Las invasiones biológicas son un tema de especial importancia para los biólogos marinos. Estas invasiones pueden causar daños tanto ecológicos como económicos. El Mar Mediterráneo es uno de los ecosistemas marinos con más biodiversidad de todo el globo. No obstante, es uno de los mares más castigados y contaminados por la gran actividad humana costera y por la explotación de sus recursos. En consecuencia, es una región altamente vulnerable para la introducción de especies de diferentes orígenes. Siguiendo la introducción a una nueva área (dispersión pre-frontera), los procesos post-frontera determinan el éxito en el establecimiento de las especies no indígenas. Sin embargo, se conoce poco sobre cómo estos procesos post-frontera dan forma a la composición genética de las especies no indígenas a escalas regionales. Además, las introducciones recurrentes de especies no indígenas generan interacciones nuevas entre especies residentes que varían con las condiciones locales y la composición de la comunidad receptora. Por otro lado, el estudio de especies invasoras es a menudo confundido por cuestiones taxonómicas y por lo tanto estas especies pueden no ser reconocidas como introducidas en nuevas áreas colonizadas. De entre los organismos marinos invasores, las ascidias se han convertido en un problema global. Puertos, marinas, instalaciones de acuacultura y otras estructuras artificiales suelen ser los hábitats donde son introducidas y proliferan. Concretamente, las ascidias no indígenas son una especial preocupación para la industria de acuacultura y, paradójicamente, el stock de bivalvos representa una importante vía para transportar estas ascidias por todo el mundo. El objetivo principal de esta tesis doctoral es estudiar ciertos aspectos ecológicos y genéticos de la biología de cuatro ascidias invasoras en el Mediterráneo occidental. En el primer capítulo profundizamos en los procesos post-frontera de Microcosmus squamiger estudiando su estructura genética poblacional. Esta ascidia presenta una capacidad relativamente alta de dispersión post-frontera que le permite un flujo genético entre diferentes poblaciones a pequeña escala, además, presenta dos grupos genéticos relacionados con las dos fuentes originarias (Australia) de las poblaciones introducidas mundialmente. Estos acervos genéticos están mezclados a nivel poblacional pero no a nivel de individuo. En el segundo capítulo evaluamos los interacciones biológicas en los primeros estadios del desarrollo de Microcosmus squamiger y Styela plicata entre ellas y con mejillones, otros dominantes en las comunidades bentónicas. Parece que las dos ascidias no presentan interacciones a nivel espermático y tampoco a nivel de asentamiento larvario. En cambio, los mejillones juveniles presentan altos niveles de depredación de las larvas de estas dos ascidias, además de influenciar en su comportamiento larvario. Esto nos demuestra la importancia de la comunidad residente para el establecimiento de especies introducidas. En el tercer capítulo estudiamos el ciclo de vida y la estructura genética poblacional del invasor Didemnum. vexillum. Esta ascidia presenta un ciclo de crecimiento y reproductor claramente estacional, afectado negativamente por las temperaturas cálidas del verano. Además, las poblaciones introducidas en el Mediterráneo muestran una diversidad baja, sugiriendo un proceso de cuello de botella en el proceso de introducción. Finalmente, en el cuarto capítulo estudiamos el ciclo de vida de Clavelina oblonga. Veremos que esta ascidia es una especie introducida en el Mediterráneo desde hace más de 80 años pero que fue erróneamente identificada como C. phlegraea, nativa de la región. Su ciclo reproductor y de crecimiento es marcadamente estacional, favorecido por las temperaturas altas del verano, presentando hibernación en los meses más fríos. / Biological invasions are of special concern to marine biologists. The Mediterranean is one of the most harmed seas by human activities. Among invasive marine organisms, ascidians have become a global problem. The main goal of this PhD thesis is to study ecological and genetic aspects of the biology of four invasive ascidians in the western Mediterranean. In the first chapter, we delve into the post-border processes of the ascidian Microcosmus squamiger studying its population genetic structure. This ascidian has a relatively high capacity of post-border dispersion, which allows gene flow between populations on a small scale. Moreover there are two genetic clusters related to the two original sources of the introduced worldwide populations. These genetic pools are mixed at the population level but not at the individual level. In the second chapter, we evaluate biological interactions in early-life history stages of Microcosmus squamiger and Styelaplicata, among themselves and with mussels. No interactions between the two ascidians were found in fertilization or larval settlement and metamorphosis processes. In contrast, larvae of both ascidians were consumed by the juvenile mussels, and the ascidians also presented shifts in larval behavior in the presence of the mussels. This highlights the importance of the resident community for the establishment of introduced species. In the third chapter, we study the life cycle and population genetic structure of the invasive Didemnum vexillum. The ascidian showed a marked seasonal growth and reproductive cycle, negatively influenced by warm summer temperatures. Additionally, introduced populations in the Mediterranean showed low diversity, suggesting a bottleneck process in the introduction. Finally, in the fourth chapter, we study the life cycle of Clavelina oblonga. This ascidian is in fact an introduced species in the Mediterranean for more than 80 years ago but was erroneously identified as C. phlegraea, native to the region. Their reproductive and growth cycle was markedly seasonal, favored by warm summer temperatures, hibernating in colder months.

