Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-02-01T16:02:21Z No. of bitstreams: 1 2016_DeborahVasconcellosAmbrósio.pdf: 3329953 bytes, checksum: e66459c673c7c9890002220c0a4f0bf5 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-02-01T21:11:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_DeborahVasconcellosAmbrósio.pdf: 3329953 bytes, checksum: e66459c673c7c9890002220c0a4f0bf5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-01T21:11:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_DeborahVasconcellosAmbrósio.pdf: 3329953 bytes, checksum: e66459c673c7c9890002220c0a4f0bf5 (MD5) / A classificação dos organismos em três domínios, proposta por Woese e colaboradores em 1990, revelou a importância do domínio Archaea e desde então, vários trabalhos têm sido realizados a fim de melhor entender este grupo que se encontra amplamente distribuído no nosso planeta, sendo importante para vários processos ecológicos incluindo os ciclos do Carbono e Nitrogênio. A maior parte do conhecimento deste domínio, incluindo a sua diversidade no bioma Cerrado, está descrita principalmente por métodos independentes de cultivo devido à grande dificuldade de obtenção de culturas em laboratório. Este trabalho propõe a obtenção de culturas laboratoriais de archaeas mesófilas do Cerrado, a partir de sedimentos de um córrego da reserva ecológica do IBGE, localizada em Brasília-DF. Os micro-organismos foram cultivados em meios sólido e líquido, confeccionados a partir da mistura de água e sedimentos deste córrego. O meio de cultura foi adicionado de cloreto de amônio, para favorecer o crescimento de oxidantes de amônia, bem como diferentes agentes antimicrobianos. As amostras foram incubadas em estufa a 28ºC e analisadas semanalmente quanto ao crescimento, sendo realizados repiques quando necessário. As análises de microscopia revelaram colônias compostas por células diminutas, de diferentes formatos e tamanhos que variam de 0,5 a 3μm. Porém, não foi possível relacionar os aspectos morfológicos às archaeas presentes no cultivo. O DNA das colônias obtidas foi submetido a ensaios de PCR com iniciadores específicos para os genes que codificam o rRNA 16S de Archaea e Bacteria e o gene amoA de Archaea, seguido de análises de bioinformática. O resultado das análises revelou um co-cultivo entre diferentes archaeas dos filos Euryarchaeota, Thaumarchaeota e Bathyarchaeota (Miscelaneous Crenachaeotic Group-MCG) com bactérias de quatro gêneros distintos, pertencentes às famílias Brucellaceae e Burkholderiaceae, sendo a maioria das sequências de Archaea afiliadas ao grupo MCG. As sequências de DNA referentes ao gene amoA, obtidas a partir das culturas laboratoriais, se afiliaram a um grupo relacionado ao grupo I.1b do filo Thaumarchaeota, não se associando a qualquer representante previamente cultivado. O sequenciamento dos fragmentos de DNA relativos aos genes de rRNA 16S e amoA de Archaea obtidos a partir das amostras do sedimento revelaram a presença de organismos dos mesmos filos encontrados no cultivo. As análises de α-diversidade das sequências do gene rRNA 16S indicam que a comunidade do córrego Roncador pode ser considerada rica, com uma cobertura estimada de 58,33% para o nível de espécie. / The classification of living organisms in three domains, proposed by Woese and collaborators in 1990, revealed the importance of Archaea and since then, a number of studies were developed in order to better understand this widely distributed group, with important roles in many ecological processes including the nitrogen and carbon cycles. The knowledge of this domain, including its diversity in the Cerrado biome, is mostly described by culture independent methods due to the difficulty of obtaining cultures in artificial media. This work describes the cultivation and characterization of Cerrado’s mesophilic archaea, from a stream sediment of the IBGE ecological reserve located in Brasília-DF. The microorganisms were cultivated in solid and liquid media prepared with a mixture of stream’s sediment and water. In order to improve the growth of ammonia oxidizers, ammonium chloride was added to the media. Antimicrobial agents were also added to prevent bacterial and fungal growth. The samples were incubated at 28ºC and analyzed weekly for growth. Microscopy analyses showed small cells with different shapes and sizes, from 0,5 to 3μm, which were submitted to DNA extraction procedures and subjected to PCR assays with primers directed to the 16S rRNA gene of Archaea and Bacteria, as well as the archaeal amoA gene. The amplicons were submitted to automatic DNA sequencing procedures, and the results revealed that all colonies consisted in co-cultures of different types of archaea from the Euryarchaeota, Thaumarchaeota and Bathyarchaeota (Miscelaneous Crenachaeotic Group-MCG) phyla and Bacteria from four distinct genres of the Brucellaceae and Burkholderiaceae families. The majority of the archaeal 16S rRNA sequences were affiliated to the MGG group. The sequences of the archaeal amoA gene from the cultures were affiliated to a group associated to the I.1b Thaumarchaeal group, and showed no affiliation to any previously cultured members. Archaeal rRNA 16S and amoA gene sequences from the stream sediment were analyzed and the results showed the presence of organisms from the same phyla found in the cultures. α-diversity analysess of the rRNA 16S sequences showed that the archaeal community of the stream can be considered rich with an estimated coverage of 58,33% for the species level.

