Tesi realitzada a l'Institut Català d'Oncologia - IDIBELL / La presente tesis doctoral consta de 4 proyectos independientes centrados en el estudio de las causas genéticas del cáncer colorrectal (CCR) hereditario: A) Estudio de una variante común (rs2075786) en el gen de la telomerasa como modificador de riesgo de cáncer en síndrome de Lynch: Identificamos un incremento de riesgo de desarrollar un cáncer asociado al síndrome de Lynch (SL) en los pacientes jóvenes (<45 años) con el genotipo AA para rs2075786, los cuales mostraron telómeros más cortos que aquellos con el genotipo GG. Análisis in silico posteriores predijeron la rotura de un sitio de unión a retinoides con efecto modulador de la transcripción, lo cual podría implicar una activación más temprana de la actividad telomerasa. B) Caracterización de tumores desarrollados en el contexto del cáncer colorrectal familiar tipo X: Se realizó una caracterización de los tumores desarrollados en el contexto del cáncer colorrectal familiar de tipo X (CCRFX), comparando los resultados obtenidos con las características propias del CCR esporádico sin fallos en el sistema reparador de bases desapareadas. La caracterización incluyó: a) El estudio del patrón cromosómico: Los resultados obtenidos mostraron patrones de alta inestabilidad cromosómica muy cercanos a los reportados en los casos de CCR esporádico. Sin embargo, revelaron una mayor frecuencia de ganancias en los brazos 2p y 2q, y una mayor frecuencia de pérdidas de 10q al considerar sólo los casos Ámsterdam I. b) El screening de mutaciones en los genes KRAS, BRAF, TP53 y PIK3CA, implicados en las vías de desarrollo del cáncer: Mientras que las frecuencias mutacionales de KRAS, BRAF y PIK3CA alcanzaron valores similares en los dos grupos estudiados, los tumores CCRFX mostraron una carga de mutaciones para TP53 cercana a la mitad de la identificada en los tumores de colon esporádicos, aunque esta diferencia no alcanzó niveles significativos. c) El análisis del estado de metilación de las islas CpG: El estudio de 25 tumores CCRFX identificó un bajo nivel de metilación general para la gran mayoría (88%) de los tumores analizados (≤3/8 promotores de genes metilados). C) Caracterización de tumores desarrollados en el contexto del cáncer colorrectal familiar tipo X: Realizamos la secuenciación del dominio exonucleasa de POLE y POLD1 en 441 pacientes con CCR familiar no polipósico y en otros 88 afectos de poliposis. Como resultado, se identificaron seis mutaciones nuevas o raras en POLD1, cuatro de ellas mostrando evidencias de patogenicidad. Además, se realizó una revisión exhaustiva de los casos identificados previamente en la literatura, elaborándose unas guías de recomendación para el estudio genético de POLE y POLD1, así como para el seguimiento preventivo de portadores. D) Búsqueda de la causa genética del CCRFX mediante ultra-secuenciación de exomas: Con la intención de identificar genes causantes de la agregación familiar presente en el CCRFX, los exomas de tres individuos afectos con CCR de una misma familia con CCRFX fueron secuenciados. Las variantes genéticas identificadas en los tres individuos fueron sometidas a varios procesos de cribado, en base al tipo de mutación y su impacto sobre la proteína, su ausencia en poblaciones control o la relevancia de la función del gen. Varias mutaciones fueron seleccionados para su estudio en profundidad, incluyendo: cosegregación de la variante con la enfermedad, búsqueda de un segundo evento inactivante del alelo salvaje, estudios de predicción in sílico, revisión bibliográfica o búsqueda de mutaciones adicionales en series de pacientes con CCR familiar. En base a los resultados obtenidos, propusimos un modelo poligénico en el que mutaciones en los genes BRF1, BARD1 y CLCA1 estarían contribuyendo a la predisposición al CCR presente en la familia estudiada. / The herein thesis “Caracterización molecular y búsqueda de causas genéticas del cáncer colorrectal hereditario no