One of the most important challenges in marine ecology is understanding the dispersal capabilities of species. Connectivity, if from en evolutionary perspective or a more current ecological perspective, is highly important in determining the natural regulation of populations. By considering both time scales, it is possible to estimate the persistence of a species and its populations. Hence, correct management decisions on conservation issues should include genetic population data combined with oceanographic processes as well as direct measurements of larval dispersal for the full understanding of the population dynamics of species. Therefore, in this thesis I evaluated the population structure, larval dispersal and gene expression in several fish species from the Mediterranean Sea. In this thesis, I approach a variety of ecological and evolutionary challenges from different angles. In chapter 3.1 I analyze the genetic population structure of two different Mediterranean fish species. The first analysis focuses on the conservation of the endangered species Epinephelus marginatus and attempts to give indications on the status of the species as well as population genetic information for the correct design of management strategies. As it becomes clear that oceanographic processes, such as fronts and currents, are important factors in influencing genetic population structure, I proceed with a more multi-disciplinary analysis of the genetic structuring of Serranus cabrilla, a common Mediterranean fish species. The approach includes the comparison of genetic data with oceanographic particle simulations and can give indications on the degree of influence that the physical environment can have on a species genetic distribution. In chapter 3.2 I move from a population approach to the individual level approach. The development, physiology and behavior of an organism determine the life history traits as well as the adaptability to changing conditions. I investigate this by evaluating the differences in gene expression and function for males displaying alternative reproductive tactics as well as females. This is the first genome-wide study for a non-molecular model species in the context of alternative mating strategies and provides essential information on the molecular basis of social dominance. With the production of a de novo transcriptome assembly in chapter 3.2, it can be possible to identify in silico single nucleotide polymorphism markers from this type of data. I start in chapter 3.3 with the development of such markers in Tripterygion delaisi exploring for an optimal protocol allowing future SNP developments in non-model species. This type of genetic markers permits a more time and resource-efficient genotyping for a large amount of samples. Therefore, I used SNPs to explore connectivity patterns by using paternity analysis. The direct evidence of dispersal requires a large amount of individuals, but can provide very important insights and is essential to understanding current connectivity patterns in different marine habitats. This study especially complements the investigations in chapter 3.1 granting a wholesome understanding of population connectivity on evolutionary as well as ecological time scales. / Uno de los retos más importantes en ecología marina es la comprensión de las capacidades de dispersión de las especies. En consecuencia, las decisiones sobre la conservación correcta de nuestros ecosistemas marinos deben incluir datos de genética de poblaciones y procesos oceanográficos, así como medidas directas de la dispersión larvaria para una comprensión más completa sobre la dinámica poblacional de las especies. Por lo tanto, en esta tesis evalúo la estructura poblacional, la dispersión larvaria y expresión génica en varias especies de peces del mar Mediterráneo. El primer análisis se centra en la conservación de la especie amenazada Epinephelus marginatus para dar indicaciones sobre el estado de la especie, así como la información genética de las poblaciones para la gestión adecuada de la especie. Se demuestra que los procesos oceanográficos, como frentes y corrientes, influyen en la estructura genética de las poblaciones, se procede a un análisis más multidisciplinar de la estructuración genética de Serranus cabrilla, una especie común de peces del Mediterráneo. El enfoque incluye la comparación de los datos genéticos con simulaciones de partículas oceanográficos y da indicaciones del grado de influencia que el entorno físico puede tener en una distribución de una especie. En el próximo capítulo investigo la base molecular de las diferencias entre tipos de machos con tácticas reproductivas alternativas mediante la evaluación de las diferencias en la expresión génica. Este es el primer estudio de una especie no-modelo con estrategias de apareamiento alternativas y proporciona información esencial sobre la base molecular de la dominación social. El ultimo capitulo trata con el desarrollo de marcadores SNPs de datos de ultra secuenciación para Tripterygion delaisi explorando un protocolo óptimo que permite el desarrollo de SNPs en especies no -modelos. Finalmente, he usado SNPs para explorar los patrones de conectividad mediante el uso de análisis de paternidad. La evidencia directa de la dispersión requiere una gran cantidad de muestras, pero puede proporcionar información muy importante y es esencial para la comprensión de los patrones de conectividad actuales en diferentes hábitats marinos.

RTK/Ras/MAPK signaling is one of the most common pathways for intercellular communication during development and in the adult organism. In addition, abnormal RTK signaling is associated with many pathological conditions, including cancer. Taking advantage of the available genetic tools of Drosophila, we use the DV axis specification as a model to study the molecular mechanisms by which RTK signaling regulates gene expression and how the same signaling pathway is interpreted differently in distinct tissues. Specifically, we have studied the mechanisms by which the localized activation of the RTK EGFR signaling pathway in the dorsal region of the follicular epithelium restricts pipe gene expression to ventral positions. pipe encodes a sulfotransferase enzyme which is essential for transfering DV polarity from the egg chamber to the embryo. Our results have shown that EGFR activity on pipe is mediated by Mirror, a homeodomain transcription factor induced by the pathway in dorsal-anterior cells. Mirror acts as a direct repressor of pipe by binding to a conserved motif (r1) in the pipe regulatory region. We also have characterized an additional aspect of pipe regulation that depends on Capicua (Cic), a HMG-box transcription factor post-transcriptionally downregulated by RTK/Ras/MAPK signaling. We have shown that the role of Cic is to support pipe expression in ventral follicle cells by repressing mirror in this region. On the other hand, we have analyzed the relevance of the negative post-transcriptional regulation of Cic by EGFR/Ras/MAPK signaling in the establishment of the initial DV asymmetries during oogenesis. Our results suggest a competition mechanism between Cic-mediated repression and EGFR-dependent and –independent activation of mirr, which leads to graded expression of mirr in dorsal and lateral follicle cells. We propose a model where the EGFR-dependent downregulation of Cic modulates the spatial