O ditelureto de difenila (DTDF) é um composto organotelurado simples e estável e é um potencial candidato de protótipos para o desenvolvimento de novas moléculas biologicamente ativas. Então, é importante avaliar os efeitos tóxicos desse composto. No presente estudo, foram avaliadas as propriedades citotóxicas, genotóxicas e mutagênicas do DTDF em vários modelos biológicos: em células de fibroblastos de pulmão de hamster chinês, em linhagens da levedura S. cerevisiae proficientes e deficientes em algumas vias de reparação de DNA e na bactéria Salmonela typhimurium. O DTDF pode induzir alteração no quadro de leitura em S. typhimurium e em linhagen selvagem haplóide de S. cereviviae. Assim, o DTDF apresenta um comportamento similar a um agente intercalante. Os mutantes de S. cerevisiae defectivos na reparação por excisão de bases e na reparação recombinacional mostraram elevada sensibilidade ao DTDF. Em células V79 tratadas com concentrações crescentes de DTDF, a atividade citotóxica, foi determinada usando ensaio de lactato desidrogenase no meio extracelular, ocorre na concentração de 1 µM após 2 h de exposição. Consistentemente, o tratamento das células por 2 h com concentrações de DTDF citotóxicas aumentaram os níveis de TBARS e diminuíram os níveis de GSH/GSSH em levedura e em células V79, indicando que DTDF pode levar ao aumento da peroxidação lipídica e da oxidação da glutationa intracelular, caracterizando um estado de estresse oxidatívo. Nas concentrações mais elevadas, o DTDF induziu a formação de quebras simples e duplas de DNA em células V79, como evidenciado pelo ensaio cometa, nas versões alcalina e neutra, na presença e ausência de ativação metabólica. O DTDF induziu a danos oxidativos ao DNA, determinados pelo ensaio cometa modificado empregando as endonucleases formamidopirimidina DNA-glicosilase (Fpg) e endonuclease III (endoIII) com e sem ativação metabólica. O tratamento também induziu aumento no número de células binucleadas no teste micronúcleo em células V79, demonstrando potencial mutagênico dessa molécula em altas concentrações. Finalmente, o pré-tratamento com N-acetilcisteina, que restaura o GSH ao nível normal, reduziu os efeitos oxidativos, genotóxicos e mutagênicos do DTDF em levedura e em células V79. Em resumo, os efeitos celulares do DTDF parecem ser muito complexos e ligados a sua habilidade induzir distúrbios na homeostase redox celular e na capacidade de intercalar no DNA, que conduzem a dano e a quebras do DNA, danos e morte celular. / Diphenyl ditelluride (DPDT) is a simple and stable organotellurium compound and it is a potential candidate to prototype for a development of novel biological active molecules. Thus, it is important to evaluate the toxic effects of this compound. In the present study, we evaluated the putative cytotoxic, genotoxic, and mutagenic properties of DPDT in various biological models: in V79 Chinese lung fibroblast cells, in strains of the yeast S.cerevisiae proficient and deficient in several DNA repair pathways and in Salmonella typhimurium. DPDT is able to induce frameshift mutations in S.typhimurium and in haploid wild type strain of S.cerevisiae. Thus, DPDT presents a behavior similar that of an intercalanting agent. Mutants of S.cerevisiae defective in base excision repair and in recombinational repair showed high sensitivity to DPDT. In V79 cells treated with increasing concentrations of DPDT, the cytotoxic activity, as determined using lactate dehydrogenase leakage assay, occurs in doses up to 1 µM after 2 h of exposure. Accordingly, the treatment of cells for 2 h with cytotoxic doses of DPDT increased TBARS levels and decreased GSH/GSSH ratio in yeast and in V79 cells, indicating that DPDT can lead to increase lipid peroxidation and intracellular glutathione oxidation, characterizing an oxidative stress status. At the higher doses, DPDT generates DNA single and double strand breaks in V79 cells, as observed using the comet assay, at both the alkaline and the neutral versions without and with metabolic activation. DPDT induced pronounced oxidative DNA damage, determined using modified Comet assay with the enzymes formamidopyrimidine DNA-glycosylase (Fpg) and endonuclease III (Endo III) without and with metabolic activation. The treatment also induced an increase in the number of binucleated cells in the micronucleus test in V79 cells, showing mutagenic risk by this molecule at high concentrations. Finally, pre-incubation with N-acetylcysteine, which restored GSH to normal levels, reduce DPDT oxidant, genotoxic and mutagenic effects in yeast and V79 cells. In summary, the cellular effects of DPDT appear to be very complex and linked to its ability to impose disturbs in redox cellular homeostasis and in the ability to intercalate into DNA, which lead to DNA damage and breakage, cellular injury and cell death.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-05-27T17:43:38Z No. of bitstreams: 1 2015_AlineBelmokdeAraujoDias.pdf: 3511355 bytes, checksum: 20e2b74a889a5764dd2f96f6be017da4 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-05-27T20:29:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_AlineBelmokdeAraujoDias.pdf: 3511355 bytes, checksum: 20e2b74a889a5764dd2f96f6be017da4 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-27T20:29:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_AlineBelmokdeAraujoDias.pdf: 3511355 bytes, checksum: 20e2b74a889a5764dd2f96f6be017da4 (MD5) / Há quase 25 anos foi proposto que os procariotos poderiam ser divididos em dois domínios distintos: Bacteria e Archaea. As archaeas foram inicialmente associadas apenas a ambientes extremos, mas com o aumento do uso de abordagens moleculares, membros deste domínio passaram a ser detectados em diversos habitats do nosso planeta, evidenciando sua ubiquidade. Além disso, posteriormente foram identificadas archaeas com metabolismos de importância ecológica que antes acreditavam-se estar restritos a bactérias, como a oxidação de amônia. Apesar dos avanços trazidos pelas técnicas moleculares, a obtenção de cultivos laboratoriais ainda é imprescindível para a compreensão de vários aspectos da biologia dos microrganismos. No Brasil, ainda são escassos os estudos sobre Archaea nos diferentes ambientes naturais. O Cerrado é um extenso e importante bioma de nosso país, mas pouco se sabe sobre a comunidade de archaeas nos solos de suas diferentes fitofisionomias. Além disso, queimadas são eventos ecológicos importantes no Cerrado e não existem estudos sobre o seu efeito na população de archaeas de solos deste ambiente. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar e comparar a comunidade de Archaea em solos de Cerrado sensu stricto que não sofrem queimadas há anos e solos de áreas queimadas bienalmente, além da detecção de archaeas com potencial para oxidação de amônia nestes solos. Outro objetivo do trabalho foi a obtenção de culturas de archaeas provenientes do solo deste bioma. Amostras de solo coletadas em triplicata foram submetidas à extração de DNA total, que foi utilizado em ensaios de PCR com os iniciadores específicos para os genes rRNA 16S e amoA de Archaea. Os resultados obtidos revelaram que a grande maioria das sequências obtidas pertence aos grupos I.1b e I.1c do filo Thaumarcheota. No entanto, apesar das semelhanças encontradas nas análises realizadas, as amostras de solo da área protegida do fogo apresentaram maior abundância de thaumarchaeotas do grupo I.1c, enquanto o solo da área queimada apresentou mais sequências do grupo I.1b. Análises do gene amoA, amplificado em todas as amostras, indicaram archaeas com o potencial para a oxidação de amônia possivelmente não descritas anteriormente ocorrendo nos solos de Cerrado. Para o estabelecimento do cultivo de archaeas do solo de Cerrado, meios de cultura foram confeccionados a partir de um coado de solo e suplementados com agentes antimicrobianos. Após vários repiques, o DNA das colônias observadas foi extraído e amplificado com iniciadores para os domínios Archaea e Bacteria. A análise das sequências obtidas indicou uma cocultura entre uma bactéria do gênero Novosphingobium e uma archaea do grupo I.1c de Thaumarchaeota, que ainda não apresenta qualquer representante cultivado descrito na literatura. / It has been almost 25 years since the proposal that divided prokaryotes in two different domains: Bacteria and Archaea. The archaea were initially associated exclusively with extreme environments, but the increasing utilization of molecular approaches revealed that members of this domain were ubiquitous and could be detected in different environments on Earth. Furthermore, metabolisms of ecologic importance that were thought to be restricted to bacteria were later detected in archaea, such as the ability to oxidize ammonia. This fact highlights that, despite the advances brought by molecular approaches, cultivation of microorganisms in laboratory is still essential for understanding many aspects of their biology. Currently, there are very few studies about Archaea in the natural environments of Brazil. The Brazilian savanna, known as Cerrado, is an extensive and important biome of our country, but little is known about the Archaea community in soils of its different phytophysiognomies. Furthermore, fires are important ecological events in Cerrado and there are no studies about its effects on the Archaea populations in soils. Therefore, this study aimed to evaluate and compare the archaea community of Cerrado sensu stricto soils of an area that has long been protected from fire and another that has been submitted to biennial prescribed fires. It also aimed to detect archaea with the potential for ammonia oxidation in these soils. Another objective of this study was the establishment of archaea from Cerrado soils in culture. Soil samples were submitted to DNA extraction, which was used for PCR essays with specific primers for Archaea rRNA 16s and amoA genes. Results showed that most of the sequences obtained were from I.1b e I.1c groups of Thaumarchaeota. Despite the similarities found in the analysis, samples from the protected site showed higher abundance of I.1c thaumarchaeotes, while in samples from the frequently burned site more sequences from group I.1b were detected. Analysis of the amoA gene, which was amplified from all samples, showed that there are possibly previously undescribed archaea with ammonia oxidation potential in Cerrado soils. For the establishment of archaea cultures, culture media were made from soil filtrates and supplemented with antimicrobial agents. After several transfers, DNA extracted from the obtained colonies was used for PCR essays with specific primers for Archaea and Bacteria domains. The sequences obtained revealed a coculture between a bacteria of Novosphingobium genus and an archaea from group I.1c of Thaumarchaeota, a group that so far does not have any cultured representative described in the literature.

O ditelureto de difenila (DTDF) é um composto organotelurado simples e estável e é um potencial candidato de protótipos para o desenvolvimento de novas moléculas biologicamente ativas. Então, é importante avaliar os efeitos tóxicos desse composto. No presente estudo, foram avaliadas as propriedades citotóxicas, genotóxicas e mutagênicas do DTDF em vários modelos biológicos: em células de fibroblastos de pulmão de hamster chinês, em linhagens da levedura S. cerevisiae proficientes e deficientes em algumas vias de reparação de DNA e na bactéria Salmonela typhimurium. O DTDF pode induzir alteração no quadro de leitura em S. typhimurium e em linhagen selvagem haplóide de S. cereviviae. Assim, o DTDF apresenta um comportamento similar a um agente intercalante. Os mutantes de S. cerevisiae defectivos na reparação por excisão de bases e na reparação recombinacional mostraram elevada sensibilidade ao DTDF. Em células V79 tratadas com concentrações crescentes de DTDF, a atividade citotóxica, foi determinada usando ensaio de lactato desidrogenase no meio extracelular, ocorre na concentração de 1 µM após 2 h de exposição. Consistentemente, o tratamento das células por 2 h com concentrações de DTDF citotóxicas aumentaram os níveis de TBARS e diminuíram os níveis de GSH/GSSH em levedura e em células V79, indicando que DTDF pode levar ao aumento da peroxidação lipídica e da oxidação da glutationa intracelular, caracterizando um estado de estresse oxidatívo. Nas concentrações mais elevadas, o DTDF induziu a formação de quebras simples e duplas de DNA em células V79, como evidenciado pelo ensaio cometa, nas versões alcalina e neutra, na presença e ausência de ativação metabólica. O DTDF induziu a danos oxidativos ao DNA, determinados pelo ensaio cometa modificado empregando as endonucleases formamidopirimidina DNA-glicosilase (Fpg) e endonuclease III (endoIII) com e sem ativação