polipósico” (in English, “Molecular characterization and search for genetic causes in the hereditary non-polyposis colorectal cancer”) comprises four different studies: A) Genetic variant rs2075786 in the telomerase gene modifies cancer risk in Lynch syndrome: We found an association between the rs2075786 A allele, specially in homozygosity, with increased cancer risk of developing cancer in Lynch syndrome (LS) carriers under the age of 45. Besides, cancer-affected LS patients with the AA genotype have shorter telomeres than those with GG. In silico studies predicted that the SNP causes the disruption of a transcription binding site for a retinoid receptor, probably provoking early telomerase activation. B) Comprehensive molecular characterisation of hereditary non-polyposis colorectal tumours with mismatch repair proficiency. Hereditary non-polyposis colorectal tumours showed presence of high chromosomal instability and a higher frequency of chromosome 2p and 2q gains and of 10 q loss, when comparing to sporadic colorectal tumors with mismatch repair proficiency. No statistically significant differences between these two groups were found in the frequency of BRAF, KRAS, PIK3CA and TP53 mutations. Besides, hereditary non-polyposis colorectal tumours showed a low degree of CpG islands methylation. C) Study of the impact of POLE and POLD1 mutations in the familial colorectal cancer and/or polyposis. The exonuclease domains of POLE and POLD1 were studied 441 kindreds with familial non-polyposis colorectal cancer (CRC) and 88 with polyposis. Six novel or rare POLD1 variants, four of them with strong evidence for pathogenicity, were identified in non-polyposis CRC families. We also suggested some recommendations for POLE and POLD1 mutation screening and to define the clinical management of mutation carriers D) Search for the genetic cause of the colorectal cancer type X by whole-exome sequencing. In order to find the genetic cause of the familial colorectal cancer type-X, we sequenced the whole exome of three CRC affected relatives from the same type-X family. After several steps of mutations filtering and extensive experimental and in silico studies, we proposed a poly-genic model to explain the CRC aggregation within the family, in which mutations in BRF1, BARD1 and CLCA1 would be contributing to the familiar CRC predisposition.

Históricamente, los individuos portadores de alelos premutados se consideraban asintomáticos dado que no manifestaban discapacidad intelectual. Sin embargo, desde el año 2000 se han descrito dos patologías de aparición tardía asociadas específicamente a estos individuos: la insuficiencia ovárica primaria (FXPOI; OMIM#311360, ORPHA619) y el síndrome de temblor/ataxia asociado al X-Frágil (FXTAS; OMIM#300623, ORPHA93256). No obstante, cada vez es más evidente que existe un amplio espectro de manifestaciones clínicas que abarca alteraciones cognitivas, psiquiátricas, endocrinas e inmunológicas que afecta en cierto grado a los individuos portadores de la premutación. Un factor que tienen en común todas las patologías asociadas a la premutación es la penetrancia reducida, es decir, no todos los individuos portadores de alelos premutados desarrollaran alguna de estas patologías y en cambio otros pueden llegar a desarrollar varías de ellas. En este contexto, el desarrollo de las tecnologías de alto rendimiento ha proporcionado herramientas científica y metodológicamente prometedoras para el avance del conocimiento sobre las causas y mecanismos involucrados en las enfermedades complejas. El objetivo principal de esta tesis doctoral es el de ampliar el conocimiento de las bases moleculares de las patologías asociadas a la premutación, principalmente en FXPOI y FXTAS. En el trabajo I se han utilizado microarrays de expresión para la determinación del transcriptoma en sangre periférica de mujeres portadoras de la premutación con y sin FXPOI. El análisis de enriquecimiento funcional ha puesto de manifiesto la