distribution of Mirror protein in the lateral and dorsal-posterior follicle cells, where low, but functional Mirr activity defines the precise position at which the pipe expression border is formed. Finally, we have studied in collaboration with S. Y. Shvartsman group, the function of Cic in response to the RTK Torso signaling pathway in the early embryo. Together with previous results, our work has shown that Cic also participates in the DV subdivision of the embryo acting as a repressor of dorsal zygotic genes, as zerknüllt (zen), and that this activity is inhibited at the poles by Torso signaling. Taking together this result and other previous studies in collaboration with S. Y. Shvartsman group, we have proposed in a new model of gene regulation based in MAPK substrate competition. Molecular competition among MAPK substrates affects the expression of genes such as zen, reveals a new mechanism of integrating anterior, dorso-ventral and terminal systems. To summarize, in this thesis we show that different RTK/Ras/MAPK pathways with key roles in Drosophila development operate through common mechanisms that involve the post-transcriptional downregulation of Cic. By downregulating Cic activity, RTK signals create gradients or boundaries of Cic repressor activity that are then translated into complementary patterns of target gene expression. Since different Cic targets are regulated in different contexts, our results support the view that RTK specificity arises mainly at the level of downstream enhancers responding to general RTK effectors (including Cic) and additional ubiquitous and tissue-specific factors. / La vía RTK/Ras/MAPK es una de las cascadas de señalización evolutivamente conservadas más común durante el desarrollo de los metazoos. En concreto, la vía de EGFR es una de las más destacadas en la inducción de respuestas espacialmente localizadas en Drosophila. Concretamente, en esta tesis hemos estudiado el modo en que la activación localizada de la vía RTK de EGFR en la región dorsal del epitelio folicular restringe la expresión del gen pipe a posiciones ventrales. Pipe codifica para un enzima con actividad sulfotransferasa que resulta esencial para la transmisión de información posicional desde el ovario hasta el embrión. Nuestros resultados han mostrado que la actividad de EGFR sobre pipe está mediada por el factor Mirror, el cual actúa como represor directo de pipe uniéndose a las secuencias reguladoras del gen. Además, hemos caracterizado un aspecto adicional de la regulación de pipe que depende de Capicua (Cic), un factor de transcripción inhibido por señales RTK en diversos sistemas. Así, hemos demostrado que Capicua mantiene la expresión de pipe en la región ventral del epitelio folicular reprimiendo a su vez a Mirror en esa región. Por otro lado, hemos analizado la relevancia de la regulación post-transcripcional negativa de Cic en respuesta a la señal de EGFR para el establecimiento de esta polaridad inicial durante la oogénesis. Proponemos un modelo en el que la regulación negativa de Cic por la vía de EGFR modula la distribución espacial de Mirror en las células foliculares laterales definiendo la posición precisa del borde de expresión de pipe. Finalmente, hemos estudiado la función de Capicua en respuesta a la señal RTK de Torso en el embrión temprano. Junto con resultados previos, nuestro trabajo ha mostrado que Capicua también participa en la subdivisión dorsoventral del embrión actuando como represor de genes cigóticos dorsales como zerknüllt, y que esta actividad se encuentra inhibida en regiones terminales por la vía de Torso.

In the present Thesis, we observed that vitrifying-warming porcine embryos had detrimental effects. Indeed, vitrification and warming were seen to reduce developmental ability and quality of in vitro produced porcine blastocysts, with increased levels of DNA fragmentation, raised levels of reactive oxygen species and alterations in the expression of pluripotency and thermal shock-related genes. This suggested that establishing effective cryopreservation methods was required. Following this, we found that embryo cryotolerance did not only depend on the cryopreservation procedures but also on the composition of the culture medium. On the other hand, beneficial effects were also obtained from exposing embryos to antioxidants. Specifically, L-ascorbic acid addition during culture and/or vitrification and warming enhanced embryo survival, redox status and thermal stress response / En aquesta tesi s’ha observat que els processos de vitrificació i escalfament sotmeten els embrions porcins produïts in vitro a situacions d’estrès. Els resultats obtinguts quant a la capacitat dels embrions a l’hora de sobreviure a la criopreservació i a la qualitat dels embrions vitrificats, amb augments en els nivells de fragmentació del DNA i en les espècies reactives d’oxigen i amb alteracions en el perfil d’expressió de gens involucrats en la pluripotencialitat i en la resposta al xoc tèrmic, suggereixen la necessitat d’incrementar l’efectivitat dels mètodes de criopreservació. S’ha determinat, a més, que la criotolerància embrionària no només depèn dels processos de criopreservació sinó també de la composició dels medis de cultiu. Finalment, s’ha observat que l’exposició dels embrions a molècules antioxidants desencadena efectes beneficiosos. Concretament, l’addició d’àcid ascòrbic en els medis de cultiu i vitrificació-escalfament millora la supervivència, l’estat d’oxidació/reducció i la resposta a l’estrès tèrmic

Dugesia is a genus of free-living flatworms which species inhabit freshwater bodies across a wide distribution range that includes Africa, Madagascar, Eurasia and Australasia. They do not survive in salt water or under desiccation conditions. All Dugesia species have a characteristic triangular-shaped head with two eyes and an elongated and dorsoventrally flattened body. This general shape makes them recognizable to non-experts that also know them because of their regeneration capabilities. The two first works of this thesis are focused on the Dugesia historical biogeography. In first place we studied its species on Greece, because of its complex and well-known geological history and the high diversity of species known on the area. The results showed interesting evidences of the diversification of the genus on the area driven by its history of geological breakage since the Neogene, by the contact and severing of ancient freshwater bodies, and probably by changes in the sea level of the Mediterranean. We also observed patterns of dispersion in the Greek mainland and the Peloponnese. In a second work we included the whole Dugesia distribution range. The aim was to test the previous hypotheses on the antiquity and dispersal routes of the genus to its present geographical distribution. The last hypothesis proposed an African origin in a Gondwanan scenario during the Mesozoic period followed by a dispersion in Eurasia through the impact of the Indian subcontinent or through the impact of the Arabian plate. Our results suggest an older origin, being the genus already present on Pangaea before its breakage. Taking into account this old origin and the internal and external homogeneity of the Dugesia genus species, this is probably a case of long-term or extreme morphological stasis. The copulatory apparatus is essential for Dugesia species description and