A leptospirose é uma zoonose de distribuição mundial, com maior incidência nas regiões tropicais. As bactérias que causam a doença pertencem ao gênero Leptospira, família Leptospiracea e ordem Spirochaetales. A leptospirose é mantida na natureza pela colonização persistente dos túbulos renais proximais dos animais portadores. Uma estratégia adotada por estas espiroquetas para sobreviver à ação do sistema imune inato do hospedeiro é a capacidade que possuem de interagir com os reguladores do sistema complemento Fator H (FH) e proteína de ligação a C4b (C4BP). O sistema complemento é um componente vital da imunidade inata, uma vez que desempenha um papel crucial na defesa do hospedeiro, particularmente contra bactérias Gram-negativas. Dados recentes gerados por nosso grupo mostraram que C4BP interage com a proteína de superfície LcpA de Leptospira. Com cerca de 20 kDa, essa proteína é capaz de se ligar a C4BP purificado ou solúvel no soro de maneira dose-dependente. Uma vez ligado à proteína, C4BP permanece funcional agindo como cofator de Fator I na clivagem de C4b. O presente estudo teve como principal objetivo avaliar a interação da proteína LcpA com FH humano, principal regulador solúvel da via alternativa do sistema complemento. A proteína LcpA e suas porções N-Terminal, Intermediária e CTerminal recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade a metal a partir da fração insolúvel. A interação dessas proteínas com FH foi avaliada por dois métodos distintos: ELISA e Western blot com overlay. Os resultados indicaram que a porção C-Terminal da proteína LcpA é responsável pela interação com FH. Curiosamente, C4BP também se liga a esse domínio da proteína. Uma vez que esses dois reguladores solúveis do sistema complemento interagem com o mesmo segmento da LcpA, realizaram-se, a seguir, ensaios de competição com o objetivo de avaliar se ambos compartilhariam os mesmos sítios de interação. Os dados mostraram que FH e C4BP devem se ligar a sequências distintas desta proteína. Com o objetivo de se avaliar a funcionalidade de FH ligado à LcpA, realizou-se um ensaio para investigar sua atividade de co-fator de Fator I na clivagem de C3b. Produtos de degradação de 46 kDa e 43 kDa da cadeia α' de C3b foram detectados, indicando que FH permanece funcional. Em se tratando de uma proteína com funções relacionadas ao processo de evasão ao sistema imune inato, decidiu-se realizar ensaios de desafio em modelo de hamster com a finalidade de se avaliar seu potencial imunoprotetor. Os três ensaios realizados indicaram que a proteína não é capaz de conferir proteção. Os ensaios de ELISA visando à avaliação dos títulos de anticorpos mostraram que LcpA não é imunogênica, fato que explica os resultados dos ensaios de desafio observados. Portanto, embora interaja com moléculas do hospedeiro e pareça contribuir para o processo de evasão ao sistema imune inato, essa proteína de membrana não se mostrou promissora como candidato vacinal contra leptospirose. / Leptospirosis is a zoonosis of global distribution, with higher incidence in tropical areas. The bacteria that cause the disease belong to the genus Leptospira, family Leptospiracea and order Spirochaetales. Leptospirosis is maintained in nature by persistent colonization of proximal renal tubules of carrier animals. One strategy adopted by these spirochetes to escape from host´s innate immune system is the ability to interact with the complement regulators Factor H (FH) and C4b Binding Protein (C4BP). The complement system is a vital component of the innate immune system, being crucial for host´s defense, particularly against Gram-negative bacteria. According to our recent published data, C4BP interacts with the leptospiral surface protein LcpA. This 20 kDa outer membrane protein binds both purified and serum C4BP in a dose-dependent manner. Once bound, C4BP remains functional acting as a cofactor for Factor I in the cleavage of C4b. In the present study we evaluated the interaction of LcpA with human FH, the main soluble regulator of the alternative pathway of complement. The intact protein as well as its N-terminal, intermediate and C-terminal portions were purified by metal-affinity chromatography from the insoluble pellet. The interaction of these proteins with FH was evaluated by two distinct methods: ELISA and Western blot overlay. Our results indicate that the C-terminal domain of LcpA mediates interaction with FH, and also with C4BP. Since both complement regulators interact with the same fragment of LcpA, we next performed competition assays to assess if they would share binding sites. According to our data, FH and C4BP have distinct binding sites on LcpA. Cofactor activity of FH bound to immobilized LcpA was confirmed by detecting the C3b α' chain cleavage fragments of 46 and 43 kDa upon incubation with Factor I, thus indicating that it remains functionally active. Given the LcpA´s role in host´s innate immune evasion, we also evaluated its vaccine potential in a hamster model. Data from three challenge assays indicated that the protein can not afford protection. Low ELISA antibody titers of hamsters immunized with LcpA were observed, which strongly suggests that this protein is not immunogenic. In conclusion, LcpA interacts with host´s molecules and seems to contribute to the bacterial immune evasion. Nevertheless, this outer membrane protein is not a promising vaccine candidate against leptospirosis.