metabólica. O tratamento também induziu aumento no número de células binucleadas no teste micronúcleo em células V79, demonstrando potencial mutagênico dessa molécula em altas concentrações. Finalmente, o pré-tratamento com N-acetilcisteina, que restaura o GSH ao nível normal, reduziu os efeitos oxidativos, genotóxicos e mutagênicos do DTDF em levedura e em células V79. Em resumo, os efeitos celulares do DTDF parecem ser muito complexos e ligados a sua habilidade induzir distúrbios na homeostase redox celular e na capacidade de intercalar no DNA, que conduzem a dano e a quebras do DNA, danos e morte celular. / Diphenyl ditelluride (DPDT) is a simple and stable organotellurium compound and it is a potential candidate to prototype for a development of novel biological active molecules. Thus, it is important to evaluate the toxic effects of this compound. In the present study, we evaluated the putative cytotoxic, genotoxic, and mutagenic properties of DPDT in various biological models: in V79 Chinese lung fibroblast cells, in strains of the yeast S.cerevisiae proficient and deficient in several DNA repair pathways and in Salmonella typhimurium. DPDT is able to induce frameshift mutations in S.typhimurium and in haploid wild type strain of S.cerevisiae. Thus, DPDT presents a behavior similar that of an intercalanting agent. Mutants of S.cerevisiae defective in base excision repair and in recombinational repair showed high sensitivity to DPDT. In V79 cells treated with increasing concentrations of DPDT, the cytotoxic activity, as determined using lactate dehydrogenase leakage assay, occurs in doses up to 1 µM after 2 h of exposure. Accordingly, the treatment of cells for 2 h with cytotoxic doses of DPDT increased TBARS levels and decreased GSH/GSSH ratio in yeast and in V79 cells, indicating that DPDT can lead to increase lipid peroxidation and intracellular glutathione oxidation, characterizing an oxidative stress status. At the higher doses, DPDT generates DNA single and double strand breaks in V79 cells, as observed using the comet assay, at both the alkaline and the neutral versions without and with metabolic activation. DPDT induced pronounced oxidative DNA damage, determined using modified Comet assay with the enzymes formamidopyrimidine DNA-glycosylase (Fpg) and endonuclease III (Endo III) without and with metabolic activation. The treatment also induced an increase in the number of binucleated cells in the micronucleus test in V79 cells, showing mutagenic risk by this molecule at high concentrations. Finally, pre-incubation with N-acetylcysteine, which restored GSH to normal levels, reduce DPDT oxidant, genotoxic and mutagenic effects in yeast and V79 cells. In summary, the cellular effects of DPDT appear to be very complex and linked to its ability to impose disturbs in redox cellular homeostasis and in the ability to intercalate into DNA, which lead to DNA damage and breakage, cellular injury and cell death.

O ditelureto de difenila (DTDF) é um composto organotelurado simples e estável e é um potencial candidato de protótipos para o desenvolvimento de novas moléculas biologicamente ativas. Então, é importante avaliar os efeitos tóxicos desse composto. No presente estudo, foram avaliadas as propriedades citotóxicas, genotóxicas e mutagênicas do DTDF em vários modelos biológicos: em células de fibroblastos de pulmão de hamster chinês, em linhagens da levedura S. cerevisiae proficientes e deficientes em algumas vias de reparação de DNA e na bactéria Salmonela typhimurium. O DTDF pode induzir alteração no quadro de leitura em S. typhimurium e em linhagen selvagem haplóide de S. cereviviae. Assim, o DTDF apresenta um comportamento similar a um agente intercalante. Os mutantes de S. cerevisiae defectivos na reparação por excisão de bases e na reparação recombinacional mostraram elevada sensibilidade ao DTDF. Em células V79 tratadas com concentrações crescentes de DTDF, a atividade citotóxica, foi determinada usando ensaio de lactato desidrogenase no meio extracelular, ocorre na concentração de 1 µM após 2 h de exposição. Consistentemente, o tratamento das células por 2 h com concentrações de DTDF citotóxicas aumentaram os níveis de TBARS e diminuíram os níveis de GSH/GSSH em levedura e em células V79, indicando que DTDF pode levar ao aumento da peroxidação lipídica e da oxidação da glutationa intracelular, caracterizando um estado de estresse oxidatívo. Nas concentrações mais elevadas, o DTDF induziu a formação de quebras simples e duplas de DNA em células V79, como evidenciado pelo ensaio cometa, nas versões alcalina e neutra, na presença e ausência de ativação metabólica. O DTDF induziu a danos oxidativos ao DNA, determinados pelo ensaio cometa modificado empregando as endonucleases formamidopirimidina DNA-glicosilase (Fpg) e endonuclease III (endoIII) com e sem ativação metabólica. O tratamento também induziu aumento no número de células binucleadas no teste micronúcleo em células V79, demonstrando potencial mutagênico dessa molécula em altas concentrações. Finalmente, o pré-tratamento com N-acetilcisteina, que restaura o GSH ao nível normal, reduziu os efeitos oxidativos, genotóxicos e mutagênicos do DTDF em levedura e em células V79. Em resumo, os efeitos celulares do DTDF parecem ser muito complexos e ligados a sua habilidade induzir distúrbios na homeostase redox celular e na capacidade de intercalar no DNA, que conduzem a dano e a quebras do DNA, danos e morte celular. / Diphenyl ditelluride (DPDT) is a simple and stable organotellurium compound and it is a potential candidate to prototype for a development of novel biological active molecules. Thus, it is important to evaluate the toxic effects of this compound. In the present study, we evaluated the putative cytotoxic, genotoxic, and mutagenic properties of DPDT in various biological models: in V79 Chinese lung fibroblast cells, in strains of the yeast S.cerevisiae proficient and deficient in several DNA repair pathways and in Salmonella typhimurium. DPDT is able to induce frameshift mutations in S.typhimurium and in haploid wild type strain of S.cerevisiae. Thus, DPDT presents a behavior similar that of an intercalanting agent. Mutants of S.cerevisiae defective in base excision repair and in recombinational repair showed high sensitivity to DPDT. In V79 cells treated with increasing concentrations of DPDT, the cytotoxic activity, as determined using lactate