En la siguiente tesis se presentan tres estudios centrados en diferentes aspectos estructurales y funcionales de los dominios efectores presentes en los reguladores epigenéticos y sus consecuencias para la interpretación biológica de las modificaciones de las histonas: (i) Propiedades estructurales y patrón de distribución de los dominios de interacción con la cromatina; (ii) La modulación funcional mediante variaciones locales en el centro activo y en la transición desorden-orden experimentada por la cola de las histonas tras su unión a los dominios efectores; y (iii) Los patrones de splicing alternativo de los reguladores epigenéticos y su posible impacto funcional De la caracterización funcional y estructural de los dominios de interacción presentes en las enzimas modificadoras/remodelantes de la cromatina, podemos extraer que existen diferentes factores que afectan la especificidad de dichos dominios hacia una determinada modificación de la histona. Como por ejemplo, la distribución desigual de los dominios de interacción entre las diferentes familias de reguladores epigenéticos, las variabilidades estructural y química globales, y la transición desorden-orden experimentada por la cola de la histona en su unión a los dominios de interacción. Además, la caracterización estructural de los dominios de interacción sugiere diferentes clases en función de características estructurales comunes: flat-groove, narrow-groove y cavity-insertion. En relación a la variabilidad funcional introducida por los eventos de splicing alternativo en las diferentes familias de reguladores epigenéticos estudiadas, podemos extraer que los eventos de splicing tienen una ocurrencia considerable y los cambios introducidos pueden ordenarse en tres categorías: (a) reducciones drásticas de tamaño, (b) cambios en los dominios catalíticos y (c) cambios en los dominios de interacción; a cada una de ellas le corresponde una interpretación funcional que sugiere un efecto regulador importante por parte del splicing alternativo. / This thesis consists of three studies focused in different structural and functional aspects about the effector modules of the epigenetic regulators and its consequences for the biologic interpretation of histone modifications. (i) Structural properties and distribution pattern of the interaction domains among chromatin-modifying enzymes; (ii) Functional modulation through local variation of the binding site and in the transition disorder-order of the histone tail upon binding with effector modules; and (iii) The alternative splicing patterns of the epigenetic regulators and its functional impact. According the functional and structural characterization of the interaction domains of chromatin-modifying/remodeling enzymes, we identified some substrate specificity determinants towards different histone modifications. For instance, unequal distribution of the interaction domains among different families of epigenetic regulators, global structural and chemical variability of the effector modules, and the disorder-order transition of the histone tails. Additionally, structural characterization of the effector modules that recognize histone modifications suggests a classification according common structural features: flat-groove, narrow-groove y cavity-insertion. According the functional variability introduced by alternative splicing, we observe that splicing events have a high ocurrence in the epigenetic regulators and the changes introduced can be classified according to the functional role of the domain: (a) drastic sequence changes, (b) changes in the catalytic domains and (c) changes in the interaction domains. Our results show that alternative splicing is likely to have a substantial impact on the epigenetic regulation of large sets of genes, by regulating the function of chromatin-modifying enzymes.

El retard de creixement pot ser secundari en un percentatge indeterminat de pacients a un problema genètic. En aquest treball s'analitza el gen de l'hormona de creixement (GH1) i s'estudien els canvis en la seqüència que produeixin un ARN missatger anòmal o una proteïna que no sigui funcional. S'ha estudiat el mapa polimòrfic del gen GH1 en una població control (n=307), per definir el mapa de SNPs. Alhora s'ha buscat un model en el qual poder estudiar l'expressió d'aquest gen. S'ha aïllat l'ARN de leucòcits de sang perifèrica tant de pacients com de controls, i s'ha amplificat el missatger de GH1. També s'ha posat a punt un model cel·lular en el qual poder estudiar la bioactivitat de les proteïnes recombinants portadores dels canvis detectats en pacients (Phe25Tyr i Val173Leu).Les conclusions del treball han estat les següents:1. Els nostres resultats han confirmat i ampliat la descripció de la variabilitat estructural del gen GH1. Han permès descriure el mapa complet per primera vegada, en una població adulta amb talla normal, compresa entre -2 i +2 SDS (n=307).2. En les poblacions amb retard crònic de creixement (n=728) s'han detectat en un 11% de pacients canvis en la seqüència del gen GH1 diferents dels SNPs del mapa control. Entre els canvis, l'11,3% correspon a canvis puntuals d'un aminoàcid (1% del total de pacients índex).3. L'expressió de GH1 en leucòcits de controls no és constitutiva ni constant en quant a les variants de splicing observades. Aquesta metodologia no permet detectar de forma fiable mutacions en pacients. En canvi, ens ha permès confirmar l'expressió de mutants com en el cas d'una substitució predictora de canvi d'aminoàcid, així com descartar o confirmar anomalies de splicing en al·lels portadors de canvis intrònics.4. La utilització d'eines informàtiques ha permès realitzar una aproximació teòrica a l'efecte que dos canvis d'aminoàcid (Phe25Tyr i Val173Leu) a la proteïna GH tenen sobre la seva estructura i interacció amb GHR. L'anàlisi d'homologia de les proteïnes mutants amb les dels altres gens del clúster de la GH ha permès concloure que la substitució Phe25Tyr es pot haver generat per recombinació gènica amb el gen GH2, mentre que no és el cas per a la proteïna amb el canvi Val173Leu.5. Les proteïnes recombinants obtingudes al laboratori (WT i mutants) han estat aptes per al seu estudi in vitro (inmunoreactivitat, proliferació cel·lular i bioactivitat).6. Les GHs mutants Phe25Tyr i Val173Leu presenten una inmunoactivitat i una bioactivitat disminuïdes. Els models cel·lulars de les línies HepG2 i C-28/I 2 no han permès obtenir resultats, mentre que el model de cultiu primari de condròcits fetals humans ha permès detectar que les dues GHs mutants estimulen amb menor intensitat la transcripció de IGF1 mentre que provoquen un augment en l'expressió de GHR i IGF1R.7. El canvi d'aminoàcid Phe25Tyr incorporat en un al·lel de GH1 portat en heterozigosi per dues famílies no relacionades es manifesta com a