A leptospirose é uma zoonose de distribuição mundial, com maior incidência nas regiões tropicais. As bactérias que causam a doença pertencem ao gênero Leptospira, família Leptospiracea e ordem Spirochaetales. A leptospirose é mantida na natureza pela colonização persistente dos túbulos renais proximais dos animais portadores. Uma estratégia adotada por estas espiroquetas para sobreviver à ação do sistema imune inato do hospedeiro é a capacidade que possuem de interagir com os reguladores do sistema complemento Fator H (FH) e proteína de ligação a C4b (C4BP). O sistema complemento é um componente vital da imunidade inata, uma vez que desempenha um papel crucial na defesa do hospedeiro, particularmente contra bactérias Gram-negativas. Dados recentes gerados por nosso grupo mostraram que C4BP interage com a proteína de superfície LcpA de Leptospira. Com cerca de 20 kDa, essa proteína é capaz de se ligar a C4BP purificado ou solúvel no soro de maneira dose-dependente. Uma vez ligado à proteína, C4BP permanece funcional agindo como cofator de Fator I na clivagem de C4b. O presente estudo teve como principal objetivo avaliar a interação da proteína LcpA com FH humano, principal regulador solúvel da via alternativa do sistema complemento. A proteína LcpA e suas porções N-Terminal, Intermediária e CTerminal recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade a metal a partir da fração insolúvel. A interação dessas proteínas com FH foi avaliada por dois métodos distintos: ELISA e Western blot com overlay. Os resultados indicaram que a porção C-Terminal da proteína LcpA é responsável pela interação com FH. Curiosamente, C4BP também se liga a esse domínio da proteína. Uma vez que esses dois reguladores solúveis do sistema complemento interagem com o mesmo segmento da LcpA, realizaram-se, a seguir, ensaios de competição com o objetivo de avaliar se ambos compartilhariam os mesmos sítios de interação. Os dados mostraram que FH e C4BP devem se ligar a sequências distintas desta proteína. Com o objetivo de se avaliar a funcionalidade de FH ligado à LcpA, realizou-se um ensaio para investigar sua atividade de co-fator de Fator I na clivagem de C3b. Produtos de degradação de 46 kDa e 43 kDa da cadeia α' de C3b foram detectados, indicando que FH permanece funcional. Em se tratando de uma proteína com funções relacionadas ao processo de evasão ao sistema imune inato, decidiu-se realizar ensaios de desafio em modelo de hamster com a finalidade de se avaliar seu potencial imunoprotetor. Os três ensaios realizados indicaram que a proteína não é capaz de conferir proteção. Os ensaios de ELISA visando à avaliação dos títulos de anticorpos mostraram que LcpA não é imunogênica, fato que explica os resultados dos ensaios de desafio observados. Portanto, embora interaja com moléculas do hospedeiro e pareça contribuir para o processo de evasão ao sistema imune inato, essa proteína de membrana não se mostrou promissora como candidato vacinal contra leptospirose. / Leptospirosis is a zoonosis of global distribution, with higher incidence in tropical areas. The bacteria that cause the disease belong to the genus Leptospira, family Leptospiracea and order Spirochaetales. Leptospirosis is maintained in nature by persistent colonization of proximal renal tubules of carrier animals. One strategy adopted by these spirochetes to escape from host´s innate immune system is the ability to interact with the complement regulators Factor H (FH) and C4b Binding Protein (C4BP). The complement system is a vital component of the innate immune system, being crucial for host´s defense, particularly against Gram-negative bacteria. According to our recent published data, C4BP interacts with the leptospiral surface protein LcpA. This 20 kDa outer membrane protein binds both purified and serum C4BP in a dose-dependent manner. Once bound, C4BP remains functional acting as a cofactor for Factor I in the cleavage of C4b. In the present study we evaluated the interaction of LcpA with human FH, the main soluble regulator of the alternative pathway of complement. The intact protein as well as its N-terminal, intermediate and C-terminal portions were purified by metal-affinity chromatography from the insoluble pellet. The interaction of these proteins with FH was evaluated by two distinct methods: ELISA and Western blot overlay. Our results indicate that the C-terminal domain of LcpA mediates interaction with FH, and also with C4BP. Since both complement regulators interact with the same fragment of LcpA, we next performed competition assays to assess if they would share binding sites. According to our data, FH and C4BP have distinct binding sites on