identification. However, fissiparous specimens do not have this organ, making impossible to know which species are we dealing with. In other cases the inner morphology is very similar or identical among different species, hindering the species identification. In these cases the use of molecular species delimitation methods are of major interest in order to try to overcome these morphology associated drawbacks. In a third work we used one of these methods called General Mixed Yule-Coalescent (GMYC) together with morphological data in an integrative taxonomy framework in order to describe new species from Greece and to give more support to those already described. We formally described four new Dugesia species and the new genus Recurva containing two species and a putative third one. For those clades delimited by the GMYC method for which we did not have any or incomplete morphological data we proposed two different categories: Unconfirmed or Confirmed Candidate Species. The use of molecular species delimitation methods seems to be very convenient when dealing with freshwater flatworms. At the beginning of this thesis we aimed to obtain more molecular markers by the obtention of complete mitogenomes from different triclad species. Unfortunately, this work was delayed and finally we did not succeed in the obtention of a Dugesia mitogenome but of Crenobia alpina (Planariidae) and Obama sp. (Geoplanidae). We took advantatge of these new free-living flatworm mitogenomes and we carried out an evolutionary analysis comparing them with those of parasitic flatworms in order to test if, as previously thought, the different lifecycles have had a selective effect on the nucleotide composition of the mitogenomes. Surprisingly, our results showed a more relaxed selection in the Geoplanoidea species (Dugesia, Obama and Schmidtea) in comparison with the parasitic platihelminths and Crenobia. / Dugesia és un gènere de planàries de vida lliure que habita en les l'aigües dolces d'Àfrica, Madagascar, Eurasia i Australàsia. Són organismes fràgils que no poden sobreviure en aigua salada ni en condicions de dessecació. Les Dugesia tenen un cap triangular amb dos ulls molt característic i un cos allargat i aplanat dorsoventralment. Són conegudes popularment per les seves capacitats de regeneració. Els dos primers treballs d'aquesta tesi s'ha centrat en la biogeografia històrica de les Dugesia. Primerament vam fer un estudi de les espècies que habiten a Grècia, degut a la seva història geològica complexa i ben coneguda. Els resultats mostraren evidències de la diversificació del gènere com a conseqüència de la fragmentació d'aquesta regió, del contacte i aïllament històric dels diferents cossos d'aigua dolça i dels canvis eustàtics. El segon treball de biogeografia històrica inclou tota la distribució de Dugesia, amb el propòsit de testar les hipòtesis prèvies que han volgut explicar l'antiguitat i rutes de dispersió del gènere fins a ocupar la distribució actual. Els nostres resultats descarten un origen sobre Gondwana, com s'havia proposat anteriorment, seguit per una dispersió a Eurasia a través de l'Índia o per la península Aràbiga. Dugesia s'hauria originat al supercontinent Pangea abans del seu trencament. En un tercer treball hem emprat el mètode molecular de delimitació d'espècies General Mixed Yule-Coalescent (GMYC) sobre Dugesia gregues. Vam combinar-ne els resultats amb els d'anàlisis morfològiques per identificar i descriure diverses espècies. Aquells clades delimitats pel GMYC pels quals no disposavem de dades morfològiques o bé eren incompletes van ser proposats com a espècies candidates confirmades o per confirmar. Vam descriure formalment quatre espècies de Dugesia i el nou gènere Recurva. En un treball diferent vam obtenir els mitogenomes de Crenobia alpina (Planariidae) i Obama sp. (Geoplanidae). Malgrat no aconseguir un mitogenoma de Dugesia vam aprofitar la disponibilitat de les noves molècules per realitzar una anàlisi evolutiva comparant-les amb les de platihelmints paràsits per comprovar si, tal i com s'havia proposat, els diferents tipus de vida tenen un efecte selectiu sobre la composició dels nuclèotids. Sorprenentment els nostres resultats mostren una selecció més relaxada en planàries de vida lliure.

Tesi realitzada a l'Institut de Biologia Molecular de Barcelona (IBMB - CSIC) / La ciencia básica ha de engarzarse con las necesidades sociales. Así, nuestro laboratorio esta involucrado en identificar genes específicamente modulados durante el proceso de cicatrización mediante estudios transcriptómicos en colaboración con diversos grupos. En esta línea, en esta Tesis se han perseguido una serie de objetivos concretos: 1) Realización de un análisis funcional de nuevos genes implicados en cicatrización (discos imaginales). 2) Comparación de los genes identificados en cicatrización en Drosophila con genes identificados en modelos de cicatrización en vertebrados. Más en detalle: • Estudio y descripción de la cicatrización en discos imaginales de Drosophila in vitro. • Identificación de genes cuya expresión cambia en las células activas en el proceso de cicatrización. • Caracterización fenotípica de genes que afectan al proceso de cicatrización (definición de categorías fenotípicas) • Caracterización detallada de un subset de genes involucrados en la regulación del proceso de cicatrización • Identificación de reguladores de cicatrización conservados en la filogenia. • Análisis del papel del citoesqueleto de actina en el proceso de cicatrización (el papel del complejo TCP1 (una chaperonina esencial) • Exploración del papel del complejo TCP1 en la regulación del citoesqueleto de actina y tubulina A lo largo de este trabajo hemos alcanzado las siguientes conclusiones: 1. La cicatrización in vitro requiere la actividad de la cascada de señalización de la JNK que controla la formación de contactos transitorios entre los epitelios 2. Han sido identificados una serie de nuevos genes modulados transcripcionalmente durante el proceso de cicatrización. 3. El análisis por interferencia o sobreexpresión de estos genes ha permitido identificar aquellos funcionalmente relevantes en la fusión de los discos imaginales y en la reparación del tejido imaginal. 4. El agrupamiento fenotípico de estos genes ha permitido definir a nivel celular las etapas requeridas para la reparación precisa de los discos imaginales. 5. Las clases principales de genes involucrados en el proceso de cicatrización son las de los reguladores del citoesqueleto de actina y transductores de señales. 6. La caracterización funcional de un subset de genes involucrados en cicatrización analizando marcadores específicos ha permitido definir la red de interacciones entre ellos y su coordinación espaciotemporal. 7. El complejo TCP1 es esencial para la cicatrización de los discos imaginales. 8. La interferencia en la expresión de distintas subunidades del complejo TCP1 demuestra su papel en la fusión de discos imaginales, cicatrización y control del citoesqueleto (actina y tubulina) en Drosophila. 9. Estudios comparativos entre Drosophila y vertebrados a nivel transcriptómico ha permitido identificar una serie de genes conservados entre distintos phila y regulados a nivel transcripcional durante la cicatrización. 10. Análisis funcionales de estos genes demuestran un papel conservado a lo largo de la filogenia apuntando a candidatos potenciales para estudios translacionales.