retard de creixement durant la infantesa que s'acompanya de resposta deficitària de secreció de GH i disminució de IGF1. La resposta al tractament amb GH és adequada i permet recomanar el tractament fins al final del creixement. El canvi Val173Leu detectat en una pacient amb talla baixa i RIUC, sense dèficit aparent de GH, permet suggerir que la detecció precoç de mutacions al gen GH1 quan la secreció aparenta ser normal, permetria un tractament més precoç que hagués millorat el seu pronòstic de talla final. L'anàlisi dels haplotips complets de GH1 permet interpretar l'efecte de la combinació de mutacions a la proteïna amb els genotips per als SNPs. / TITLE OF THE THESIS: "MOLECULAR CARACTERITZATION OF GH1 GENE IN CONTROL AND PATHOLOGIC POPULATIONS, EXPRESSION PATTERNS IN PERIPHERAL BLOOD LEUCOCYTES AND FUNCTIONAL STUDY OF MUTANT PROTEINS DETECTED IN PATIENTS"SUMMARY: The growth delay can be a secondary factor in front of a genetic problem in an indeterminate percentage of patients. In this work, it is analyzed the gene of growth hormone (GH1) and it is studied the changes in the sequence that produce an anomalous messenger ARN or a protein that is not functional. The polymorphic map of gene GH1 has been studied in a control population (n=307), to define the map of SNPs. At the same time, a model has been looked for, in which it could be possible to study the expression of this gene. The ARN of leucocytes of peripheral blood of patients and controls has been isolated, and the GH1 messenger has been amplified. Moreover, we have worked in a cellular model that allows us to study the bioactivity of recombinant proteins carrying the changes detected in patients (Phe25Tyr and Val173Leu). The conclusions of the work have been the following ones: 1. Our results have confirmed and extended the description of the structural variability of gene GH1. They have allowed us to describe the complete map for the first time, in an adult population with normal stature, between -2 and +2 SDS (n=307). 2. In the populations with chronic growth delay (n=728) in an 11% of the patients, changes have been detected in the sequence of gene GH1 different from the SNPs of the map control. Within these changes, 11.3% correspond to precise changes in an amino acid (1% of the total of index patients). 3. The expression of GH1 in leukocytes of controls is neither constitutive nor constant as far as the observed variants of splicing. This methodology does not allow detecting without doubt the mutations in patients. However, it has allowed us to confirm the expression of mutants as in the case of a predicting substitution of change in amino acid, as well as discarding or confirming anomalies of splicing in carrying alleles of intronic changes. 4. The use of computer tools has allowed us to make a theoretical approach to the effect that two changes in amino acid (Phe25Tyr and Val173Leu) in protein GH have on their structure and interaction with GHR. The homology analysis of mutant proteins with those of the other genes of the cluster of the GH has allowed us to conclude that the Phe25Tyr substitution can have been generated by genic recombination with gene GH2, whereas it is not the case for the protein with the Val173Leu change. 5. The recombinant proteins obtained in the laboratory (WT and mutants) have been suitable for their study in vitro (inmunoreactivity, cellular proliferation and bioactivity). 6. The mutant GHs Phe25Tyr and Val173Leu show a diminished inmunoactivity and bioactivity. The cellular models of lines HepG2 and C-28/I2 have not allowed us to obtain results; in contrast, the model of primary culture of human foetal chondrocytes has allowed us to detect that the two mutant GHs stimulate with smaller intensity the IGF1 transcription and they cause an increase in the expression of GHR and IGF1R. 7. The change of Phe25Tyr amino acid incorporated in one allele of GH1 taken to heterozygosity by two non-related families is shown as growth delay during childhood accompanied by deficiency secretion answer of GH and diminution of IGF1. The response to the treatment with GH is suitable and allows us to recommend the treatment until the end of the growth. The Val173Leu change detected in a patient with short stature and RIUC, without apparent GH deficiency, allows us to suggest that precocious detection of mutations in gene GH1 when the secretion pretends to be normal, would allow a precocious treatment that would have improved its prognosis of final stature. The analysis of the complete haplotypes of GH1 allows us to interpret the effect of the combination of mutations in the protein with the genotypes for the SNPs.

El sistema de fosforilació oxidativa mitocondrial (OXPHOS) genera la major part de l'energia que requereixen les cèl·lules eucariotes. Però també és la font principal de producció d'espècies reactives d'oxigen (ROS).Les malalties mitocondrials degudes a mutacions en el DNA mitocondrial (mtDNA) afecten a polipèptids estructurals del sistema OXPHOS, caracteritzant-se per dèficits en la producció d'energia. Però altres factors deuen estar implicats amb l'àmplia manifestació fenotípica amb la que es manifesten aquestes patologies. L'objectiu del treball era determinar si les mutacions en el mtDNA indueixen la generació de ROS. Es diagnosticaren sis pacients portadors de les mutacions en el mtDNA A3243G, A8344G, G6930A, G5703A, G12334A i T14484C. A partir dels pacients portadors de la mutació en sang, es generaren línies de cíbrids transmitocondrials, on s'analitzà el sistema antioxidant com a indicador de la producció de ROS i de la capacitat detoxificadora cel·lular.Estudiàrem les activitats superòxid dismutasa, les activitats glutatió peroxidasa, i l'activitat catalasa en les línies portadores de les mutacions A3243G en el tRNALeu(UUR) (MELAS), la A8344G en el tRNALys (MERRF), i la G6930A en la subunitat I de la COX. Ambdues línies portadores de mutacions en tRNAs, MELAS i MERRF, presentaren totes les activitats antioxidants activades, suggerint que aquestes mutacions indueixen la producció de ROS. Aquest augment d'activitat es devia a un increment en els nivells protèics en els enzims superòxid dismutasa, però no en la catalasa. En canvi, en la línia portadora de la mutació G6930A (COX-I) no observàrem augment significatiu de cap de les activitats dels enzims antioxidants estudiats, resultats que suggeriren que dita mutació no indueix generació d'espècies reactives d'oxigen.Els resultats obtinguts suggereixen que les mutacions del mtDNA que afecten als complexos productors de ROS a la mitocòndria, els complexos I i III, indueixen la generació de ROS (com és en el cas de les cèl·lules MELAS i MERRF). L'estrés oxidatiu deu ser més important en algunes mutacions que en altres, i probable moduli el fenotip d'algunes mutacions en el mtDNA.

