré-tratamento com N-acetilcisteina, que restaura o GSH ao nível normal, reduziu os efeitos oxidativos, genotóxicos e mutagênicos do DTDF em levedura e em células V79. Em resumo, os efeitos celulares do DTDF parecem ser muito complexos e ligados a sua habilidade induzir distúrbios na homeostase redox celular e na capacidade de intercalar no DNA, que conduzem a dano e a quebras do DNA, danos e morte celular. / Diphenyl ditelluride (DPDT) is a simple and stable organotellurium compound and it is a potential candidate to prototype for a development of novel biological active molecules. Thus, it is important to evaluate the toxic effects of this compound. In the present study, we evaluated the putative cytotoxic, genotoxic, and mutagenic properties of DPDT in various biological models: in V79 Chinese lung fibroblast cells, in strains of the yeast S.cerevisiae proficient and deficient in several DNA repair pathways and in Salmonella typhimurium. DPDT is able to induce frameshift mutations in S.typhimurium and in haploid wild type strain of S.cerevisiae. Thus, DPDT presents a behavior similar that of an intercalanting agent. Mutants of S.cerevisiae defective in base excision repair and in recombinational repair showed high sensitivity to DPDT. In V79 cells treated with increasing concentrations of DPDT, the cytotoxic activity, as determined using lactate dehydrogenase leakage assay, occurs in doses up to 1 µM after 2 h of exposure. Accordingly, the treatment of cells for 2 h with cytotoxic doses of DPDT increased TBARS levels and decreased GSH/GSSH ratio in yeast and in V79 cells, indicating that DPDT can lead to increase lipid peroxidation and intracellular glutathione oxidation, characterizing an oxidative stress status. At the higher doses, DPDT generates DNA single and double strand breaks in V79 cells, as observed using the comet assay, at both the alkaline and the neutral versions without and with metabolic activation. DPDT induced pronounced oxidative DNA damage, determined using modified Comet assay with the enzymes formamidopyrimidine DNA-glycosylase (Fpg) and endonuclease III (Endo III) without and with metabolic activation. The treatment also induced an increase in the number of binucleated cells in the micronucleus test in V79 cells, showing mutagenic risk by this molecule at high concentrations. Finally, pre-incubation with N-acetylcysteine, which restored GSH to normal levels, reduce DPDT oxidant, genotoxic and mutagenic effects in yeast and V79 cells. In summary, the cellular effects of DPDT appear to be very complex and linked to its ability to impose disturbs in redox cellular homeostasis and in the ability to intercalate into DNA, which lead to DNA damage and breakage, cellular injury and cell death.

O ditelureto de difenila (DTDF) é um composto organotelurado simples e estável e é um potencial candidato de protótipos para o desenvolvimento de novas moléculas biologicamente ativas. Então, é importante avaliar os efeitos tóxicos desse composto. No presente estudo, foram avaliadas as propriedades citotóxicas, genotóxicas e mutagênicas do DTDF em vários modelos biológicos: em células de fibroblastos de pulmão de hamster chinês, em linhagens da levedura S. cerevisiae proficientes e deficientes em algumas vias de reparação de DNA e na bactéria Salmonela typhimurium. O DTDF pode induzir alteração no quadro de leitura em S. typhimurium e em linhagen selvagem haplóide de S. cereviviae. Assim, o DTDF apresenta um comportamento similar a um agente intercalante. Os mutantes de S. cerevisiae defectivos na reparação por excisão de bases e na reparação recombinacional mostraram elevada sensibilidade ao DTDF. Em células V79 tratadas com concentrações crescentes de DTDF, a atividade citotóxica, foi determinada usando ensaio de lactato desidrogenase no meio extracelular, ocorre na concentração de 1 µM após 2 h de exposição. Consistentemente, o tratamento das células por 2 h com concentrações de DTDF citotóxicas aumentaram os níveis de TBARS e diminuíram os níveis de GSH/GSSH em levedura e em células V79, indicando que DTDF pode levar ao aumento da peroxidação lipídica e da oxidação da glutationa