infraexpresión de vías moleculares de señalización indispensables para la activación de los folículos primordiales, el mantenimiento de su supervivencia y la maduración de los oocitos. Por otra parte, en el trabajo II se ha utilizado la secuenciación masiva de los ARNs de pequeño tamaño y microarrays de expresión de miRNAs para determinar el perfil de expresión de los miRNAs en muestras de sangre periférica de pacientes FXTAS. Este estudio ha demostrado que la biogénesis de los miRNAs no está alterada en este tejido, sin embargo existe una desregulación de su expresión por lo podrían estar implicados en la patogénesis del FXTAS. Por otro lado, los resultados del trabajo III sugieren que la inactivación preferencial del cromosoma X en las mujeres portadoras de la premutación del gen FMR1contribuye significativamente en el riesgo a desarrollar FXTAS, ya que existe un incremento significativo de la inactivación preferencial en las mujeres portadoras de la premutación respecto a la población control. Además, el patrón de inactivación es totalmente distinto. De manera que todas las mujeres con FXTAS con inactivación preferencial inactivaban preferencialmente el alelo normal mientras que las asintomáticas inactivaban preferencialmente el alelo expandido. Finalmente, se ha puesto de manifiesto una disfunción mitocondrial en los fibroblastos de pacientes con FXTAS. Este estudio identificó la disminución de la capacidad oxidativa de los fibroblastos de pacientes con FXTAS, la cual no puede ser atribuida a un menor número de mitocondrias ya que el análisis de la actividad de la enzima citrato sintasa, mostró niveles similares entre pacientes y controles. Además, el estudio mediante microscopia confocal reveló que la red mitocondrial de los pacientes con FXTAS es significativamente más circular y se encuentra menos interconectada que en el grupo control. / For many years, there was no a priori expectation for clinical involvement in the premutation range, since these individuals do not present intellectual disability. However, it is now clear that at least two distinct clinical phenotypes among carriers of premutation alleles: fragile X-associated primary ovarian insufficiency (FXPOI) and fragile X-associated tremor/ataxia syndrome (FXTAS). Premutation alleles are hyper-expressed and disease symptoms result from the deleterious consequences of high levels of expression of the transcript with large numbers of CGG-repeats. There is a lingering difficulty with our understanding of the FMR1 premutation-associated disorders; that is, the inability to predict who will develop any of the particular phenotypes. The major objective of this doctoral thesis is to deep knowledge of molecular mechanisms underlying FMR1 associated pathologies, mainly FXPOI and FXTAS. In the first study, transcription profiling of total blood from FMR1 premutation female carriers with and without FXPOI revealed the deregulation of key signaling pathways involved in oocyte maturation in FXPOI females. These results suggest that the impairment of fertility in these females might be due to a generalized deregulation rather than defects in a single gene. In the second study, it was evidenced a differential miRNA expression profiling in FXTAS blood samples suggesting that miRNAs are involved in FXTAS pathogenesis. In the third study, it was detected differences regarding the allele presenting severe skewed X-chromosome inactivation between the FXTAS and no-FXTAS groups. This finding suggests that skewed X-chromosome inactivation of the normal FMR1 allele may be a risk factor for the development of FXTAS. Finally, mitochondrial dysfunction was evidenced in skin fibroblasts from FXTAS patients. Furthermore, alteration of the mitochondrial network was also observed in FXTAS skin fibroblasts. Collectively, these results indicate that both mitochondrial function and dynamics are implicated in the pathophysiology and/or aetiology of neurological symptoms from FXTAS patients.