dehydrogenase leakage assay, occurs in doses up to 1 µM after 2 h of exposure. Accordingly, the treatment of cells for 2 h with cytotoxic doses of DPDT increased TBARS levels and decreased GSH/GSSH ratio in yeast and in V79 cells, indicating that DPDT can lead to increase lipid peroxidation and intracellular glutathione oxidation, characterizing an oxidative stress status. At the higher doses, DPDT generates DNA single and double strand breaks in V79 cells, as observed using the comet assay, at both the alkaline and the neutral versions without and with metabolic activation. DPDT induced pronounced oxidative DNA damage, determined using modified Comet assay with the enzymes formamidopyrimidine DNA-glycosylase (Fpg) and endonuclease III (Endo III) without and with metabolic activation. The treatment also induced an increase in the number of binucleated cells in the micronucleus test in V79 cells, showing mutagenic risk by this molecule at high concentrations. Finally, pre-incubation with N-acetylcysteine, which restored GSH to normal levels, reduce DPDT oxidant, genotoxic and mutagenic effects in yeast and V79 cells. In summary, the cellular effects of DPDT appear to be very complex and linked to its ability to impose disturbs in redox cellular homeostasis and in the ability to intercalate into DNA, which lead to DNA damage and breakage, cellular injury and cell death.

Fitoplasmas são organismos procarióticos desprovidos de parede celular, parasitas intracelulares obrigatórios de floema e patogênicos às plantas. Numerosas doenças associadas a este tipo de agentes patogênicos têm sido frequentemente relatadas em espécies cultivadas e plantas daninhas. No presente estudo, sintomas tipicamente induzidos por fitoplasmas, tais como clorose e avermelhamento foliar, redução no tamanho das folhas, diminuição dos órgãos florais, superbrotamento de ramos e declínio da planta, foram observados em pomares de fruteiras de caroço como pessegueiro e nectarineira. Além disto, em campos de couve-flor, plantas daninhas conhecidas como mostarda-do-campo também manifestaram sintomas que pareciam ter sido provocados por fitoplamas, expressados por superbrotamento de ramos finos e redução no tamanho de folhas e flores. Assim, o presente trabalho teve por objetivos detectar, identificar e classificar a nível molecular os possíveis fitoplasmas associados às plantas sintomáticas citadas anteriormente, utilizando as técnicas de PCR, análise de RFLP virtual e o método de classificação on-line denominado de iPhyclassifier. Para tanto, o DNA das amostras das fruteiras de caroço e da erva daninha foi extraído com o auxílio de um kit comercial ou através do protocolo 2X CTAB. A detecção dos fitoplasmas foi conduzida por duplo PCR com os primers universais R16mF2/mR1 e SN910601/SN011119 na primeira reação e com o par R16F2n/R2 na segunda reação. Para a mostarda, a identificação dos fitoplasmas também foi realizada através de duplo PCR com os primers e R16(III)F2/R16(III)R1 específicos para fitoplasmas do grupo 16SrIII. A aplicação de PCR com primers universais permitiu a detecção consistente desses agentes nos tecidos das plantas sintomáticas de pessegueiro, nectarineira e mostarda-do-campo pela amplificação de um fragmento genômico de 1250 pb, correspondente ao gene 16S rRNA. Para todos os hospedeiros analisados, os produtos amplificados por duplo PCR com os primers universais foram purificados, clonados em Escherichia coli e submetidos ao sequenciamento. A análise de RFLP virtual e iPhyclassifier permitiram classificar os fitoplasmas encontrados em mostarda nos grupos 16SrIII e 16SrVII. Os fitoplasmas detectados na mostarda-do-campo, foram definitivamente classificados como representantes dos subgrupos 16SrIII-B, 16SrIII-J e 16SrIII-U e 16SrVII-B. Em relação aos fitoplasmas encontrados no pessegueiro e nectarineira, foi possível classificar os fitoplasmas nos grupos 16SrI e 16SrIII, sendo definitivamente classificados como representantes dos subgrupos 16SrI-B em pessegueiro, e em nectarineira, classificados em 16SrI-B e 16SrIII-J. / Phytoplasmas are prokaryotic organisms devoid of cell wall, obligate intracellular phloem parasites and pathogenic to plants. Numerous diseases associated with this type of pathogen have been frequently reported in cultivated species of plants and weeds. In this present study, symptoms typically induced by phytoplasmas, such a yellowing an reddeling leaves, small leaves and flowers, \"witches\' broom\" appearance on terminal new bud growth, and death in plants, were observed in orchards of stone fruit trees such as peach and nectarines. In addition, in fields of cauliflower, weeds known as mustard-field also exhibited symptoms that appeared to have been caused by phytoplasmas, expressed by thin branches and reduced leaf and flower size. The objective of this present study was to detect, identify and classify at molecular level the phytoplasmas possibly associated with the symptomatic plants. PCR techniques, virtual RFLP analysis and the online method known as iPhyclassifier were used. Total DNA was extracted using a commercial kit or through the CTAB protocol. The detection of phytoplasmas was conducted by nested PCR with the universal primers R16mF2/mR1 and SN910601/SN011119 in the first reaction and R16F2n/R2 pair in the second reaction. For mustard-field, the identification of the phytoplasmas was also performed through nested PCR with the primers R16(III) F2/R16(III) R1, which are specific to detection of 16SrIII group phytoplasmas. The application of PCR with universal primers allowed the consistent detection of these agents in the tissues in symptomatic plants of peach, nectarine and mustard-field by the amplification of a 1250 bp genomic fragment, corresponding to the 16S rRNA gene. For all hosts analyzed, the products amplified by nested PCR with the universal primers were purified, cloned in Escherichia coli and sequenced. The analysis of virtual RFLP and iPhyclassifier allowed to classify the phytoplasmas found in mustard in the 16SrIII and 16SrVII groups. The phytoplasmas detected in mustard-field were definitively classified as representatives of the subgroups 16SrIII-B, 16SrIII-J and 16SrIII-U and 16SrVII-B. The phytoplasmas found in the peach and nectarine were classified within the 16SrI and 16SrIII groups, as representatives of the subgroups 16SrI-B for peach and 16SrI-B and 16SrIII-J for nectarine.