LcpA. Cofactor activity of FH bound to immobilized LcpA was confirmed by detecting the C3b α' chain cleavage fragments of 46 and 43 kDa upon incubation with Factor I, thus indicating that it remains functionally active. Given the LcpA´s role in host´s innate immune evasion, we also evaluated its vaccine potential in a hamster model. Data from three challenge assays indicated that the protein can not afford protection. Low ELISA antibody titers of hamsters immunized with LcpA were observed, which strongly suggests that this protein is not immunogenic. In conclusion, LcpA interacts with host´s molecules and seems to contribute to the bacterial immune evasion. Nevertheless, this outer membrane protein is not a promising vaccine candidate against leptospirosis.

Mais de 25% das mortes em humanos são causadas por doenças infecciosas. Muitas dessas doenças são emergentes e de importância zoonótica. A leptospirose é considerada uma das mais importantes doenças zoonóticas emergentes. Sua distribuição global e seu potencial epidêmico constituem um problema de Saúde Pública. Estima-se que ocorram anualmente 1.03 milhão de casos e 58.900 mortes por leptospirose em todo o mundo, mas, em se tratando de uma doença negligenciada, a real prevalência da doença é subestimada. O Rattus norvegicus é o principal reservatório associado a epidemias urbanas. Leptospiras possuem a capacidade de aderir às células dos túbulos renais e interagem com muitos componentes da matriz extracelular do hospedeiro, o que facilita a invasão e colonização. Possuem também mecanismos de evasão ao sistema complemento do hospedeiro. A identificação destes mecanismos tem sido alvo de pesquisas desenvolvidas por vários grupos. Enolase e Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) pertencem à categoria de proteínas conhecidas como proteínas moonlighting. Estas englobam um grupo de proteínas multifuncionais. Enolases são metaloenzimas citossólicas que catalisam a conversão de 2-D-fosfo-glicerato em fosfoenolpiruvato. Apesar de não possuírem sequência clássica de ancoragem à membrana, são encontradas na superfície de uma variedade de células eucarióticas e procarióticas, tendo a capacidade de interagir com plasminogênio. GAPDH é uma enzima da via glicolítica responsável pela conversão de gliceraldeído 3-fosfato em D glicerato 1,3-bifosfato. Estudos recentes mostram que a GAPDH tem múltiplas funções independentes do seu papel no metabolismo de energia. Neste trabalho demonstrou-se que GAPDH de Leptospira está localizada na superfície da bactéria, e que tanto GAPDH como enolase interagem com plasminogênio, o qual é convertido em sua forma ativa, a plasmina, na presença do ativador exógeno uPA. A capacidade da plasmina gerada sobre a enolase de clivar substratos fisiológicos foi testada. A cadeia β do fibrinogênio foi totalmente degradada, e a molécula vitronectina parcialmente clivada em fragmentos de 61- 64 kDa. Ainda, mostrou-se que a enolase interage com os reguladores do complemento C4BP e FH. Ambos os reguladores permanecem funcionais, agindo como co-fatores de Fator I na degradação de C3b (FH) e C4b (C4BP). No que diz respeito à GAPDH, os dados claramente mostram que a plasmina ligada à GAPDH degrada as cadeias α e β do fibrinogênio, assim como a isoforma de 75 kDa da vitronectina, de forma tempodependente. Ainda, na presença de GAPDH, a plasmina degradou totalmente a cadeia α de C5, mas não degradou C3b. Por fim, resultados obtidos por Far Western Blot revelam que GAPDH interage com C1q, molécula-chave da via clássica do sistema complemento, e também com fibronectina plasmática, podendo, portanto, contribuir para a adesão da bactéria durante a colonização do hospedeiro. Em suma, no presente estudo caracterizamos duas novas proteínas moonlighting de Leptospira: enolase e GAPDH. A caracterização funcional destas proteínas, assim como a identificação das moléculas-alvo do hospedeiro com as quais essas proteínas são capazes de interagir, podem contribuir para a compreensão dos mecanismos de invasão, disseminação e evasão imune utilizados por leptospiras patogênicas. / More than 25% of human deaths are caused by infectious diseases, among which a large number are emerging and of zoonotic importance. Leptospirosis is considered one of the most important emerging zoonotic diseases. Its global distribution and its epidemic potential constitute a Public Health problem. It is estimated that approximately 1,03 million cases and 58,900 deaths from leptospirosis occur annually worldwide, but as a neglected disease, its actual prevalence is underestimated. Rattus norvegicus is the main reservoir associated with urban epidemics. Leptospires have the