La MCH es una de las enfermedades cardíacas hereditarias más comunes. La complejidad clínica que caracteriza a la MCH tiene su base en su heterogeneidad genética. Tras varios años de investigación, la identificación de mutaciones en 13 genes que codifican proteínas del sarcómero ha llevado a la definición de la MCH primaria como una enfermedad del sarcómero. Las mutaciones en los genes MYBPC3 y MYH7 están involucrados en la génesis de la enfermedad en aproximadamente la mitad de los pacientes índice con MCH, mientras que las mutaciones en los genes TNNT2, TNNI3, TPM1, ACTC, MYL2 y MYL3 suponen entre un 1 a un 5% de los casos. Dada la dificultad de predecir el riesgo de eventos adversos, como la MS, a partir de los datos clínicos, la investigación genética ha perseguido desde el principio determinar la relación entre el gen mutado o el tipo de mutación y la evolución de la enfermedad. Una correlación entre el genotipo y el fenotipo bien demostrada tendría implicaciones muy importantes para el tratamiento y la prevención de los eventos adversos en estos pacientes. Así en último término, los estudios moleculares y su correlación genotipo-fenotipo podrían ser herramientas útiles para ayudar al cardiólogo a tomar decisiones sobre los tratamientos a aplicar y el seguimiento individualizado de afectados y portadores asintomáticos. A pesar de los avances en el campo de la Genética, en la actualidad no hay consenso definitivo sobre el grado de determinismo asignable a las mutaciones conocidas en los diferentes genes. Por tanto, son necesarios estudios poblacionales con grandes series de pacientes a partir de los cuales poder establecer conclusiones definitivas sobre la relación genotipo-fenotipo. La información sobre genotipo-fenotipo y pronóstico de las diferentes mutaciones en el gen de la troponina T (TNNT2) es escasa y en ocasiones contradictoria, por su baja prevalencia (3-5%) en las series publicadas. Clásicamente se han relacionado las mutaciones en TNNT2 con un alto riesgo de muerte súbita (MS) en jóvenes con HVI leve. En consonancia con todo lo expuesto nos propusimos los objetivos de esta Tesis Doctoral: 1. Estudiar la penetrancia de la miocardiopatía hipertrófica en 9 familias portadoras de una idéntica mutación en el gen TNNT2. 2. Describir las variables morfológicas, clínicas y valor pronóstico de los pacientes portadores de la mutación Arg92Gln en el gen TNNT2 en nuestra serie, y comparación con las publicadas. 3. Comparar las características clínicas y pronósticas de esta población con una cohorte de pacientes con MCH no portadores de esta mutación, especialmente pacientes con otras mutaciones identificadas en TNNT2, otras mutaciones en genes sarcoméricos y pacientes con mutación no identificada. 4. Evaluar la prevalencia de mutaciones en genes sarcoméricos en pacientes con MCH de nuestra comunidad. 5. Demostrar un efecto fundador de la mutación Arg92Gln en la población de estudio. Para ello, desde noviembre del 2007 hasta febrero 2012 se evaluan 210 pacientes consecutivos no emparentados con diagnóstico de MCH. En todos los probandos se realiza estudio cardiológico completo, y se recoge muestra sanguínea para análisis genético. A los familiares de primer grado se les ofrece la realización de screening familiar consistente en evaluación cardiológica y genética (si hallazgo de mutación en el probando). En todos los pacientes se recogen una serie de variables en relación a la caracterización del fenotipo. La penetrancia de la enfermedad la determinamos en base a los criterios eléctricos y ecocardiográficos. En 8 probandos se identificó una idéntica mutación de tipo missense en heterocigosis en el gen TNNT2: Arg92Gln, localizada en el exón 9. Posteriormente se analizó la presencia de dicha mutación en los familiares, y se buscó un posible efecto fundador. Se realiza un exhaustivo análisis de resultados en cuanto a las variables clínicas y genéticas analizadas, prestando especial atención a los marcadores de mal pronóstico y/o muerte súbita en estos pacientes. Nuestro estudio concluye lo siguiente: 1. Las mutaciones en el gen de la troponina T son responsables de un 11.4% de casos de MCH en nuestra población insular, muy superior al de otras series. 2. El origen insular de la población de estudio, y la endogamia asociada habitualmente a este tipo de poblaciones, ha influido probablemente en la alta prevalencia de estas mutaciones. 3. Se constata un efecto fundador causal de los numerosos casos de MCH por la mutación Arg92Gln, localizada geográficamente en el noroeste de Mallorca, que no explica todos los casos, pero sí la mayoría. 4. La mutación TNNT2 Arg92Gln se asocia a miocardiopatía de desarrollo precoz, a menores edades que el resto de mutaciones. La probabilidad que el 50% de los portadores expresen el fenotipo se alcanza a los 37 años de edad. 5. La MCH por mutación TNNT2 Arg92Gln se caracteriza por una alta penetrancia, un alto riesgo de MS en jóvenes, en la mayoría como 1ª manifestación de la enfermedad, precisando el 38% implante de DAI como prevención primaria, con casos de MCH con hipertrofia sólo leve o moderada o en muchos otros casos con MCD al diagnóstico. 6. La mutación Arg92Gln produce alta frecuencia de fenotipo mixto: MCH con hipertrofia leve o moderada, y/o MCD, incluso dentro de la misma familia y a edades similares. Asimismo presentan disfunción sistólica en un porcentaje elevado (45%). 7. Los sujetos índice portadores de la mutación TNNT2 Arg92Gln presentan un perfil de riesgo significativamente peor comparado con el resto de pacientes con MCH y otras mutaciones o mutación no identificada. Existe una peor supervivencia libre de muerte cardiovascular asociada a esta mutación. La supervivencia media es de 54 años. A los 50 años la probabilidad de supervivencia es del 50%.