Made available in DSpace on 2015-03-05T13:53:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 3 / Universidade do Vale do Rio dos Sinos / A expressão dos genes em procariotos é desencadeada quando a enzima RNApolimerase interage com uma região adjacente ao gene, chamada de promotor, onde se encontram os principais elementos regulatórios do processo de transcrição. Apesar do crescente avanço das técnicas experimentais em biologia molecular, caracterizar e identificar um número significante de promotores, presentes em um dado genoma, continua sendo uma tarefa demorada e cara. Abordagens in silico são bastante utilizadas para reconhecer essas regiões em procariotos. Entretanto, além do alto número de falsos positivos obtidos, elas enfrentam a inexistência de um número adequado de promotores conhecidos para identificar padrões conservados entre as espécies. Logo, um método criterioso e confiável para predizêlos em qualquer organismo procariótico ainda é um desafio. Esta dissertação propõe um protocolo de uso de hidden Markov models (HMMs) que emprega Estimação de Limiar de Decisão (ELD) e Análise de Discriminação (AD) neste problema. Quatro espécie / Gene expression on prokaryotes initiates when the RNA-polymerase enzyme interacts with DNA regions called promoters. In these regions are located the main regulatory elements of the transcription process. Despite the improvement of in vitro techniques for molecular biology analysis, characterizing and identifying a great number of promoters on a genome is a complex task. In silico approaches are usually employed to recognize theses regions on prokaryotes. Nevertheless, the main drawback is the absence of a large set of promoters to identify conserved patterns among the species. Hence, a in silico method to predict them on any species is a challenge. This work proposes a protocol to use hidden Markov models (HMMs) methodology with Decision Threshold Estimation and Discrimination Analysis on this problem. Four prokaryotic species are investigated (Escherichia coli, Bacillus subtilis, Helicobacter pylori e Helicobacter hepaticus). The influence of different aspects in the recognition and prediction are examined:

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:10:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CiaxaresMC.pdf: 595430 bytes, checksum: 97825450a670945169f3df28f7765add (MD5) Previous issue date: 2008-03-14 / The human activities responsible for the ambient degradation in the modern world are diverse. The industrial activities are preponderant in the question of the impact consequences for brazilian ecosystems. Amongst the human activities, the petroliferous industry in operation in Potiguar Petroliferous Basin (PPB) displays the constant risk of ambient impacts in the integrant cities, not only for the human populations and the environment, but also it reaches the native microorganisms of Caatinga ground and in the mangrove sediment. Not hindering, the elaboration of strategies of bioremediation for impacted areas pass through the knowledge of microbiota and its relations with the environment. Moreover, in the microorganism groups associated to oil, are emphasized the sulfate-reducing prokaryotes (SRP) that, in its anaerobic metabolism, these organisms participate of the sulfate reduction, discharging H2S, causing ambient risks and causing the corrosion of surfaces, as pipelines and tanks, resulting in damages for the industry. Some ancestries of PRS integrate the Archaea domain, group of microorganisms whose sequenced genomes present predominance of extremophilic adaptations, including surrounding with oil presence. This work has two correlated objectives: i) the detection and monitoring of the gene dsrB, gift in sulfate-reducing prokaryotes, through DGGE analysis in samples of mDNA of a mangrove sediment and semiarid soil, both in the BPP; ii) to relate genomic characteristics to the ecological aspects of Archaea through in silico studies, standing out the importance to the oil and gas industry. The results of the first work suggest that the petrodegraders communities of SRP persist after the contamination with oil in mangrove sediment and in semiarid soil. Comparing the populations of both sites, it reveals that there are variations in the size and composition during one year of experiments. In the second work, functional and structural factors are the probable cause to the pressure in maintenance of the conservation of the sequences in the multiple copies of the 16S rDNA gene. Is verified also the discrepancy established between total content GC and content GC of the same gene. Such results relating ribosomal genes and the ambient factors are important for metagenomic evaluations using PCR-DGGE. The knowledge of microbiota associated to the oil can contribute for a better destination of resources by the petroliferous industry and the development of bioremediation strategies. Likewise, search to lead to the best agreement of the performance of native microbiota in biogeochemical cycles in Potiguar Petroliferous Basin ecosystem / S?o diversas as atividades humanas respons?veis pela degrada??o ambiental observada no mundo moderno. As atividades industriais s?o preponderantes na quest?o das conseq??ncias impactantes para os ecossistemas brasileiros. Entre as atividades antr?picas, a ind?stria petrol?fera atuante na Bacia Petrol?fera Potiguar (BPP), exp?e a risco constante de impactos ambientais nos munic?pios integrantes, n?o s? as popula??es humanas e o meio ambiente, mas tamb?m atinge os microrganismos nativos do solo da Caatinga e no sedimento do manguezal. N?o obstante, a elabora??o de estrat?gias de biorremedia??o de ?reas impactadas perpassa, dentre outros aspectos, pelo conhecimento da microbiota e suas rela??es com o meio. Entre os grupos de microrganismos associados ao petr?leo, destacam-se os procariotos redutores de sulfato (PRS) que, em seu metabolismo anaer?bico, participam da redu??o do sulfato, liberando g?s sulf?drico, causando riscos ambientais e ocasionando a corros?o de superf?cies, como tubula??es e tanques, resultando em preju?zos para a ind?stria. Algumas linhagens de PRS integram o dom?nio Archaea, grupo de microrganismos cujos genomas seq?enciados apresentam predomin?ncia de adapta??es extremof?licas, incluindo ambientes com presen?a de petr?leo. Este trabalho tem dois objetivos correlacionados: i) detectar e monitorar o gene dsrB, presente em procariotos redutores