Metallothioneins (MTs) are a superfamily of ubiquitous and small cysteine rich metalloproteins present in all eukaryotes and some prokaryotes organisms, that exhibit preferences to coordinate divalent or monovalent heavy metal ions such as Zn(II), Cd(II) or Cu(I). This ability is used by MTs to participate in toxic metal detoxification, metal ion homeostasis and protection against oxidative stress. Features of MT sequences, as well as their structural arrangements, are crucial to determine their metal-abilities and the related functions. In this PhD thesis, we aimed at expanding the knowledge of some peculiar MTs, which are characterized by their unusual long sequence, their Cys-distribution and their modular folding. Thus, initially, the five Tetrahymena thermophila MTs (MTT1 to MTT5), which represent one of the longest MTs reported so far, were characterized to decipher their divalent or monovalent metal preferences. The modular structure of MTT1, MTT3 and MTT5 isoforms, which contain high occurrence of doublets and triplets confer a clear Zn-character to these MTs. Contrarily, MTT2 and MTT4 in which no modular structures, nor Cys doublets and triplets, are present, exhibit a specific Cu-thionein character. The gradation of metal-binding preferences from Zn-thionein to Cu-thionein shown by each MT, as well as the sequence features, constitute an important information source for MT evolutionary studies. Later, two other MTs from the human pathogenic opportunistic fungus Cryptococcus neoformans (CnMT1 and CnMT2) were characterized. Their unusual long sequence, not known in fungal MTs so far, together with their high Cys content, explained their extraordinary Cu detoxification capacity. The modular structure of CnMT1 and CnMT2, with three and five 7-Cys containing regions, respectively, separated by cysteine-free spacers, leads to their folding into Cu5 clusters upon Cu coordination, which enhances their detoxification capacity. This extraordinary ability becomes decisive for C. neoformans virulence in order to avoid the copper toxicity induced by macrophages during mammalian host infection. The sequence analysis of these Cys-rich regions in CnMTs revealed their homology to other well characterized fungal MT models, as Neurospora crassa and Agaricus bisporus MTs, whose Cys pattern almost exactly coincides with that found in CnMTs, this supporting the emergence of the long C. neoformans MTs by ancient tandem repetitions of a primeval fungal MT unit. Finally, in this work other hypothetical fungal MTs were identified in silico, among which those of other human opportunistic pathogenic fungi such as Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis or Fusarium genus fungi. The strategy used in our group to characterize MTs, allowed us to identify a new fungal MT from F. verticillioides which presents the same Cu-thionein features (Cu5 clusters) than each Cys-building blocks from C. neoformans MTs. Evenly, the characteristics presented in F. verticillioides MT is extensible to F. graminearum and F. oxysporum MTs, given that the MT sequences are identical. Overall, this PhD thesis work contributes to enlarge the current limited knowledge about molecular evolution of unicellular eukaryote MTs and at the same time, it opens the door to characterize new pathogenic fungal MTs, whose results may provide interesting conclusions to decipher the role of MTs as virulent determinants and its function as Cu detoxifying. / Les Metal•lotioneïnes (MTs) són una superfamília de metal•loproteïnes petites, ubiqües i riques en cisteïna, presents en tot els eucariotes i alguns organismes procariotes, que coordinen metalls pesants divalents o monovalents com el Zn(II), el Cd(II) o el Cu(I). Aquesta habilitat és utilitzada per les MTs per participar en la detoxificació de metalls, en l'homeostasi d'ions metàl•lics i la protecció contra l'estrès oxidatiu. Les característiques de les seqüències de MT, així com la disposició estructural, són crucials per determinar les seves habilitat metàl•liques i les funcions que se'n deriven. Aquesta tesi pretén ampliar el coneixement d'algunes MTs peculiars, que es caracteritzen per la seva llarga seqüència inusual, la seva distribució de cisteïnes i el seu plegament modular. S'han caracteritzar les cinc MTs de Tetrahymena thermophila (MTT1 a MTT5), sent de les més llargues identificades fins ara. L'estructura modular de MTT1, MTT3 i MTT5, contenen un elevat nombre de doblets i triplets de cisteïna, conferint-los un caràcter de Zn-tioneïna. Contràriament, MTT2 i MTT4, les quals no contenen estructures modulars, ni doblets ni triplets, exhibeixen un caràcter específic de Cu-tioneïna. Els resultats obtinguts en les anàlisis constitueixen una font important d'informació per a l'estudi d'evolució de les MTs. Seguidament, es van caracteritzar dos MTs del fong oportunista patogen d'humans Cryptococcus neoformans (CnMT1 i CnMT2). La seva llarga seqüència, no descrita en MTs de fongs fins el moment, juntament amb l'elevat contingut en cisteïnes, expliquen la seva extraordinària capacitat de detoxificació del Cu. L'estructura modular amb tres (en CnMT1) i cinc (en CnMT2) blocs de 7-cisteïnes cadascun, separats per espaiadors lliures de cisteïnes, permeten el seu plegament en clústers Cus, millorant les seves capacitats detoxificants. Aquesta habilitat resulta decisiva per la virulència de C. neoformans, evitant la toxicitat per coure, induïda pels macròfags durant la infecció de l'hoste, en mamífers. Cadascun d'aquests blocs presenta homologia amb altres MTs de fongs models, com són la MT de Neurospora crassa o la d'Agaricus bisporus, fet que suggereix que les CnMT1 i CnMT2 van evolucionar a partir de repeticions en tàndem d'una mateixa MT primitiva. Finalment, es presenta també la identificació in silico d'MTs hipotètiques d'altres fongs patògens, entre les quals es troben les MTs del gènere Fusarium, i d'entre les que s'ha caracteritzat una nova MT.