capacity to adhere to renal tubule cells which facilitates invasion and colonization. They also have mechanisms to evade the host\'s complement system. The identification of these mechanisms has been the object of research developed by several groups. Enolase and Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) belong to the category of proteins known as moonlighting proteins. These encompass a group of multifunctional proteins. Enolases are cytosolic metalloenzymes that catalyze the conversion of 2-D-phosphoglycerate to phosphoenolpyruvate. Although they do not have a classic membrane anchor sequence, they are found on the surface of a variety of eukaryotic and prokaryotic cells, and have the capacity to interact with plasminogen. GAPDH is an enzyme of the glycolytic pathway responsible for the conversion of glyceraldehyde 3-phosphate to D-glyceryl 1,3-bisphosphate. Recent studies show that GAPDH has multiple functions independent of its role in energy metabolism. In this work we demonstrated that Leptospira GAPDH is located on the surface of the bacterium, and that both GAPDH and enolase interact with plasminogen, which is converted into its active form, plasmin, in the presence of the exogenous activator uPA. The capacity of plasmin-bound enolase to cleave physiological substrates was tested. The β-chain of fibrinogen was totally degraded, and vitronectin was partially cleaved into fragments of 61-64 kDa. Further, enolase interacts with the complement regulators C4BP and FH. Both regulators remain functional, acting as cofactors for Factor I on the degradation of C3b (FH) and C4b (C4BP). With regard to GAPDH, the date clearly show that plasmin bound to GAPDH degrades the α and β chains of fibrinogen as well as the 75-kDa isoform of vitronectin, in a time-dependent manner. Furthermore, in the presence of GAPDH, plasmin totally degraded C5 α-chain, but did not degrade C3b. Finally, our Far Western Blot data reveal that GAPDH interacts with C1q, a key molecule of the classical pathway of the complement system, and also interacts with plasma fibronectin, and may therefore contribute to bacterial adhesion during host colonization. Briefly, in the present study we characterized two novel moonlighting proteins of Leptospira: enolase and GAPDH. The functional characterization of these proteins, as well as the identification of the host target molecules with which these proteins are capable of interacting, may contribute to the understanding of the mechanisms of invasion, dissemination and immune evasion used by pathogenic leptospires.

A leptospirose é causada por bactérias que pertencem ao gênero Leptospira. Em um estudo realizado por nosso grupo, observou-se que as proteases secretadas por leptospiras patogênicas foram capazes de clivar a molécula C3 do Complemento e seus fragmentos C3b e iC3b, além de Fator B, C4b e C2. Neste trabalho expandimos a análise da atividade proteolítica sobre os componentes do Complexo de Ataque à Membrana (MAC): C6, C7, C8 e C9. Nós observamos que essas proteases clivam todos os componentes do MAC inclusive o complexo solúvel formado e que essas clivagens ocorrem de modo tempo-dependente. Além disso, as clivagens dessas moléculas ocorrem de modo seletivo, pois mesmo utilizando quantidades reduzidas de sobrenadantes ainda foi possível observar produtos de clivagem. A atividade proteolítica foi inibida pela 1,10fenantrolina, indicando a participação de metaloproteases. O reconhecimento de quais moléculas do MAC são clivadas por proteases de leptospiras patogênicas pode contribuir para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas na infecção por estes patógenos. / Leptospirosis is a zoonosis caused by spirochetes from the genus Leptospira. In a previous study, our group observed that the proteases secreted by Pathogenic Leptospira were capable of cleaving C3 of Complement, as well as the fragments C3b and iC3b, Factor B (Alternative Pathway), C4 and C2 (Classical and Lectin Pathways). In this work, we analyze the activity of the leptospiral proteases on the components of Membrane Attack Complex (MAC). We observed that the protease cleaves all MAC components including soluble complex formed and that these cleavages occur in a time-dependent manner and in a selective way, since even when reduced quantities of supernatants were used, the cleavage products were still observed. The proteolytic activity was inhibited by 1,10phenanthroline, indicating the participation of metalloproteinases. The recognition that MAC molecules are cleaved by proteases of pathogenic leptospires can contribute to the development of therapeutic strategies for the infection by these pathogens.