La expresión de HER1 y HER2 (dos miembros de la familia de receptores con actividad quinasa de tirosinas HER) está alterada en diversos tumores de origen epitelial, entre ellos el cáncer de mama donde se correlacionan con un peor pronóstico. Consecuentemente, HER1 y HER2 están siendo exhaustivamente estudiados, tanto desde el punto de vista de la biología del cáncer como desde el punto de vista terapéutico. De hecho, se han desarrollado distintos fármacos dirigidos contra estos receptores, como por ejemplo Iressa, un compuesto sintético de bajo peso molecular que inhibe específicamente la quinasa de tirosinas de HER1. Otro ejemplo es Herceptin, un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra el ectodominio de HER2.En la primera parte de esta Tesis hemos explorado el espectro de actividad y el potencial terapéutico de Iressa. Para ello hemos investigado los efectos del Iressa sobre un panel de líneas celulares humanas de cáncer de mama, seleccionadas en base a sus niveles de expresión de HER1 y HER2. Como era predecible, nuestros hallazgos mostraron que Iressa inhibe el crecimiento de células con niveles elevados de expresión de HER1. Sin embargo, sorprendentemente, observamos que Iressa también inhibe el crecimiento de células, como las BT-474, que tienen bajos niveles de HER1 pero que sobreexpresan HER2. Además en esta línea celular, Iressa inhibe la activación de las vías de transducción de señal activadas por el EGF (un ligando que se une al EGFR) o la heregulina (un ligando que se une a HER3 y HER4 pero no a HER1 y HER2). Nuestros datos demuestran que Iressa bloquea esta activación mediante un mecanismo doble. Por un lado, Iressa inhibe directamente la quinasa de tirosinas de HER1; por otro, impide la formación de heterodímeros HER2/HER3 mediante el secuestro de los receptores HER2 y HER3 en heterodímeros inactivos HER1/HER2 y HER1/HER3. Conjuntamente, estos hallazgos desvelan un nuevo mecanismo de acción de los inhibidores de la quinasa de HER1 y sugieren que Iressa podría tener utilidad terapéutica para el cáncer de mama no solo en pacientes que presentan niveles elevados de HER1 sino también en pacientes cuyos tumores sobreexpresen HER2.En la segunda parte de esta Tesis hemos profundizado en la biología de los CTFs (Carboxy-Terminal Fragments, Fragmentos Caborxilo-Terminales). Los CTFs son una forma truncada de HER2 que se detecta en el 25% de las muestras de pacientes con cáncer de mama. De acuerdo a su movilidad electroforética, los CTFs contienen el dominio citoplasmático de HER2 incluyendo su dominio tirosina quinasa. Recientemente se ha demostrado que los CTFs correlacionan con metástasis en los ganglios linfáticos y peor pronóstico. A pesar de esto, el mecanismo de generación de estos CTFs y su posible papel en cáncer se desconocía.En este trabajo demostramos que los CTFs se generan mediante inicio alternativo de la traducción a partir de las metioninas 611 y 687 de HER2. Dichas metioninas están situadas justo delante y detrás del dominio transmembrana, respectivamente. Los CTFs están fosforilados y tienen actividad quinasa in vitro. Se localizan en el citoplasma y núcleo de las células que los expresan, tanto en cultivos celulares como en muestras de pacientes con cáncer de mama. Finalmente, mostramos que la inyección subcutánea de células que sobreexpresan los CTFs en ratones atímicos da lugar a tumores que son resistentes al tratamiento con Herceptin, pero que responden a inhibidores de la quinasa de tirosinas de HER2.Dado que un 60% de los pacientes con cáncer de mama que sobreexpresan HER2 (candidatos al tratamiento con Herceptin) sobreexpresan también los CTFs, nuestros resultados sugieren que la sobreexpresión de los CTFs en estos pacientes pueda tener un papel en la resistencia que se desarrolla al tratamiento con Herceptin. / The HER1 and HER2 are frequently overexpressed in breast cancer, and their overexpression is associated with a more aggressive clinical behavior. As a consequence, different compounds targeting these receptors have been developed as a fruitful approach to the therapy of breast cancer. One example is Iressa, an oral nonpeptide compound that selectively inhibits the TK activity of HER1; or Herceptin, a monoclonal antibody that targets HER2. To characterize the potential role of Iressa in the treatment of breast cancer, we have studied its effects in a variety of breast carcinoma cell lines expressing different levels of HER1 and HER2 receptors. Our studies demonstrate that Iressa, despite being a specific inhibitor of the EGFR TK, is a potent inhibitor of HER2-over expressing breast cancer cells. We have demonstrated that these effects are explained by a novel and double mechanisms of action. Iressa inhibits the quinase activity of HER1 in one hand and promotes the formation of inactive (unphosphorylated) HER1/HER2 and HER2/ HER3 heterodimers on the other. In the second part of this work we have characterized the CTFs (Carboxi-terminal fragments) of HER2, a truncated form of the HER2 receptor encoding its cytoplasmic domain. CTFs are frequently found in human mammary tumors and associate with nodal metastasis and poor prognosis. However the mechanism of generation is not understood. Here we show that HER2 CTFs are generated by alternative initiation of translation from methionines located near the transmembrana domain of the full-length molecule. In vitro and in vivo, HER2 CTFs are found in the cytoplasm and nucleus. Expression of HER2 CTFs induces the growth of breast cancer xenografts in nude mice. Tumors dependent on CTFs are sensitive to inhibitors of the kinase activity but do not respond to Herceptin. Thus, the kinase domain seems necessary for the activity of HER2 CTFs and the presence of the CTFs could account for the resistance to treatment with Herceptin.