de sulfato, por perfis de DGGE gerados a partir de amostras ambientais de mDNA do manguezal de Diogo Lopes, e do solo do semi-?rido da regi?o da BPP; ii) relacionar caracter?sticas gen?micas aos aspectos ecol?gicos de Archaea, ressaltando sua import?ncia para a ind?stria do petr?leo, atrav?s de estudos in silico. Os resultados do primeiro trabalho sugerem que as comunidades petrodegradadoras de PRS persistem ap?s a contamina??o por petr?leo em sedimento de manguezal e do solo do semi?rido. A compara??o entre as popula??es dos dois locais de amostragem revela que as mesmas apresentam varia??es em seu tamanho e composi??o ao longo de um ano de experimento. No segundo trabalho especula-se que fatores funcionais e estruturais s?o a causa da press?o para a manuten??o da conserva??o das seq??ncias nas m?ltiplas c?pias do gene 16S rDNA. Verifica-se tamb?m a discrep?ncia observada entre o conte?do GC total e conte?do GC do mesmo gene. Tais resultados relacionando genes ribossomais a fatores ambientais s?o importantes para avalia??es metagen?micas empregando PCR-DGGE. O conhecimento da microbiota associada ao petr?leo pode contribuir para uma melhor destina??o de recursos por parte da ind?stria petrol?fera e o desenvolvimento de estrat?gias de biorremedia??o. Outrossim, busca contribuir para o melhor entendimento da atua??o da microbiota nativa nos ciclos biogeoqu?micos em ecossistemas da Bacia Petrol?fera Potiguar

Fitoplasmas são organismos procarióticos desprovidos de parede celular, parasitas intracelulares obrigatórios de floema e patogênicos às plantas. Numerosas doenças associadas a este tipo de agentes patogênicos têm sido frequentemente relatadas em espécies cultivadas e plantas daninhas. No presente estudo, sintomas tipicamente induzidos por fitoplasmas, tais como clorose e avermelhamento foliar, redução no tamanho das folhas, diminuição dos órgãos florais, superbrotamento de ramos e declínio da planta, foram observados em pomares de fruteiras de caroço como pessegueiro e nectarineira. Além disto, em campos de couve-flor, plantas daninhas conhecidas como mostarda-do-campo também manifestaram sintomas que pareciam ter sido provocados por fitoplamas, expressados por superbrotamento de ramos finos e redução no tamanho de folhas e flores. Assim, o presente trabalho teve por objetivos detectar, identificar e classificar a nível molecular os possíveis fitoplasmas associados às plantas sintomáticas citadas anteriormente, utilizando as técnicas de PCR, análise de RFLP virtual e o método de classificação on-line denominado de iPhyclassifier. Para tanto, o DNA das amostras das fruteiras de caroço e da erva daninha foi extraído com o auxílio de um kit comercial ou através do protocolo 2X CTAB. A detecção dos fitoplasmas foi conduzida por duplo PCR com os primers universais R16mF2/mR1 e SN910601/SN011119 na primeira reação e com o par R16F2n/R2 na segunda reação. Para a mostarda, a identificação dos fitoplasmas também foi realizada através de duplo PCR com os primers e R16(III)F2/R16(III)R1 específicos para fitoplasmas do grupo 16SrIII. A aplicação de PCR com primers universais permitiu a detecção consistente desses agentes nos tecidos das plantas sintomáticas de pessegueiro, nectarineira e mostarda-do-campo pela amplificação de um fragmento genômico de 1250 pb, correspondente ao gene 16S rRNA. Para todos os hospedeiros analisados, os produtos amplificados por duplo PCR com os primers universais foram purificados, clonados em Escherichia coli e submetidos ao sequenciamento. A análise de RFLP virtual e iPhyclassifier permitiram classificar os fitoplasmas encontrados em mostarda nos grupos 16SrIII e 16SrVII. Os fitoplasmas detectados na mostarda-do-campo, foram definitivamente classificados como representantes dos subgrupos 16SrIII-B, 16SrIII-J e 16SrIII-U e 16SrVII-B. Em relação aos fitoplasmas encontrados no pessegueiro e nectarineira, foi possível classificar os fitoplasmas nos grupos 16SrI e 16SrIII, sendo definitivamente classificados como representantes dos subgrupos 16SrI-B em pessegueiro, e em nectarineira, classificados em 16SrI-B e 16SrIII-J. / Phytoplasmas are prokaryotic organisms devoid of cell wall, obligate intracellular phloem parasites and pathogenic to plants. Numerous diseases associated with this type of pathogen have been frequently reported in cultivated species of plants and weeds. In this present study, symptoms typically induced by phytoplasmas, such a yellowing an reddeling leaves, small leaves and flowers, \"witches\' broom\" appearance on terminal new bud growth, and death in plants, were observed in orchards of stone fruit trees such as peach and nectarines. In addition, in fields of cauliflower, weeds known as mustard-field also exhibited symptoms that appeared to have been caused by phytoplasmas, expressed by thin branches and reduced leaf and flower size. The objective of this present study was to detect, identify and classify at molecular level the phytoplasmas possibly associated with the symptomatic plants. PCR techniques, virtual RFLP analysis and the online method known as iPhyclassifier were used. Total DNA was extracted using a commercial kit or through the CTAB protocol. The detection of phytoplasmas was conducted by nested PCR with the universal primers R16mF2/mR1 and SN910601/SN011119 in the first reaction and R16F2n/R2 pair in the second reaction. For mustard-field, the identification of the phytoplasmas was also performed through nested PCR with the primers R16(III) F2/R16(III) R1, which are specific to detection of 16SrIII group phytoplasmas. The application of PCR with universal primers allowed the consistent detection of these agents in the tissues in symptomatic plants of peach, nectarine and mustard-field by the amplification of a 1250 bp genomic fragment, corresponding to the 16S rRNA gene. For all hosts analyzed, the products amplified by nested PCR with the universal primers were purified, cloned in Escherichia coli and sequenced. The analysis of virtual RFLP and iPhyclassifier allowed to classify the phytoplasmas found in mustard in the 16SrIII and 16SrVII groups. The phytoplasmas detected in mustard-field were definitively classified as representatives of the subgroups 16SrIII-B, 16SrIII-J and 16SrIII-U and 16SrVII-B. The phytoplasmas found in the peach and nectarine were classified within the 16SrI and 16SrIII groups, as representatives of the subgroups 16SrI-B for peach and 16SrI-B and 16SrIII-J for nectarine.