A leptospirose é uma zoonose causada por leptospiras patogênicas que possuem estratégias para driblar a ação do sistema complemento ao interagir com diversos reguladores negativos, como a vitronectina. Neste projeto, avaliou-se a interação de vitronectina com três proteínas de membrana de Leptospira: LigA, LigB e LcpA. Verificou-se que essas interações ocorrem nas porções C-terminais das proteínas e nos domínios de ligação com heparina da vitronectina. Essas proteínas também se ligam a C9 e são capazes de impedir a formação do poro in vitro e a formação do MAC em um ensaio clássico de hemólise. Essas proteínas de Leptospira interagem com diversos reguladores negativos do sistema complemento. Ensaios de competição demonstram que estes reguladores interagem simultaneamente com as proteínas através de sítios distintos. A caracterização funcional de proteínas e a descoberta de novos mecanismos utilizados por esse patógeno para sobreviver no hospedeiro podem auxiliar nossa compreensão no que diz respeito a aspectos relacionados à clínica e à prevenção da leptospirose. / Leptospirosis is a zoonotic disease caused by pathogenic Leptospira that have strategies to escape the action of the complement system interacting with several negative regulators, such as vitronectin. In this project, we evaluated the interaction of vitronectin with three Leptospira membrane proteins: LigA, LigB and LcpA. It has been found that such interactions occur at the C-terminal portions of these proteins and the heparin binding domain of vitronectin. These proteins also bind to C9 and are capable of preventing the formation of the pore in vitro and the formation of MAC in a classical test of hemolysis. These proteins interact with various Leptospira negative regulators of the complement system. Competition assays demonstrated that both interact with these regulatory proteins through distinct sites. The functional characterization of these proteins and the discovery of new mechanisms used by this pathogen to survive in the host may help our understanding with regard to clinical aspects and prevention of leptospirosis.

A leptospirose é causada por bactérias que pertencem ao gênero Leptospira. Em um estudo realizado por nosso grupo, observou-se que as proteases secretadas por leptospiras patogênicas foram capazes de clivar a molécula C3 do Complemento e seus fragmentos C3b e iC3b, além de Fator B, C4b e C2. Neste trabalho expandimos a análise da atividade proteolítica sobre os componentes do Complexo de Ataque à Membrana (MAC): C6, C7, C8 e C9. Nós observamos que essas proteases clivam todos os componentes do MAC inclusive o complexo solúvel formado e que essas clivagens ocorrem de modo tempo-dependente. Além disso, as clivagens dessas moléculas ocorrem de modo seletivo, pois mesmo utilizando quantidades reduzidas de sobrenadantes ainda foi possível observar produtos de clivagem. A atividade proteolítica foi inibida pela 1,10fenantrolina, indicando a participação de metaloproteases. O reconhecimento de quais moléculas do MAC são clivadas por proteases de leptospiras patogênicas pode contribuir para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas na infecção por estes patógenos. / Leptospirosis is a zoonosis caused by spirochetes from the genus Leptospira. In a previous study, our group observed that the proteases secreted by Pathogenic Leptospira were capable of cleaving C3 of Complement, as well as the fragments C3b and iC3b, Factor B (Alternative Pathway), C4 and C2 (Classical and Lectin Pathways). In this work, we analyze the activity of the leptospiral proteases on the components of Membrane Attack Complex (MAC). We observed that the protease cleaves all MAC components including soluble complex formed and that these cleavages occur in a time-dependent manner and in a selective way, since even when reduced quantities of supernatants were used, the cleavage products were still observed. The proteolytic activity was inhibited by 1,10phenanthroline, indicating the participation of metalloproteinases. The recognition that MAC molecules are cleaved by proteases of pathogenic leptospires can contribute to the development of therapeutic strategies for the infection by these pathogens.