intracelular, caracterizando um estado de estresse oxidatívo. Nas concentrações mais elevadas, o DTDF induziu a formação de quebras simples e duplas de DNA em células V79, como evidenciado pelo ensaio cometa, nas versões alcalina e neutra, na presença e ausência de ativação metabólica. O DTDF induziu a danos oxidativos ao DNA, determinados pelo ensaio cometa modificado empregando as endonucleases formamidopirimidina DNA-glicosilase (Fpg) e endonuclease III (endoIII) com e sem ativação metabólica. O tratamento também induziu aumento no número de células binucleadas no teste micronúcleo em células V79, demonstrando potencial mutagênico dessa molécula em altas concentrações. Finalmente, o pré-tratamento com N-acetilcisteina, que restaura o GSH ao nível normal, reduziu os efeitos oxidativos, genotóxicos e mutagênicos do DTDF em levedura e em células V79. Em resumo, os efeitos celulares do DTDF parecem ser muito complexos e ligados a sua habilidade induzir distúrbios na homeostase redox celular e na capacidade de intercalar no DNA, que conduzem a dano e a quebras do DNA, danos e morte celular. / Diphenyl ditelluride (DPDT) is a simple and stable organotellurium compound and it is a potential candidate to prototype for a development of novel biological active molecules. Thus, it is important to evaluate the toxic effects of this compound. In the present study, we evaluated the putative cytotoxic, genotoxic, and mutagenic properties of DPDT in various biological models: in V79 Chinese lung fibroblast cells, in strains of the yeast S.cerevisiae proficient and deficient in several DNA repair pathways and in Salmonella typhimurium. DPDT is able to induce frameshift mutations in S.typhimurium and in haploid wild type strain of S.cerevisiae. Thus, DPDT presents a behavior similar that of an intercalanting agent. Mutants of S.cerevisiae defective in base excision repair and in recombinational repair showed high sensitivity to DPDT. In V79 cells treated with increasing concentrations of DPDT, the cytotoxic activity, as determined using lactate dehydrogenase leakage assay, occurs in doses up to 1 µM after 2 h of exposure. Accordingly, the treatment of cells for 2 h with cytotoxic doses of DPDT increased TBARS levels and decreased GSH/GSSH ratio in yeast and in V79 cells, indicating that DPDT can lead to increase lipid peroxidation and intracellular glutathione oxidation, characterizing an oxidative stress status. At the higher doses, DPDT generates DNA single and double strand breaks in V79 cells, as observed using the comet assay, at both the alkaline and the neutral versions without and with metabolic activation. DPDT induced pronounced oxidative DNA damage, determined using modified Comet assay with the enzymes formamidopyrimidine DNA-glycosylase (Fpg) and endonuclease III (Endo III) without and with metabolic activation. The treatment also induced an increase in the number of binucleated cells in the micronucleus test in V79 cells, showing mutagenic risk by this molecule at high concentrations. Finally, pre-incubation with N-acetylcysteine, which restored GSH to normal levels, reduce DPDT oxidant, genotoxic and mutagenic effects in yeast and V79 cells. In summary, the cellular effects of DPDT appear to be very complex and linked to its ability to impose disturbs in redox cellular homeostasis and in the ability to intercalate into DNA, which lead to DNA damage and breakage, cellular injury and cell death.

O ditelureto de difenila (DTDF) é um composto organotelurado simples e estável e é um potencial candidato de protótipos para o desenvolvimento de novas moléculas biologicamente ativas. Então, é importante avaliar os efeitos tóxicos desse composto. No presente estudo, foram avaliadas as propriedades citotóxicas, genotóxicas e mutagênicas do DTDF em vários modelos biológicos: em células de fibroblastos de pulmão de hamster chinês, em linhagens da levedura S. cerevisiae proficientes e deficientes em algumas vias de reparação de DNA e na bactéria Salmonela typhimurium. O DTDF pode induzir alteração no quadro de leitura em S. typhimurium e em linhagen selvagem haplóide de S. cereviviae. Assim, o