La formació d’un sistema nerviós fou una innovació clau en l’evolució dels animals que va permetre desenvolupar una comunicació ràpida i eficient entre les cèl·lules d’un organisme a mesura que n’augmentava la complexitat. Analitzar la neurogènesi embrionària en el major nombre possible d’organismes és, per tant, necessari per reconstruir quin fou el mode ancestral de neurogènesi als metazous. Recentment s’ha descrit que el procés de formació d’aquest sistema d’òrgans pot ser acotat a una sèrie de passos discrets que estan controlats per xarxes gèniques comunes entre organismes model ben establerts. En general, el primer pas d’aquest procés es caracteritza per la separació de l’ectoderma neurogènic i epitelial durant la gastrulació de l’embrió; posteriorment, l’ectoderma neurogènic, o neuroectoderma, es regionalitza en els diferents eixos de coordenades i s’amplifica en quant a nombre de cèl·lules, i, finalment, dona lloc al sistema nerviós. Als Spiralia, un dels dos principals clades d’animals protòstoms, els estudis sobre les qüestions relacionades amb aquests processos s’han centrat als mol·luscs i anèl·lids mentre que poc se sap de la resta de fílums. Així doncs, en aquesta tesi ens hem plantejat utilitzar la planària d’aigua dolça Schmidtea polychroa, un platihelmint amb un sistema nerviós morfològicament simple, per a caracteritzar l’organogènesi dels sistemes nerviosos central, perifèric, i visual, i, posteriorment, analitzar alguns dels mòduls conservats de la neurogènesi dels organismes bilaterals. La nostra estratègia s’ha basat en l’estudi del marcatge amb anticossos neurals i amb l’anàlisi de l’expressió de gens pan-neurals i de subpoblacions neuronals per proposar un model de desenvolupament del sistema nerviós durant l’embriogènesi d’aquella espècie. Els resultats d’aquesta tesi demostren l’origen de novo a l’estadi 4 i a partir d’una població de cèl·lules embrionàries determinades d’aquell sistema d’òrgans; posteriorment, aquestes cèl·lules conjunten en un primordi nerviós bilateral situat al futur pol ventral de l’embrió que serà l’origen d’estructures nervioses com el cervell o els cordons nerviosos laterals i ventrals. A més, també hem determinat la dinàmica temporal i espaial de desenvolupament dels ulls durant l’embriogènesi més tardana; en concret, aquests òrgans es formen a la part més anterior de l’organisme i des d’una cèl·lula precursora comuna que, més tard, es separarà en els primordis de l’ull dret i esquerra. Finalment, hem aïllat i caracteritzat gens ortòlegs del grup soxB i un conjunt de membres dels bHLH proneurals, que són famílies gèniques amb un paper ben establert en la determinació de l’ectoderma neurogènic i l’especificació neuronal, així com també de gens associats amb la diferenciació dels ulls, com ara els membres de la xarxa gènica controlada per pax6 i també altres factors de transcripció com rx, otxA o atonal. L’anàlisi molecular d’aquests mostra, per una banda, que un ortòleg de la família soxB1 es detecta en el presumptiu neuroectoderma de l’embrió i en cèl·lules progenitores neuronals, mentre que els gens de les famílies soxB2, achaete-scute, neuroD i beta3, així com alguns dels gens relacionats amb el desenvolupament dels ulls, estan associats amb l’especificació de poblacions neuronals. En conjunt, els nostres resultats suggereixen que els principals mecanismes moleculars de control de la neurogènesi es troben substancialment conservats als tríclads, tot i que aquests animals mostren un patró embrionari que divergeix clarament de l’ancestral de la resta d’organismes espirals. En resum, la nostra tesi expandeix la comprensió actual de la neurogènesi dels animals bilaterals i, alhora, proporciona un marc bàsic per a futurs estudis sobre el desenvolupament embrionari de les planàries. / The development of a nervous system is a key innovation in the evolution of metazoans, which is illustrated by the presence of a common developmental toolkit for the formation of this organ system. Neurogenesis