ANTECEDENTS:L'ApoA-II és la segona proteïna més abundant en l'HDL. La proteïna transferidora d' èsters de colesterol (CETP) actúa intercanviant èsters de colesterol per triglicèrids entre les partícules d'HDL i les lipoproteïnes que contenen apoB. El transportador ABCA1 és una proteïna reguladora del flux de colesterol. El transportador ABCG5-G8 és una proteïna reguladora de l'excreció biliar. Totes aquestes son proteïnes que intervenen en la estructura i metabolisme de l'HDL, però es desconeix el seu paper en el transport revers de colesterol específic de macròfags (TRC). HIPÒTESI DEL TREBALL:Estudis clínics i epidemiològics han demostrat l'existència d'una relació inversa entre la concentració en plasma de colesterol HDL i el risc de patir malalties cardiovasculars aterotrombòtiques. Aquest efectes cardioprotectors son atribuïts al paper de l'HDL en el TRC, i especialment el transport revers de colesterol específic de macròfags. L'expressió i/o inactivació selectiva de gens en ratolins ha permès d'obtenir una valuosa informació sobre el paper fisiològic d'aquestes proteïnes involucrades en aquest mecanisme potencial de prevenció de l'aterogènesi per part de les HDL. Així la modificació d'aquestes proteïnes en ratolins modificats genèticament ens permetrà estudiar com afecta el TRC i explicar així el paper aterogènic d'aquests ratolins.CONCLUSIONS:Del primer article vam concloure que malgrat la deficiència d'HDL que presentaven els ratolins transgènics d'apoA-II humana, el TRC des de macròfags a femtes in vivo funcionava de forma efectiva. Els nostres resultats també suggereixen que l'augment de les lesions arterioscleròtiques trobades en els ratolins transgènics d'apoA-II alimentats amb dieta rica en greixos no són degudes al bloqueig del TRC específic de macròfags. Resultats previs suggereixen que l'apoA-II podria exercir el seu efecte proaterogènic reduint les propietats antioxidants de l'HDL.Del segon article vam concloure que la deficiència del transportador ABCA-1 en ratolins knockout reduïa el TRC específic de macròfags in vivo. Aquest resultats demostren la importància d'ABCA-1 en aquesta funció antiaterogènica de les HDL i, demostren la possible relació entre la disminució del TRC depenent de macròfags i l'augment de la susceptibilitat a l'arteriosclerosi.Del tercer article vam concloure que l'expressió de CETP de macaco o humana en ratolins transgènics no afectava al TRC específic de macròfags in vivo ni les propietats antioxidants de l'HDL. L'efecte proaterogènic de l'expressió de CETP en ratolins sembla doncs degut a mecanismes independents d'aquestes dues funcions antiaterogèniques de les HDL.I finalment, en l'últim article vam concloure que la deficiència del transportador ABCG5/G8 en ratolins knockout no alterava el TRC des de macròfags a femtes in vivo. Tanmateix, l'expressió ABCG5/G8 és necessària per a la inducció del TRC específic de macròfags induït pels agonistes de LXR. Els nostres resultats donen suport a la hipòtesi que aquests transportadors tenen un paper determinant en la fase final d'aquesta via i els confirmen com a dianes moleculars de gran interès per a prevenir o tractar l'arteriosclerosi. / Epidemiological studies have demonstrated that increased HDL is a protective factor against atherosclerotic cardiovascular disease. The evaluation of antiatherogenic functions of HDL is an important area of research which includes the role of HDL in reverse cholesterol transport (RCT), especially macrophage-specific RCT, and its antioxidant and antiinflammatory roles.The development of transgenic and knockout mice provides us a lot of information about the role of some proteins that are important in these potencial antiatherogenic mechanisms.We studied four proteins that are important in the HDL metabolism: apoA-II is the second major HDL protein. The action of CETP results in a heteroexchange between HDL cholesteryl ester and VLDL- or chymolicron -triglycerides. The ABCA-1 transporter is a protein that regulates the cholesterol efflux. The ABCG5/G8 transporter is a crucial protein for hepatobiliary and intestinal sterol excretion. Thus, the modification of these proteins in genetical modified mice and the development of a new strategy to mesure the macrophage-specific RCT in vivo permit us to know the atherogenic role of these mice. We concluded that human apoA-II maintains effective RCT from macrophages to feces in vivo despite an HDL deficiency. These findings suggest that the increased atherosclerotic lesions observed in apoA-II transgenic mice fed an atherogenic diet are not due to impairment in macrophage-specific RCT. The results of the study with ABCA-1 knockout mice provide definitive in vivo evidence of the crucial role of ABCA1 in macrophage-specific RCT. This fact may also indicate, together with previous works, that ABCA1 exerts, at least in part, its antiatherogenic effect by promoting macrophage-specific RCT. The CETP overexpression in transgenic mice does not affect RCT from macrophages to feces in vivo or the protection conferred by HDL against LDL oxidative modification. Finally, the results of the study with ABCG5/G8 demonstrate that the presence of ABCG5/G8 transporters is required for LXR-mediated induction of macrophage-specific RCT, and support the hypothesis that these transporters play a key role in the final step of this pathway. These data also suggest that upregulation of ABCG5/G8 may be an effective strategy to increase macrophage-specific RCT and reduce atherosclerosis.