DTDF apresenta um comportamento similar a um agente intercalante. Os mutantes de S. cerevisiae defectivos na reparação por excisão de bases e na reparação recombinacional mostraram elevada sensibilidade ao DTDF. Em células V79 tratadas com concentrações crescentes de DTDF, a atividade citotóxica, foi determinada usando ensaio de lactato desidrogenase no meio extracelular, ocorre na concentração de 1 µM após 2 h de exposição. Consistentemente, o tratamento das células por 2 h com concentrações de DTDF citotóxicas aumentaram os níveis de TBARS e diminuíram os níveis de GSH/GSSH em levedura e em células V79, indicando que DTDF pode levar ao aumento da peroxidação lipídica e da oxidação da glutationa intracelular, caracterizando um estado de estresse oxidatívo. Nas concentrações mais elevadas, o DTDF induziu a formação de quebras simples e duplas de DNA em células V79, como evidenciado pelo ensaio cometa, nas versões alcalina e neutra, na presença e ausência de ativação metabólica. O DTDF induziu a danos oxidativos ao DNA, determinados pelo ensaio cometa modificado empregando as endonucleases formamidopirimidina DNA-glicosilase (Fpg) e endonuclease III (endoIII) com e sem ativação metabólica. O tratamento também induziu aumento no número de células binucleadas no teste micronúcleo em células V79, demonstrando potencial mutagênico dessa molécula em altas concentrações. Finalmente, o pré-tratamento com N-acetilcisteina, que restaura o GSH ao nível normal, reduziu os efeitos oxidativos, genotóxicos e mutagênicos do DTDF em levedura e em células V79. Em resumo, os efeitos celulares do DTDF parecem ser muito complexos e ligados a sua habilidade induzir distúrbios na homeostase redox celular e na capacidade de intercalar no DNA, que conduzem a dano e a quebras do DNA, danos e morte celular. / Diphenyl ditelluride (DPDT) is a simple and stable organotellurium compound and it is a potential candidate to prototype for a development of novel biological active molecules. Thus, it is important to evaluate the toxic effects of this compound. In the present study, we evaluated the putative cytotoxic, genotoxic, and mutagenic properties of DPDT in various biological models: in V79 Chinese lung fibroblast cells, in strains of the yeast S.cerevisiae proficient and deficient in several DNA repair pathways and in Salmonella typhimurium. DPDT is able to induce frameshift mutations in S.typhimurium and in haploid wild type strain of S.cerevisiae. Thus, DPDT presents a behavior similar that of an intercalanting agent. Mutants of S.cerevisiae defective in base excision repair and in recombinational repair showed high sensitivity to DPDT. In V79 cells treated with increasing concentrations of DPDT, the cytotoxic activity, as determined using lactate dehydrogenase leakage assay, occurs in doses up to 1 µM after 2 h of exposure. Accordingly, the treatment of cells for 2 h with cytotoxic doses of DPDT increased TBARS levels and decreased GSH/GSSH ratio in yeast and in V79 cells, indicating that DPDT can lead to increase lipid peroxidation and intracellular glutathione oxidation, characterizing an oxidative stress status. At the higher doses, DPDT generates DNA single and double strand breaks in V79 cells, as observed using the comet assay, at both the alkaline and the neutral versions without and with metabolic activation. DPDT induced pronounced oxidative DNA damage, determined using modified Comet assay with the enzymes formamidopyrimidine DNA-glycosylase (Fpg) and endonuclease III (Endo III) without and with metabolic activation. The treatment also induced an increase in the number of binucleated cells in the micronucleus test in V79 cells, showing mutagenic risk by this molecule at high concentrations. Finally, pre-incubation with N-acetylcysteine, which restored GSH to normal levels, reduce DPDT oxidant, genotoxic and mutagenic effects in yeast and V79 cells. In summary, the cellular effects of DPDT appear to be very complex and linked to its ability to impose disturbs in redox cellular homeostasis and in the ability to intercalate into DNA, which lead to DNA damage and breakage, cellular injury and cell death.