La metilación del ADN es una de las modificaciones epigenéticas más estudiadas y cuyo mecanismo de acción es más conocido. Consiste en la transferencia enzimática de un grupo metilo a la posición 5' de la citosina. Resulta la principal modificación epigenética en mamíferos, donde se encuentra restringida principalmente a la citosina del dinucleótido CpG, y está relacionada con el silenciamiento transcripcional. Tiene un papel clave en la regulación epigenética y por tanto, su análisis es de gran interés para entender procesos biológicos tan importantes como la replicación del DNA, la expresión génica, la diferenciación celular o las bases moleculares de muchas enfermedades, incluyendo el cáncer. Por este motivo, se han desarrollado numerosas técnicas para el estudio de la metilación del ADN, tanto a nivel regional como global y genómico. No obstante, el análisis masivo del genoma humano presenta un alto coste y dificultad, por lo que la mayoría de estudios a escala genómica utilizan diseños que reducen la complejidad del análisis. Para ello, se analiza únicamente una pequeña porción de las regiones genómicas de interés, una o unas pocas CpGs, y se extrapolan los resultados. Con la aparición de los primeros datos de células humanas obtenidos mediante Whole Genome Bisulfite Sequencing es posible evaluar la exactitud de los diferentes abordajes de complejidad reducida. En el presente trabajo se ha determinado la concordancia entre la metilación de las dianas HpaII y las islas CpG que las contienen. Para ello, se han utilizado datos públicos de dos estudios WGBS de muestras humanas. La diana HpaII se ha seleccionado dada su presencia en el 94% de las islas CpG del genoma. No en vano, la diana de restricción de HpaII (CCGG) es la más utilizada en estudios de metilación del ADN. Nuestros análisis muestran que la metilación de aquellas dianas HpaII que están dentro de islas CpG, resultan excelentes indicadores de la metilación global de las islas. Las dianas HpaII tienen un alto valor predictivo a nivel cualitativo asignando correctamente a la isla CpG como metilada o desmetilada con un alto porcentaje de acierto. Además, cuando las islas CpG disponían de dos o más dianas HpaII las predicciones resultaban extremadamente exactas para el valor de metilación de la isla. Estos resultados proporcionan una validación global de las estrategias basadas en el uso de la enzima de restricción sensible a metilación HpaII. Esta validación puede extenderse a otras aproximaciones de reducción de la complejidad similares. Su principal ventaja radica en la drástica reducción de costes, tanto del trabajo experimental como del análisis computacional. A pesar de la alta homogeneidad existente en la metilación de las islas CpG existen otros escenarios donde no es raro observar diferencias de metilación importantes entre dos CpGs próximas. La disponibilidad de un creciente número de metilomas ha permitido identificar un conjunto de zonas con patrones de metilación diferenciales, DMRs. Estas regiones se han encontrado asociadas a cambios observados en la expresión génica entre estos tipos celulares. En el presente trabajo se han analizado posiciones individuales con una metilación discordante respecto a su entorno. Se han evaluado aquellas que se mantienen desmetiladas cuando su entorno está totalmente metilado. Dada la metilación general del genoma, estos patrones representan anomalías que difícilmente puedan ser azarosas. Así, se han encontrado secuencias anómalas que presentan características asociadas a zonas de alta actividad transcripcional y pueden representar puntos de regulación génica. Además, algunas de ellas se sitúan cerca de genes importantes en la regulación de enfermedades, como el cáncer. Aunque aún son necesarias validaciones experimentales, aproximaciones in silico como la aquí presentada permiten encontrar posiciones de discordancia epigenética que pueden representar dominios funcionales putativos. / DNA methylation consists in the enzymatic transference of a methyl group to the 5’ position of a cytosine. In humans, it mostly occurs in the CpG dinucleotide. It is related to transcriptional silencing and it has a key role in biological processes such as DNA replication, genetic expression or the molecular basis of a lot of diseases, including cancer. For these reasons, many techniques have been developed to analyze it. However, the whole genomic determination of this epigenetic mark results in difficult and expensive analysis. To circumvent this issue, many techniques use a few positions and extrapolate the results. However, no global validation of this hypothesis has been performed. We have determined the correlation between the methylation of HpaII restriction sites and the CpG islands that contain them. We have used Whole Genome Bisulfite Sequencing data from human samples. Our results show that the methylation of the HpaII sites within CpG islands are excellent reporters of the global CpG island methylation, at both the quantitative and qualitative level. The prediction values were improved when the island contained more than one HpaII site. Our results represent a global validation for methylation analysis techniques based on the use of HpaII restriction enzyme. Although the high observed homogeneity in DNA methylation, there are some scenarios where it is not uncommon to observe important methylation differences between two close CpG positions. Many of these regions have been found to be associated to differences in gene expression among different cell types. We have analyzed individual positions with a discordant methylation compared to its closest neighbor CpGs. Using them as indicators, we have found sequences that have characteristics associated to high transcriptional activity and they can represent genetic regulation points. Some of them are close to important disease-associated genes. These positions can represent putative functional domains