This thesis is based on a genomic study of the epithelial fusion and wound healing processes using Drosophila melanogaster as a model system. The aimed of the work is to study the genomic differences between cells actively involved in wound healing and neighboring cells not actively involved in wound healing. To achieve this objective we standardized a new system to culture imaginal discs in vitro. This new system that is healing permissive recapitulate the entire wound healing processes. Using the line pucE69-A-Gal4/UAS-GFP, which express puc-GFP in the leading edge cells of the wound, a large amount of cells actively involved in healing (puc-GFP positives) and their neighboring cells (puc-GFP negatives) were sorted. RNA from the different cells populations were extracted and hybridized to affymetrix chips. The obtained data were further analyzed using different statistical analyses. Finally, 302 genes appeared upregulated and 209 genes were downregulated with a fold chage higher and lower of 2 and -2 respectively. However, during the normal development of imaginal discs, puc-GFP is not only express in cells involved in healing, it is also present in cells of the stalk and the peripodial sheet of the disc. This cells that also express puc-GFP are not involved in the wound healing process and could lead to contamination. To solve this problem a second analysis including wounded and not wounded discs were performed. Dual statistical analyses allow us to identify three different subpopulation: dw1_dnw1_dd1 subpopulation, in which genes appear modified not only in wounded discs but also in unwounded discs, but differentially; dw1_dnw0_dd1 subpopulation, in which genes appear modified only in wounded dicsc; dw0_dnw1_dd1 subpopulation, in which genes appear modified only in unwounded discs. Gene ontology (GO) analyses were done for those genes that were modified during wound healing showing overrepresented categories during wound healing (for example genes related to actin regulation, immune response, cells movements, of transduction factors). To investigate the potential role of selected genes in wound healing, we aimed to employ an in vivo healing model using the Gal4-UAS system. Different Gal4 drivers were used to interfere with the expression of those genes upregulated in “healing” cells (UAS-RNAi lines) and to reload back by overexpression those genes downregulated (UAS lines). To test all these lines in the wound healing model is an enormous task that would take long time, for that reason we decided to perform a previous analysis of their functionality in a heterologous morphogenetic epithelial model (similar to wound healing), the thorax fusion. In brief, 89 UAS-RNAi lines (43 % of those tested) corresponding to 54 genes (44 %) displayed thorax closure phenotypes ranging from weak cleft to embryonic lethality. For the UAS construct, 18 of them (42 %) corresponding to 11 genes (44%) also lead to thorax fusion defects. Once identified a set of genes whose overexpression or interference elicit defects in thorax closure and may have a role in wound healing, a secondary screen employing an imaginal disc healing assay was performed for those lines that produces stronger phenotypes during thorax closure. In summary, downregulation of different genes that appear modified during healing by RNAi overexpression has leaded us to identify new genes necessaries for a proper closure completion. Fundamental processes for wound healing are affected, like actin accumulation in leading edge cells, peripodial epithilia movement, or tissue relaxation. The aimed of this project was not only to generate a comprehensive database of those genes whose expression is altered during wound repair in Drosophila, but also identify genes and highly conserved pathways which are likely to be of crucial importance for wound healing by comparing our data to those obtained in vertebrates healing model systems. We set up a collaborative project with a series of groups performing transcriptional analysis in humans and mice in order to identify those genes conserved through the phylogeny. After a comparative study to identify Drosophila homologues for those genes that appear modified in vertebrates functional analysis were done in vertebrates using a scratch assay and in Drosophila using the Gal4-UAS system. These genes, functionally relevant in healing models across phylogeny constitute potential candidates for deep translational studies. / Esta tesis se basa en el estudio de los procesos morfogenéticos de fusión de epitelios y cicatrización utilizando Drosophila melanogaster como organismo modelo. Ya que esta tesis se basa en un análisis por microarray de las células involucradas activamente en el proceso de cicatrización en comparación con aquellas células vecinas no implicadas activamente en dicho proceso, se estandarizó un nuevo sistema para cultivar discos imaginales in vitro. Gracias a este sistema, que recapitula todos los procesos que ocurren durante la cicatrización, se pudieron aislar una gran cantidad de tanto de células activamente involucradas en la cicatrización (puc-GFP positivas) como de sus vecinas no involucradas (puc-GFP negativas). Una vez obtenidas las distintas poblaciones celulares se realizaron las extracciones de RNA y posteriores hibridaciones en chip de Affymetrix. Los datos obtenidos se analizaron mediante diferentes estudios estadísticos, resaltando 302 genes regulados positivamente y 209 genes regulados negativamente con un fold change por encima o por debajo de 2 y -2 respectivamente. También se realizaron análisis de la ontología génica (GO) de los genes que aparecían modificados, lo que nos permitió ver que categorías génicas aparecían mas representadas (como por ejemplo genes implicados en la regulación de la actina, la respuesta inmune, el movimiento celular o factores de activación de la transducción). Una vez realizados los análisis estadísticos se procedió al análisis funcional de aquellos genes que aparecían modificados. Ya que realizar un cribado en cicatrización era un proceso largo y tedioso se decidió hacer un cribado previo utilizando el modelo de fusión del tórax. Para ello se sobreexpresaron RNA de interferencia mediante un driver que digiere su expresión a la zona dorsal del tórax. Se testaron 206 líneas UAS-RNAi para disminuir la expresión de 123 genes y 21 líneas UAS para sobreexpresar aquellos genes que aparecían regulados negativamente. De estos 89 líneas UAS-RNAi (43 % de los testados) correspondiente a 54 genes (44 %) y 18 líneas UAS (42 %) correspondientes a 11 genes (44%) presentaban problemas de fusión de tórax. Aquellos genes que producían fenotipos mas fuertes estaban relacionados con factores de transcripción, con la regulación de la actina o las adhesiones celulares (esperable ya que ya se ha descrito previamente la importancia de estos factores durante la cicatrización), y de forma preliminar, fueron estudiados durante el proceso de cicatrización, identificando nuevos genes implicados en el mismo.