Cofatores ferro-enxofre são grupos prostéticos inorgânicos ubíquos e evolutivamente ancestrais, cuja formação é dependente de complexas maquinarias protéicas. Três sistemas de formação distintos já foram determinados, denominados sistemas NIF, ISC e SUF. Apesar de bem descritos em diversos organismos, estas maquinarias são pouco caracterizadas no filo Firmicutes, o qual agrupa diversas bactérias patogênicas, e onde Enterococcus faecalis aparece como um representante clinicamente relevante. O objetivo deste estudo foi identificar a maquinaria biossintética de formação dos cofatores [Fe-S] de E. faecalis mediante análises de bioinformática, determinação das regiões promotoras do operon e de elementos cis-atuantes, padrão de expressão gênica, caracterização bioquímica dos elementos encontrados e comparação entre as maquinarias de associação do cofator [Fe-S] presente em Proteobacteria e Firmicutes através da capacidade de complementação deste sistema nos sistemas ISC e SUF de Azotobacter vinelandii e Escherichia coli, respectivamente. Metodologias de bioinformática permitiram identificar representantes da maquinaria SUF de formação dos cofatores [Fe-S], previamente identificado em Proteobacteria, apresentando os genes sufB, sufC, sufD e sufS e a presença de sufU, o único representante homólogo do sistema ISC, codificando possível proteína arcabouço, no lugar de sufA; da mesma forma, sufE e sufR não foram identificadas. A alta conservação deste sistema foi verificada em Firmicutes através de análises filogenéticas. Análise de sequências primária e estrutural de SufU verificaram um padrão estrutural similar à IscU. Modelagem molecular de SufU de E. faecalis apresentou dados de alta flexibilidade na região do sítio ativo, bem como a presença de região específica em Firmicutes, denominada região Gram-positiva (GPR), possivelmente envolvida em interações com outros fatores e/ou reguladores. SufU e o complexo SufSU são capazes de reconstituir cofactor [4Fe-4S], apresentando-se portanto como a proteína arcabouço do sistema. A enzima SufS purificada apresenta PLP ligado como cofator e atividade de cisteína desulfurase. Esta enzima apresenta um residuo catalítico essencial de cisteína na posição 365 , e necessita SufU como ativador, onde outro residuo de cisteína (128) atua como aceptor do enxofre durante a reação de transpersulfuração. SufC apresenta atividade ATPase, porém em nível reduzido em comparação ao homólogo de E. coli; SufD apresenta alta similaridade com homólogo de proteobactérias. Por outro lado, SufB não apresenta os resíduos de cisteína previamente descritos como importantes na formação dos cofatores [Fe-S] em outros organismos, assim sua função no sistema ainda deve ser determinada. Experimentos in vivo demonstraram a conservação específica de sistemas biossintéticos dos cofatores [Fe-S], onde o operon SUF de E. faecalis não foi capaz de complementar os sistemas ISC de Proteobacteria, porém complementou sistema SUF de E. coli, tornando viáveis mutantes de ambos os operons sufABCDSE e iscRSU-hscBA-fdx. / Iron-sulfur clusters are ubiquitous and evolutionary ancient inorganic prosthetic groups, which biosynthesis depends on complex protein machineries. Three distinct assembly systems involved in the maturation of cellular Fe-S proteins have been determined, designated the NIF, ISC and SUF systems. Although well described in several organisms, these machineries are poorly understood in the Firmicutes phylum, which groups several pathological bacteria, where Enterococcus faecalis rises as a clinical relevant representative. The aim of this study was to identify the E. faecalis [Fe-S] cluster biosynthetic machinery through bioinformatics analysis, determination of operon promoter regions and cis-acting elements, relative genetic expression pattern, biochemical characterization of putative elements, and comparison of Proteobacteria and Firmicutes machineries through the ability of complementing Azotobacter vinelandii and Escherichia coli ISC and SUF systems, respectively. Bioinformatics methods enabled us to identify representatives of the SUF machinery for [Fe-S] cluster biosynthesis, previously verified in Proteobacteria showing conserved sufB, sufC, sufD and sufS genes and the presence of sufU, the only ISC homolog representative, coding for putative scaffold protein, instead of sufA; neither sufE nor sufR are present. High conservancy of this system for Firmicutes bacteria was verified through phylogenetic analysis. Primary sequences and structural analysis of the SufU protein demonstrated its structural-like pattern to the scaffold protein IscU. E. faecalis SufU molecular modeling showed high flexibility over the active site regions, and demonstrated the existence of a specific region in Firmicutes, the Gram positive region (GPR), a possible candidate for interaction with other factors and/or regulators. SufU is able to reconstitute a [4Fe-4S] cluster, such as the complex SufSU, arising as the scaffold protein in the system. Purified SufS corresponds to a PLP containing enzyme with cysteine desulfurase activity. It encloses a catalytically essential cysteine residue at position 365, and requires SufU as activator, where another cysteine residue (128) works as a proximal sulfur acceptor site for transpersulfurization reaction. SufC presents ATPase activity, though in a reduced level, when compared to the Escherichia coli homolog; SufD also shares high similarity with proteobacterial SufD. On the other hand, SufB does not present cysteine residues previously described as important involved in the [Fe-S] cluster formation process of other organisms, therefor its function in the system still have to be determined. In vivo experiments enabled us to dfemonstrate the conservancy of specific [Fe-S] cluster biosynthetic systems, where E. faecalis SUF operon was not able to complement Proteobacteria ISC systems, but complemented E. coli SUF system, turning viable mutants of both sufABCDSE and iscRSU-hscBA-fdx operons.