The mesoderm is the third germ layer, which is formed at gastrulation between the endoderm and the ectoderm in triploblastsc animals (Bilateria). The mesoderm differentiates into muscles, connective tissues and coelomic cavities. These structures have been key evolutionary innovations that prompted the enormous radiation of the bilaterians that at present make up for the 90% of animal species. As such, understanding the evolution of the mesoderm and its derivatives it is pivotal to understand the evolution of animals. In this thesis I have characterized the molecular patterning of the mesoderm and its derivatives (mainly muscles) in two different acoel species: Symsagittifera roscoffensis and Isodiametra pulchra. The acoels belong to the phylum Acoelomorpha (togheter with nemertodermatids and Xenoturbella). The phylogenetic placement of the Acoelomorpha is highly debated between a position basal to the bilaterians or nested inside the deuterostomes. The Acoelomorpha are morphologically simple animals and a trait sometimes considered a direct link to the cnidarians, the Bilateria sister group. With them they the acoelomorphs share a blind gut and a non centralized nervous system. Within the acoelomorphs, the acoels present the most derived body plan, however it is still rather simple if compared to other bilaterians. The nervous system for example is condensed anteriorly but not clear dorso ventral centralization exists as in most of the remaining bilaterians (the nerve cords are distributed circumferentially around the body). The mesoderm only develops from endodermal precursors, and this might be ancestral, since it is thought that the mesoderm evolved from the endoderm of a diploblastic, cnidarian-like ancestor. The muscles are the only mesodermal derivative in most basal acoelomorphs taxa, although in more advanced ones a parenchymal tissue, stem cells, and gonads also occupy the mesodermal space. The embryonic origins of the latter though, are at present still unknown. Thus acoelomorphs present most of traits considered to be eumetazoan ancestral traits (i.e. most of traits are also part of the cnidarians ground pattern), but still that the possibility that their body plan evolved in consequence of a secondary reduction must be considered as they could be more related to other deuterostomes than cnidarians. I have first investigated the molecular architecture of the muscles in the acoel Symsagittifera roscoffensis and found that although they have a smooth ultrastructural aspect they are molecularly more similar to the bilaterian striated muscles given that tey express key genes that control the contraction in the striated cells. This could be considered a first step into the evolution of the striated musculature without fully reaching it. Indeed, cnidarians have smooth epithelio muscular cells likely regulated by the same bilaterian smooth muscle proteins. However, the possibility of a secondary loss of the striation pattern cannot be discarded given that this already happened in some other bilaterians. Second, I have analyzed the expression of bilaterian mesodermal genes during embryogenesis and postembryonic development of Isodiametra pulchra and found that all but one (a FoxA ortholog) are expressed at the anterior pole, the site where the first myocytes start to differentiate. In juveniles and adults these genes are all expressed in muscles or at least a subset of them. Moreover the same genes are expressed in the gonads of I. pulchra and therefore it suggests that they could orginate in the endo-mesoderm of the worm. The cnidarians orthologues of these genes are expressed in the endoderm, which is moreover the site of the gametes differentation. The similarity between cnidarians endoderm and acoels mesoderm are astonishing, however before drawing conclusions we need a solid phylogenetic frame. / Los acelos son unos gusanos, principalmente marinos, de simetría bilateral y aplastados según el eje dorso ventral, que pertenecen al grupo de los acelomorfos (acelos +nemertodermatidos+xenoturbellidos), cuya posición filogenética es tema de debate entre los biólogos evolucionistas. Los acelomorfos carecen de cavidades corporales, su sistema digestivo es ciego y su sistema nervioso consiste de una concentración neuronal anterior y cuerda nerviosas no claramente desplazadas hacía el lado dorsal o ventral. La simplicidad morfológica de los acelos, entremedia entre la de cnidarios y bilaterales superiores, les hace buenos candidatos para el estudio de la transición de animales radiales-diploblastos a bilaterales-triploblastos. En esta tesis se presentan datos sobre el desarrollo e la especificación molecular del mesodermo, que ha sido una de las innovaciones claves para la radiación de los bilaterales. S. roscoffensis que como todos los acelos tiene exclusivamente musculatura de tipo liso, expresa un gen ortólogo a la troponina, un proteína clave para la regulación de los músculos estriados, y que no existe en cnidarios. La explicación más parsimoniosa es que las bases moleculares de evolución de músculos estriados se han implantado en los acelos, aunque estos no hayan alcanzado la condición completa (explicación favorecida si los acelomorfos son confirmados como grupo hermano de los demás bilaterales). Por otra parte se puede considerar esta condición como debida a una reducción secundaria (explicación favorecida en el caso que los acelos se confirmen ser deuteróstomos). Los ortólogos de genes endodermales de cnidarios y con clara expresión mesodermal en bilaterales se expresan en la músculatura del acelo l. pulchra. Estos datos concuerdan perfectamente con la evolución del mesodermo a partir del endodermo de animales diploblásticos. Aun así, es difícil proponer un modelo específico de evolución de miocitos hasta que la posición filogenética de los acelomorfos no esté resuelta.