Tesi realitzada al Centre de Recerca en Agrigenòmica (CRAG) / The general objective of this PhD thesis is to investigate the mechanistic bases for plant hormones Brassinosteroids (BRs) action in plant vascular development. To this end, we have used a multidisciplinary approach by combining mathematical modeling with exhaustive analysis of the BRs mutants vascular phenotypes. Furthermore, high throughput proteomic techniques with accurate confocal microscopy to identify new components of the BR signaling pathway with cellular resolution have been performed. Our work describes for the first time the composition of BRI1 and BRL3 receptor protein complexes in Arabidopsis. These results represent a conceptual advance for the molecular understanding of BR signaling pathway in plant development, as disclose several key points beyond the current state of the art. Despite their cellular specificity and their role as functional BR receptors the study of BRL receptors has been neglected and no reports have been published on them. Several barriers may have hampered the study of BRL pathways in the plant. Despite BRL being functional BR receptors, obstacles in: (i) the visualization of vascular inner tissues, (ii) the biological variability that exists within the shoot stem vasculature where BRL proteins are localised, and (iii) the lack of an apparent phenotype for the brl mutants, altogether might have hampered the study of these receptors. This PhD thesis challenges the study of the functional role of BRL receptors by using multidisciplinary approaches ranging from systems biology to quantitative biochemistry and high-resolution microscopy. The purification and identification of BRL3-receptor protein complex has permitted to assign a specific role for BRL3 receptor in planta, independently from the BRI1 main receptor (also reported in this study). To better understand the function of the BRL receptors in planta and to investigate novel BR specific functions in distinct cell-types, we have carried different approaches: 1. Investigate the contribution of BRs to the vascular development in the shoot of Arabidopsis plants by comprehensive phenotypic analysis of vascular-patterning defects in BR-signaling and synthesis mutants. 2. Biochemical characterization of BRI1 and BRL3 signalosome complexes by MS- analysis. 3. Functional characterization of BRL3 signalosome in plant growth and development by genetic analysis of candidate interactors identified by MS analysis. First, a role for BRs in regulating vascular development in the shoot inflorescence stem of Arabidopsis has been demonstrated. Based on our experimental results, mathematical modeling (in collaboration with Physicists at the group of Dr. Ibañes, UB) was mutually beneficial to jointly establish the role of auxin in plant vascular patterning. Our initial experimental approach accounted for exhaustive analysis of BRs mutants while did not concern auxin hormone action. Through computational and modeling predictions, it was found that BRs alone were not sufficient to create the VB patterning, suggesting the requirement of auxin transport for the VB formation. Thus, our results unveil coordinated roles for auxin and BRs in establishing the vascular patterning within Arabidopsis shoots. Second, experimental evidence for two different BR perception complexes, BRI1 and BRL3 complexes, operating at distinct and specific cell types is provided. Several BRI1 interactors and downstream signaling components have been identified by extensive proteomic studies while no evidence for the composition of the native BRI1 receptor complex has been reported. Additionally, BRL receptors have been described to be active BR receptors that play specific roles in Arabidopsis yet no study on BRL receptor complexes composition nor downstream signaling components has been shown. Here we disclose the composition of both BRI1 and BRL3 receptor complexes providing novel candidate interactors and components to the BR signaling field. Of note, identification of the BRL3 receptor complex composition in combination with high-resolution microscopy and genetic analysis reveals a novel function for BAK1 and BRL1 proteins through interaction with BRL3 in BR-mediated root development. Collectively, these results highlight the power of using multidisciplinary approaches for the study of signaling pathways within specific cellular domains in the plant. / Aquesta tesis doctoral té com a objectiu principal investigar noves funcions de les hormones vegetals esteroides, Brassinoesteroides (BRs), en el desenvolupament del teixit vascular de la planta. Per tal d’assolir aquest objectiu hem utilitzat una aproximació multidisciplinària, combinant models matemàtics i computacionals amb anàlisis exhaustius dels fenotips vasculars de plantes mutants en BRs, en la planta model Arabidopsis thaliana . A més, hem combinat tècniques de proteòmica amb microscopia confocal, amb l’objectiu d’identificar nous components de senyalització de BRs amb una resolució cel•lular. Els nostres resultats indiquen l’inici d’una ruta alternativa a la visió clàssica de la ruta de senyalització dels BRs descrita fins al moment. Tot i que els principals components del senyal ja han estat identificats pel seu homòleg més pròxim, el receptor BRI1, els complexes de BRL1 i BRL3 juntament amb els candidats co-receptors així com els components de la ruta de senyalització encara no s’han descrit. Per tal d’entendre millor la funció d’aquests receptors de BRs i d’investigar funcions de BRs específiques pels diferents tipus cel•lulars, vam plantejar diferents aproximacions: 1. Estudi de la contribució dels Brassinoesteroides en la formació del patró vascular de la tija d’Arabidopsis 2. Identificació de nous components de senyalització del receptor BRL3, involucrats en la regulació del desenvolupament vascular. 3. Caracterització funcional del signalosoma de BRL3 en el creixement i en el desenvolupament de la planta. Aquest estudi demostra que el transport polar de l’auxina i la senyalització de BRs determinen el patró radial dels feixos vasculars de la tija principal de les plantes d’Arabidopsis. Les nostes dades experimentals juntament amb l’elaboració d’un nou model matemàtic ens va permetre entendre com s’elabora el patró radial de la tija d’Arabidopsis, i els resultats es van publicar a la revista PNAS (Ibañes et al., 2009). A més, el nostre estudi demostra la formació de complexes receptors de BRs específics de tipus cel•lular, els quals participen en diferents activitats cel•lulars durant el creixement i desenvolupament de l’arrel. També revela funcions noves i específiques per a la senyalització de BRs a través dels receptor BRL3 en el nínxol de cèl•lules mare de l'arrel d'Arabidopsis.