A leptospirose é uma zoonose causada por leptospiras patogênicas que possuem estratégias para driblar a ação do sistema complemento ao interagir com diversos reguladores negativos, como a vitronectina. Neste projeto, avaliou-se a interação de vitronectina com três proteínas de membrana de Leptospira: LigA, LigB e LcpA. Verificou-se que essas interações ocorrem nas porções C-terminais das proteínas e nos domínios de ligação com heparina da vitronectina. Essas proteínas também se ligam a C9 e são capazes de impedir a formação do poro in vitro e a formação do MAC em um ensaio clássico de hemólise. Essas proteínas de Leptospira interagem com diversos reguladores negativos do sistema complemento. Ensaios de competição demonstram que estes reguladores interagem simultaneamente com as proteínas através de sítios distintos. A caracterização funcional de proteínas e a descoberta de novos mecanismos utilizados por esse patógeno para sobreviver no hospedeiro podem auxiliar nossa compreensão no que diz respeito a aspectos relacionados à clínica e à prevenção da leptospirose. / Leptospirosis is a zoonotic disease caused by pathogenic Leptospira that have strategies to escape the action of the complement system interacting with several negative regulators, such as vitronectin. In this project, we evaluated the interaction of vitronectin with three Leptospira membrane proteins: LigA, LigB and LcpA. It has been found that such interactions occur at the C-terminal portions of these proteins and the heparin binding domain of vitronectin. These proteins also bind to C9 and are capable of preventing the formation of the pore in vitro and the formation of MAC in a classical test of hemolysis. These proteins interact with various Leptospira negative regulators of the complement system. Competition assays demonstrated that both interact with these regulatory proteins through distinct sites. The functional characterization of these proteins and the discovery of new mechanisms used by this pathogen to survive in the host may help our understanding with regard to clinical aspects and prevention of leptospirosis.

A leptospirose é uma zoonose causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. A doença representa um grave problema de saúde pública nos países tropicais subdesenvolvidos. Mais de 500.000 casos graves de leptospirose são notificados a cada ano e a taxa de mortalidade excede 10% (World Health Organization, 1999). Os roedores são o principal reservatório urbano da doença, e eliminam leptospiras viáveis no meio ambiente ao longo de toda a vida. As bactérias entram no hospedeiro por abrasões na pele ou por membranas mucosas e rapidamente se espalham pelo organismo atingindo vários órgãos. A identificação de mecanismos de invasão e de evasão imune apresentados por leptospiras patogênicas é extremamente relevante e tem sido alvo de pesquisas recentes desenvolvidas por vários grupos. Nesse contexto, a caracterização funcional de proteínas de membrana externa de Leptospira, principais alvos de interação com moléculas do hospedeiro, é de grande importância. O Fator de Elongação Tu (EF-Tu), uma proteína bacteriana abundante envolvida na síntese protéica, pertence à categoria das proteínas conhecidas como \"moonlighting\". Tais moléculas possuem a capacidade de exercer mais de uma função e, normalmente, localizam-se em diferentes compartimentos da célula. Há relatos de que EF-Tu de agentes patogênicos possa atuar como um fator de virulência. No presente trabalho, demonstrou-se que EF-Tu de Leptospira está localizado na superfície da bactéria e possui funções adicionais, sendo receptor para moléculas presentes no plasma do hospedeiro. Tal proteína interage com vários componentes da matriz extracellular e também com plasminogênio, de maneira dosedependente. Resíduos de lisina são importantes para essa interação. Plasminogênio ligado a EF-Tu é convertido em sua forma ativa, plasmina, que, por sua vez, é capaz de clivar os substratos naturais C3b e fibrinogênio. EF-Tu de Leptospira também se liga a Fator H, principal regulador da via alternativa do sistema complemento, e este mantém sua atividade funcional ao agir como co-fator de Fator I na clivagem de C3b. O potencial imunoprotetor de EF-Tu em modelo animal foi avaliado, tendo em vista o alto grau de conservação da proteína em diferentes espécies de Leptospira. EF-Tu não conferiu proteção significativa e, portanto, não deve ser considerado como um candidato vacinal contra a leptospirose. Em suma, EF-Tu de Leptospira deve contribuir para o processo de invasão e evasão ao sistema imune inato do hospedeiro, inativando o sistema complemento. Tanto