Os fitoplasmas são organismos procariotos sem parede celular, que habitam as células do floema das plantas e são transmitidos, principalmente, por cigarrinhas sugadoras de floema. Este patógeno é responsável por causar doenças em diversas espécies vegetais, provocando a expressão de diversos sintomas, entre os quais podem ser destacados a redução do tamanho foliar, amarelecimento das folhas, superbrotamento de ramos e enfezamento da planta hospedeira. Entre os anos de 2013 e 2014, plantas de três espécies vegetais com sintomas característicos de infecção causada por fitoplasmas foram observadas no estado de São Paulo. O DNA total foi extraído a partir de plantas de couve-flor com sintomas de nanismo, malformação da inflorescência e necrose dos vasos do floema; de plantas da ornamental conhecida por árvore-da-felicidade com sintomas amarelecimento e redução do limbo foliar; e de plantas de Alho-poró com sintomas de enfezamento. Por meio do teste de PCR conduzido em sua maioria com os primers P1A/16S-SR foi possível detectar fitoplasmas nas três espécies vegetais testadas. Os fragmentos genômicos correspondentes ao 16S rRNA dos fitoplasmas foram sequenciados e identificados. Nas plantas de couve-flor e da árvore-da-felicidade foram identificados fitoplasmas afilados ao grupo 16SrVII-B, através da análise virtual de RFLP, cálculo do coeficientes de similaridade (F) e análise filogenética. Para ambas as espécies, este é o primeiro relato da ocorrência de representantes deste grupo, nas condições brasileiras. Nas plantas de Alho-poró foram identificados fitoplasmas afiliados ao subgrupo 16SrIII-J e ao grupo 16SrXIII, com base na análise dos genes 16S rRNA, SecY e proteína ribossomal, conduzidas através de análise virtual de RFLP, valores de coeficientes de similaridade e análise filogenética. Para o fitoplasma membro do grupo 16SrXIII foram identificadas quatro estirpes, uma delas afiliada ao subgrupo 16SrXIII-E e as demais como prováveis representantes de novos subgrupos. O presente estudo se constitui em uma contribuição ao conhecimento de novos patossistemas envolvendo fitoplasmas, bem como à caracterização molecular de fitoplasmas baseadas em diferentes genes marcadores, atualmente usados para a classificação de representantes deste grupo emergente de agentes causais de doenças de plantas. / The phytoplasmas are prokaryotic organisms without cell walls, which inhabit the phloem cells of plants and are transmitted mainly by leafhoppers sucking the phloem. This pathogen is responsible for causing diseases in various plant species, leading to expression of many symptoms, among which can be highlighted the reduction of leaf size, leaf yellowing, shoots proliferation and stunting of the plant host. Between the years 2013 and 2014, three plant species with characteristic symptoms of infection caused by phytoplasma were observed in São Paulo. Total DNA was extracted from cauliflower plants with symptoms of stunting, malformation of the inflorescence and necrosis of the phloem; ornamental plants known for Ming Aralia with symptoms yellowing and little leaves; and leek plants with symptoms of stunting. Through the PCR test conducted mostly with the primers P1A/16S-SR was possible to detect phytoplasmas in the three species of plants. The genomic fragments corresponding of 16S rRNA gene of the phytoplasma were sequenced and identified. In plants of cauliflower and Ming Aralia were identified phytoplasmas belonging to 16SrVII-B group through virtual RFLP analysis, calculation of similarity coefficients (F) and phylogenetic analysis. For both species, this is the first report of the occurrence of representatives of this group, in Brazilian conditions. In leek plants were identified phytoplasmas affiliated with 16SrIII-J subgroup, and the 16SrXIII group, based on the analysis of the 16S rRNA, SecY and ribosomal protein genes, conducted through virtual analysis of RFLP, similarity coefficient values and phylogenetic analysis. For the phytoplasma member of group 16SrXIII were identified four strains, one affiliated with 16SrXIII-E subgroup and the others as probable representatives of new subgroups. This study constitutes a contribution to knowledge of new pathosystems involving phytoplasmas and the molecular characterization of phytoplasma based on different marker genes, currently used for the classification of representatives of this emerging group of plant pathogens.