Osteoporosis is a systemic skeletal disorder and the most common metabolic bone disease. It is recognized as one of the most prevalent problems facing postmenopausal women in western society. The World Health Organization definition of osteoporosis uses bone mineral density (BMD) measurements as the gold standard. The genetic complexity of BMD is incompletely defined. Bone turnover, also called bone remodelling, is a lifelong process that refers to the entire cycle of bone resorption and formation, which determines BMD. In general, the cell biology of an adult bone includes 3 cell types, among others, that have opposite functions: osteoblasts produce the extracellular matrix that becomes mineralized; osteoclasts are responsible for the resorptive actions; and osteocytes are involved in the regulation of both resorption and formation (and are even claimed to dominate the process). A complex signal system between these 3 cell types balances their activities to avoid any over-creation or loss of bone tissue. The bone remodelling equilibrium is in part dominated by a set of protein reactions known as the RANK/RANKL/OPG system. The special importance of the Receptor Activator of NF-kappa-B (RANK) and its interaction with its ligand (RANKL) is that the RANK/RANKL complex is one of the main triggers of osteoclast differentiation and survival. Hence, in-depth analysis of variants in these 2 genes may contribute to the understanding of the genetics of BMD. This study had 4 main objectives: (1) association analysis of putative functional SNPs in evolutionary conserved regions of the RANK and RANKL genes with BMD and the occurrence of fractures in our cohort (BARCOS). (2) Replication of previously associated SNPs, in the BARCOS cohort (3) In-silico study followed by in-vitro functional experiments of the BMD-associated SNP(s) in order to reveal its (their) role(s) in the pathological process of osteoporosis and (4) Characterization of the human RANKL promoter and regulatory regions in-silico and in-vitro. We replicated the association of SNP rs9594738, a genetic variant at 184 kb upstream to RANKL gene, with BMD. Statistical analysis for other SNPs in the RANKL gene failed to be associated with osteoporotic phenotypes. The functional experiments’ results demonstrate that this region surrounding rs9594738, between AKAP11 and RANKL, has the capacity to regulate RANKL, with different effects on its expression in the presence or absence of vitamin D. These results suggest that it may play a role in the RANK/RANKL/OPG equilibrium, and might explain the association between the SNPs in this region and BMD. A transcript of minimum 300 bp (with rs9594738 in a central position) has been detected in this region. The existence of this RNA segment suggests its involvement in alternative functions of the region. We also identified 2 SNPs in the RANK 3’UTR (rs78326403 and rs884205) that are associated with low trauma fractures in our cohort. SNP rs78326403 is associated with wrist/forearm fractures, while SNP rs884205 is associated with spine fractures. In addition, we observed a significant interaction between rs78326403 and the RANKL BMD-associated SNP (rs9594738), highlighting the relevance of both microarchitecture and low BMD as genetically determined predictors of fracture risk that should be assessed using multiple techniques. To conclude, our results highlight the importance of the region between AKAP11 and RANKL on RANKL transcription regulation and suggest that it may play an important role in the RANK/RANKL/OPG equilibrium. Furthermore, the site-dependent associations in the RANK gene might be clinically relevant in the future to better profile a more specific approach to the different types of fractures, both to better understand their underlying mechanisms and to search for site-specific therapeutic strategies. / La osteoporosis es la enfermedad metabólica ósea más frecuente. Está definida como un trastorno esquelético sistémico caracterizado por una disminución de la densidad mineral ósea (DMO) y alteraciones en la microarquitectura del tejido óseo, con un consecuente incremento de la fragilidad ósea y del riesgo de fractura. Su complejidad genética permanece incompletamente definida. La DMO viene marcada por un remodelado óseo basado en ciclos de resorción y formación que suceden a lo largo de toda la vida del organismo. Este proceso, está regulado en parte por un conjunto de reacciones proteicas pertenecientes al sistema conocido como RANK/RANKL/OPG. La especial importancia de RANK, así como la interacción de éste con su ligando RANKL, recae en el hecho que, son factores clave tanto en el desencadenamiento de la diferenciación como de la supervivencia osteoclástica. El estudio se centra en el análisis detallado de variantes pertenecientes a ambos genes, seguido del estudio funcional correspondiente. Se ha replicado la asociación del SNP rs9594738 con la DMO, una variante genética localizada a 184 kb 5' del gen RANKL. Los resultados del estudio funcional muestran que la región que engloba dicha variante actúa como un regulador distal de RANKL, ejerciendo efectos en su expresión que varían en presencia ó ausencia de vitamina D. Además, se identificaron dos SNPs (rs78326403 y rs884205) en el 3’UTR de RANK, asociados con fracturas por bajo traumatismo en nuestra cohorte. Por último, una interacción significativa entre rs78326403 y rs9594738 en la determinación del riesgo de fractura, pone de relieve la importancia de la DMO baja y de la microarquitectura como predictores genéticamente determinados del riesgo de fractura que se deben evaluar con el uso de diversas técnicas.

Tesi realitzada al Centre de Recerca en Agrigenòmica (CRAG) / The present PhD thesis work reports the molecular and genetic dissection for the role of plant steroid hormones Brassinosteroids (BRs) in root growth and development of Arabidopsis thaliana (Arabidopsis). A genetic, physiological and cellular analysis of existing BR mutants, together with the discovery of a novel pathway for the control of BR mediated stem cell divisions. The results presented here provide experimental evidence for a role of BRs in stem cell homeostasis in the primary root of Arabidopsis. Specifically, BRs promote columella stem cell differentiation and the division of a set of low mitotic cells called quiescent center (QC) that maintain the surrounding stem cells. Using a microgenomic approach, a novel BR signaling component, BRAVO (Brassinosteroids at Vascular and Organizing Centre) has been identified that is specifically expressed in the stem cells. BRAVO encodes a R2-R3 MYB transcription factor (MYB56) that acts as a negative regulator of BRmediated QC divisions. This study uncovers a fine example of negative regulation model; BRAVO is directly repressed and interacts with BES1 creating a molecular switch that controls QC divisions. The work carried out during this PhD thesis shed light to a new function of brassinosteroids in the regulation of stem cells. BRAVO provides plasticity to the stem cells to response to DNA damage, and at the same time robustness to ensure QC function upon damage. The control of plant stem cell homeostasis is pivotal to understand plant adaptation to environmental changing conditions and provides a new mechanism to understand plants life span. / Aquesta tesi doctoral té com a objectiu principal investigar els efectes de les hormones vegetals esteroides, Brassinosteroids (BRs), durant el desenvolupament de lʼarrel primària dʼArabidopsis thaliana (Arabidopsis). Per tal dʼassolir aquest objectiu hem realitzat una caracterització genètica, fisiològica i anàlisi cel•lular de mutants de BRs. Així mateix, sʼha descobert una nova ruta de senyalització que controla les divisions de les cèl•lules mare mediades per BRs, Els nostres resultats experimentals mostren com els BRs controlen la homeòstasi de les cèl•lules mare de lʼarrel. En concret, els BRs promouen la diferenciació de les cèl•lules mare de la columel•la i la divisió dʼun grup de cèl•lules mitòticament inactives que actuen en el manteniment de les cèl•lules mare, el centre quiescent (QC). Mitjançant un abordatge microgenòmic hem identificat un nou element de la ruta de senyalització dels BRs específic de les cèl•lules mare, BRAVO (Brassinosteroids at Vascular and Organizing Centre). BRAVO és un factor de transcripció R2R3 de la família MYB (MYB56), que actua com a regulador negatiu de les divisions de QC. Els nostres resultats mostren un model de regulació negativa, on BES1 reprimeix directament i interacciona amb BRAVO, creant un interruptor molecular que controla les divisions del QC. El treball realitzat durant aquesta tesis doctoral permet proposar una nova funció dels BRs en el control de les cèl•lules mare. BRAVO dóna plasticitat a les cèl•lules mare per a poder respondre al dany sobre lADN, així com robustesa per evitar-lo. El control de la homeòstasi de les cèl•lules mare en plantes és vital per entendre lʼadaptació dʼaquests organismes sèssils i la longevitat que presenten algunes espècies.