quanto é do nosso conhecimento, essa é a primeira descrição de uma proteína \"moonlighting\" em Leptospira. / Leptospirosis is a zoonosis caused by pathogenic bacteria from the genus Leptospira. The disease represents a serious public health problem in underdeveloped tropical countries. More than 500,000 cases of severe leptospirosis are reported each year, with mortality rates exceeding 10% (World Health Organization, 1999). Rodents are the main urban reservoir of the disease, shedding viable leptospires throughout their lives in the environment. Leptospires infect hosts through small abrasions in the skin or mucous membranes and they rapidly disseminate to target organs. The identification of invasion mechanisms and immune evasion strategies employed by pathogenic leptospires is of great relevance. In this context, functional characterization of leptospiral outer membrane proteins, which represent the main targets for interaction with host molecules, is extremely important. The elongation factor Tu (EF-Tu), an abundant bacterial protein involved in protein synthesis, has been shown to display moonlighting activities. Known to perform more than one function at different times or in different places, it is found in several subcellular locations in a single organism, and may serve as a virulence factor in a range of important human pathogens. In this work we demonstrate that Leptospira EF-Tu is surface-exposed and performs additional roles as a cell-surface receptor for host plasma proteins. It interacts with several extracellular matrix components and also binds plasminogen in a dose-dependent manner. Lysine residues are critical for this interaction. Bound plasminogen is converted to active plasmin, which, in turn, is able to cleave the natural substrates C3b and fibrinogen. Leptospira EF-Tu also acquires Factor H (FH), the main soluble regulator of the alternative pathway of the complement system. FH bound to immobilized EF-Tu displays cofactor activity, mediating C3b degradation by Factor I (FI). Given the wide distribution of EF-Tu among Leptospira species, its immunoprotective potential was evaluated in an animal model. EF-Tu was not able to afford significant immunoprotection, and might not be considered a vaccine candidate against leptospirosis. In conclusion, EF-Tu may contribute to leptospiral tissue invasion and complement inactivation. To our knowledge, this is the first description of a leptospiral protein exhibiting moonlighting activities.

A leptospirose é uma zoonose causada por leptospiras patogênicas. Para estabelecer a infecção, estas bactérias desenvolveram estratégias de escape ao sistema complemento. Neste trabalho demonstramos que o sobrenadante de cultura de leptospiras patogênicas é capaz de inibir as três vias do complemento. Observamos que esse sobrenadante possui atividade proteolítica sobre C3, C3b e iC3b, além do FB (via alternativa), C2 e C4b (via clássica e das lectinas). As proteínas C3, C4, C2 e FB também foram clivadas quando soro humano normal (SHN) foi utilizado como fonte de complemento. Demonstramos que as proteases atuam em conjunto com os reguladores do hospedeiro Fator I e Fator H na clivagem de C3b. As clivagens foram inibidas pela 1,10-fenantrolina, sugerindo a participação de metaloproteases. Metaloproteases de leptospira da família das termolisinas foram produzidas como proteínas recombinantes e clivaram C3 no SHN. Concluímos que proteases de leptospiras patogênicas podem desativar moléculas do complemento e são potencias alvos para novas terapias em leptospirose. / Leptospirosis is a zoonotic disease caused by pathogenic Leptospira. To establish the infection, these bacteria have developed strategies to escape the complement system. In this work, we demonstrate that culture supernatant from pathogenic Leptospira is capable of inhibiting the three complement pathways. We observe that this supernatant possess proteolytic activity under C3, C3b and iC3b, FB (alternative pathway), C2 and C4b (classical and lectin pathways). The proteins C3, C4, C2 and FB were also cleaved when normal human serum (NHS) was used as a source of complement. We demonstrate that these proteases act together with the host regulators Factor I and Factor H in C3b cleavage. The cleavages were inhibited by 1,10-phenanthroline, suggesting the involvement of metalloproteinases. Leptospira metalloproteinases from the thermolysin family were produced as recombinant proteins and cleaved C3 in NHS. We concluded that proteases from pathogenic Leptospira can inactivate complement molecules and are potential targets for new therapies in leptospirosis.