Les distròfies de retina (DR) engloben un conjunt de patologies caracteritzades per la degeneració dels fotoreceptors i les cèl•lules de l’epiteli pigmentari de la retina, i representen la major causa de ceguesa hereditària. Són malalties altament heterogènies clínica i genèticament. La retinosi pigmentària (RP) és la DR més freqüent, amb una prevalença d'1:4000 i més d'un milió d'afectats arreu del món. Fins l'actualitat, s'han descrit gairebé 200 gens i loci responsables de DR, però s'estima que aquests expliquen poc més de la meitat dels casos. En els últims anys, s'han centrat molts esforços en la cerca de nous gens i mutacions, fonamental per tal d’oferir als pacients i als seus familiars un diagnòstic genètic acurat i, en alguns casos, una bona prognosi de la malaltia. No obstant, una vegada identificada la causa molecular, l'estudi funcional no es presenta com una tasca trivial. Si bé l'estadi final de les DR és comú en la majoria dels casos, -la mort per apoptosi dels fotoreceptors-, els diferents gens DR participen en una gran diversitat de vies i aspectes cel•lulars dels fotoreceptors. En aquest context, és molt important combinar estratègies in silico, in vitro i in vivo per abordar-ne l'estudi acurat. El treball d'aquesta tesi doctoral s'ha basat en l'obtenció de models in vivo i in vitro per a l'estudi de dos gens causants de distròfies de retina, CERKL i RP2. El primer, va ser descrit pel nostre grup l'any 2004 com a causant de RP d’herència autosòmica recessiva. Malgrat les primers anàlisis de predicció varen revelar una elevada homologia amb la quinasa de ceramides (CERK), diversos estudis han fracassat a l'hora de validar l'activitat fosforilativa de CERKL. A l'inici d'aquesta tesi, CERKL es presentava com una proteïna òrfena de funció. Per aquesta raó, varem iniciar-ne l'aproximació funcional, basada primerament en l'estudi transcripcional en detall del gen a la retina. Els resultats varen mostrar una gran complexitat transcripcional, deguda principalment a l'splicing alternatiu i a l'ús de promotors alternatius. A més, es varen identificar promotors específics de teixit, fet que posava de manifest l’elevada regulació en l’expressió d’aquest gen. Pel que fa a la localització cel•lular de la proteïna, CERKL presenta un clar dinamisme cel•lular entre els compartiments citoplasmàtic i nuclear, amb una localització depenent de tipus cel•lular a la retina murina. Tot plegat, suggeria un paper multifuncional de CERKL. Per abordar la seva contribució a la degeneració retinal, es varen generar dos models animals. D’una banda, un ratolí knockout Cerkl-/- i, de l’altra, un model knockdown en peix zebra. L’estudi acurat del fenotip ens va revelar una disfunció a nivell ganglionar i/o amacrí en el cas del model murí, acompanyada d’un augment de l’estrès i mort cel•lular en la retina. D’altra banda, en el cas del model en peix zebra, els animals presentaven ulls de mida reduïda, juntament amb defectes en la laminació de la retina i en la formació dels segments externs dels fotoreceptors. Segons els nostres resultats, Cerkl no sembla contribuir en el desenvolupament primerenc de la retina d’aquest teleosti, si bé podria participar en processos de degeneració secundaris. En ambdós models es va posar de manifest la contribució de CERKL en les vies d’estrès i apoptosi cel•lular. En el futur, quan les teràpies gèniques estiguin ben establertes i els pacients puguin accedir a elles, serà fonamental el coneixement de les bases genètiques de la malaltia i l’impacte molecular de les mutacions descrites en cada cas. En aquest context, s’han realitzat estudis tant in vitro com in vivo de dues mutacions identificades als gens CERKL i RP2 en famílies espanyoles. Les diferents anàlisis ens han permès comprovar l’impacte patogènic d’aquestes mutacions sobre els productes gènics, basat en la degradació o formació aberrant de les isoformes del mRNA. A més, en el cas de RP2, responsable de RP lligada al cromosoma X, hem reportat per primera vegada un cas de semi-dominància degut a mutacions en aquest gen. L’estudi de les mostres de les dones portadores de la família ens han permès demostrar un biaix en l’expressió dels al•lels de RP2, segurament donada per la inactivació no atzarosa del cromosoma X, com a causa directa del fenotip. / Retinal dystrophies (RD), the major cause of incurable familial blindness in the Western world, are monogenic disorders characterized by progressive dysfunction of photoreceptor and retinal pigment epithelium cells. RD is a group of extremely heterogeneous diseases that show substantial clinical and genetic overlap. Highthroughput technologies have greatly improved our knowledge of the genetic basis of RD. Indeed, more than 180 RD genes have already been reported and this number is constantly increasing. However, although RD genes are known to be involved in a variety of celular and molecular processes in the retina, we are still far from understanding the contribution of most of them to the disease. In this context, we have aimed to study the contribution to the pathogenesis of two RD genes: CERKL and RP2. The first was identified by our group in 2004, as a responsible for autosomic recessive retintitis pigmentosa (RP). To shed light on the pathogenicity of the mutations in this gene, we aimed to characterize its transcriptional repertoire. Our results showed an unexpected multiplicity of CERKL transcriptional start sites plus a high variety of alternative splicing. In order to approach the function of the retinal dystrophy CERKL gene we generated a knockout mouse model. KO animals showed clear and consistent signals of gliosis and retinal stress, togheter with a non-progressive perturbation of ganglion cells. The failure to reproduce the human phenotype in the mouse, not unusual in other hereditary retinal disorders, prompted us to explore zebrafish as an alternative model. The phenotype resulted in abnormal eye development with lamination defects, failure to develop photoreceptor outer segments, increased apoptosis of retinal cells and small eyes. Our data supported that zebrafish Cerkl does not interfere with proliferation and neural differentiation during early developmental stages but is relevant for survival and protection of the retinal tissue. Finally, we have analized the pathogenicity of a new variant in RP2, a X-linked RP gene. The study of the RP2 splicing pattern in blood samples of patients and carrier females showed a aberrant mRNA transcript. High levels of variation observed for RP2-spliced products in female carriers supports X chromosome–skewed inactivation as the cause of the disease in the affected females.