Discovering the master genes necessary to build the eye in an invertebrate model such as S. mediterranea could help us to understand numerous retinopathies and age-related degeneration of the human eye. The aim of this study was to select and determine the functional activity of genes involved in the regeneration and development of the S. mediterranea eye. Gene ontology was the tool used to select the genes; while RNA interference and RNA hybridization provided the first approach towards establishing possible roles in the eye development process. From 45 genes studied, silencing of five opsins, Smed-rhodopsin1, Smed-rhodopsin2, Smed-rhodopsin10, Smed-melanopsin2 and Smed-melanopsin3; four transcription factors, Smed-exd (-pbx), Smed-hox2, Smed-mitf2 and Smed-mitf3; and two ABC transporters, Smed-white and Smed-mrp1-2, specifically inhibited normal eye regeneration in S. mediterranea. This suggested they are relevant for or involved in phototransduction, eye pigment biosynthesis, photoreceptor microtubule transport or eye developmental processes. Smed-melanopsin2 and Smed-melanopsin3 RNAi affected the regeneration of pigment cells and skin pigmentation. Smed-melanopsin3 RNAi produced misrouted photoreceptor axonal fibres and fused pigment cups. 13 out of the 14 opsin or light sensor genes studied had ubiquitous mRNA expression throughout the body, which might be explained by the presence of a dermal light sense, as observed in other flatworms. These proteins might serve as photoentrainment regulators or as photolyases responsible for the repair of photodamaged DNA. Smed-hox1 RNAi inhibited the proper development of anterior structures. Smed-VATP synthase, Smed-kinase, Smed-dye and Smed-centrin transiently inhibited eye regeneration before the inhibition of whole body regeneration. This was followed by death, which might indicate the existence of a photoreceptor ATP synthesis and microvilli transport specificity; or also the importance of these genes in cell survival. Smed-peropsin1, Smed-yy1, Smed-hmt, Smed-tpr1, Smed-tpr2, Smed-kinase, Smed-mrp1-2 and Smed-hox1 have eye expression patterns. Additionally, Smed-hox1 and Smed-mrp1-2 also present inhibition of anterior structures. Smed-white RNAi produced hypopigmented, fused eye cups and photoreceptor cell size reduction. This was probably induced via the damaged pigment cells, due to the dependence between these two cell types. Smed-melanopsin1, Smed-ver and Smed-hox2 have brain lobes-like expression patterns. These RNA sequences might be signalling neuronal cells. Smed-tpr1 mRNA injection induced rapid pharynx autotomy, also provoked by Smed-ver and Smed-white-sf2. All three are melanin biosynthesis-related genes. This ejection suggests the existence of an additional natural mechanism of tissue release, probably provoked for the action of a small amino acid. For the first time, the rabdomeres of the Schmidtea mediterranea eye have been photographed using electron microscopy. These structures are very similar to their homologues in other flatworms. / El objetivo de este estudio ha sido encontrar genes implicados en la regeneración y por consiguiente en el desarrollo de los ojos de S. mediterranea. Para ello se han usado herramientas informáticas de selección de genes homólogos de otras especies, la interferencia con RNA mensajero y la hibridación in situ de mRNA. De los 45 genes estudiados, el RNAi de cinco opsinas Smed-rhodopsin1, Smed-rhodopsin2, Smed-rhodopsin10, Smed-melanopsin2 y Smed-melanopsin3; cuatro factores de transcripción Smed-exd (-pbx), Smed-hox2, Smed-mitf2 y Smed-mitf3; junto con dos transportadores ABC Smed-white y Smed-mrp1-2, inhiben la regeneración normal de los ojos de S. mediterranea. Aunque ninguno de estos genes se expresa en los ojos, la expresión ubicua del mRNA de las opsinas por todo el cuerpo de la planaria podría indicar la presencia de un sentido fotodermal previamente observado en otras planarias. Los mRNA de los genes Smed-peropsin1, Smed-yy1, Smed-hmt, Smed-tpr1, Smed-tpr2, Smed-kinase, Smed-hox1 y Smed-mrp1-2 se expresan en los ojos. La interferencia con RNA de los tres últimos provoca inhibición de las estructuras anteriores. Los genes Smed-kinase, Smed-VATP synthase, Smed-dye y Smed-centrin inhiben la regeneración de los ojos antes de provocar una destrucción celular masiva que desemboca en la muerte del animal. El RNAi de los genes Smed-white, Smed-melanopsin2 y Smed-melanopsin3 afecta a la pigmentación de la piel y en Smed-melanopsin3, además, a las rutas que los axones de los fotoreceptores siguen hasta llegar a los ganglios cerebrales. En los RNAi de Smed-white las células pigmentarias no desaparecen pero cambian de posición, se fusionan en el centro de la cabeza. Smed-melanopsin1, Smed-ver y Smed-hox2 tienen patrones de expresión parecidos a los ganglios cerebrales. RNAi de tres genes implicados con la biosíntesis de pigmentos, Smed-tpr1, Smed-ver y Smed-white-sf2, inducen la autotomía de la faringe. Efecto que sugiere la existencia de un mecanismo natural de expulsión de este órgano. Por primera vez los rabdómeros del ojo de Schmidtea mediterranea han sido fotografiados con microscopía electrónica, siendo éstos similares a los de otras planarias.