A leptospirose é uma zoonose causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. A doença representa um grave problema de saúde pública nos países tropicais subdesenvolvidos. Mais de 500.000 casos graves de leptospirose são notificados a cada ano e a taxa de mortalidade excede 10% (World Health Organization, 1999). Os roedores são o principal reservatório urbano da doença, e eliminam leptospiras viáveis no meio ambiente ao longo de toda a vida. As bactérias entram no hospedeiro por abrasões na pele ou por membranas mucosas e rapidamente se espalham pelo organismo atingindo vários órgãos. A identificação de mecanismos de invasão e de evasão imune apresentados por leptospiras patogênicas é extremamente relevante e tem sido alvo de pesquisas recentes desenvolvidas por vários grupos. Nesse contexto, a caracterização funcional de proteínas de membrana externa de Leptospira, principais alvos de interação com moléculas do hospedeiro, é de grande importância. O Fator de Elongação Tu (EF-Tu), uma proteína bacteriana abundante envolvida na síntese protéica, pertence à categoria das proteínas conhecidas como \"moonlighting\". Tais moléculas possuem a capacidade de exercer mais de uma função e, normalmente, localizam-se em diferentes compartimentos da célula. Há relatos de que EF-Tu de agentes patogênicos possa atuar como um fator de virulência. No presente trabalho, demonstrou-se que EF-Tu de Leptospira está localizado na superfície da bactéria e possui funções adicionais, sendo receptor para moléculas presentes no plasma do hospedeiro. Tal proteína interage com vários componentes da matriz extracellular e também com plasminogênio, de maneira dosedependente. Resíduos de lisina são importantes para essa interação. Plasminogênio ligado a EF-Tu é convertido em sua forma ativa, plasmina, que, por sua vez, é capaz de clivar os substratos naturais C3b e fibrinogênio. EF-Tu de Leptospira também se liga a Fator H, principal regulador da via alternativa do sistema complemento, e este mantém sua atividade funcional ao agir como co-fator de Fator I na clivagem de C3b. O potencial imunoprotetor de EF-Tu em modelo animal foi avaliado, tendo em vista o alto grau de conservação da proteína em diferentes espécies de Leptospira. EF-Tu não conferiu proteção significativa e, portanto, não deve ser considerado como um candidato vacinal contra a leptospirose. Em suma, EF-Tu de Leptospira deve contribuir para o processo de invasão e evasão ao sistema imune inato do hospedeiro, inativando o sistema complemento. Tanto quanto é do nosso conhecimento, essa é a primeira descrição de uma proteína \"moonlighting\" em Leptospira. / Leptospirosis is a zoonosis caused by pathogenic bacteria from the genus Leptospira. The disease represents a serious public health problem in underdeveloped tropical countries. More than 500,000 cases of severe leptospirosis are reported each year, with mortality rates exceeding 10% (World Health Organization, 1999). Rodents are the main urban reservoir of the disease, shedding viable leptospires throughout their lives in the environment. Leptospires infect hosts through small abrasions in the skin or mucous membranes and they rapidly disseminate to target organs. The identification of invasion mechanisms and immune evasion strategies employed by pathogenic leptospires is of great relevance. In this context, functional characterization of leptospiral outer membrane proteins, which represent the main targets for interaction with host molecules, is extremely important. The elongation factor Tu (EF-Tu), an abundant bacterial protein involved in protein synthesis, has been shown to display moonlighting activities. Known to perform more than one function at different times or in different places, it is found in several subcellular locations in a single organism, and may serve as a virulence factor in a range of important human pathogens. In this work we demonstrate that Leptospira EF-Tu is surface-exposed and performs additional roles as a cell-surface receptor for host plasma proteins. It interacts with several extracellular matrix components and also binds plasminogen in a dose-dependent manner. Lysine residues are critical for this interaction. Bound plasminogen is converted to active plasmin, which, in turn, is able to cleave the natural substrates C3b and fibrinogen. Leptospira EF-Tu also acquires Factor H (FH), the main soluble regulator of the alternative pathway of the complement system. FH bound to immobilized EF-Tu displays cofactor activity, mediating C3b degradation by Factor I (FI). Given the wide distribution of EF-Tu among Leptospira species, its immunoprotective potential was evaluated in an animal model. EF-Tu was not able to afford significant immunoprotection, and might not be considered a vaccine candidate against leptospirosis. In conclusion, EF-Tu may contribute to leptospiral tissue invasion and complement inactivation. To our knowledge, this is the first description of a leptospiral protein exhibiting moonlighting activities.