in the Spiralia, and in particular the Platyhelminthes, is, however, poorly understood when compared with other animal groups. In this thesis we used the planarian Schmidtea polychroa, a free-living flatworm with a morphologically simple nervous system, as a model organism for studying the organogenesis of the central, peripheral and visual nervous systems. Using a combination of immunolabelling and gene expression analysis of neural-specific markers we show that the nervous system is formed de novo from a population of embryonic cells when the embryo adopts the definitive axial identities. Later on, these cells aggregate in a bilateral neural primordium which differentiates the brain, and the ventral and lateral nerve cords. Also, during this late embryonic phase, the eyes develop in the anterior-most part of the organism from a shared precursor. To further understand the early steps of neurogenesis, we isolate and characterize soxB and a set of bHLH genes, which are gene families with a well-established role in metazoan neural development, and genes associated with the specification of eye cell types -in particular, the pax6-gene network and transcription factors of the otx and rx families. Thus, we demonstrate that soxB1-1 is expressed in the putative neuroectoderm and neural progenitor cells, whereas soxB2, neural bHLH genes (achaete-scute, neuroD and beta3), and the eye-related genes so, eya and otxA are associated with the specification of neural subpopulations. Altogether, our findings suggest that the ancestral neural-specific gene regulatory network is substantially conserved in triclad, despite exhibiting a divergent mode of development. In summary, this thesis expands the current understanding of bilaterian neurogenesis and provides a basic framework for further studies in planarian embryonic development. / La formación de un sistema nervioso fue una innovación clave en la evolución de los animales que permitió desarrollar una comunicación rápida y eficiente entre las células de un organismo a medida que aumentaba la complejidad. Analizar la neurogénesis embrionaria en el mayor número posible de organismos es, por lo tanta, necessario para reconstruir cual fue el modo ancestral de neurogénesis de los metazoos. Recientemente se ha descrito que ese proceso puede ser definido con un conjunto de pasos o etapas que están controlados por redes génicas comunes entre organismos modelo bien establecidos. En general, el primer paso de la neurogénesis implica la separación del ectodermo neurogénico y epitelial durante la gastrulación del embrión; posteriormente, el ectodermo neurogènico, o neuroectodermo, se regionaliza en los principales ejes de coordenadas y se amplifica en cuanto a número de células y, finalmente, da lugar a las células nerviosas. En los organismos del grupo de los Spiralia, uno de los dos principales clados de protóstomos, los estudios sobre temas relacionados con esas etapas se han centrado en los moluscos y anélidos mientras que poco se sabe del resto de filos del grupo. Así pues, en esta tesis doctoral nos hemos planteado utilizar la planaria de agua dulce Schmidtea polychroa, un platihelminto con un sistema nervioso morfológicamente simple, para caracterizar la organogénesis de los sistemas nerviosos central, periférico, y visual, y, posteriormente, analizar algunos de los módulos conservados de la neurogénesis de los organismos bilaterals. Inicialmente nuestra estrategia se basó en el estudio del marcaje con anticuerpos específicos neurales y con el análisis de la expresión de genes pan-neurales y de subpoblaciones neuronales para proponer un modelo de desarrollo del sistema nervioso durante la embriogénesis de esta especie. Los resultados de nuestra tesis demuestran el origen de novo en el estadio 4 y a partir de una población de células embrionarias determinadas del sistema nerviosos definitivo; más tarde, estas células se condensan en un primordio nervioso bilateral situado en el futuro polo ventral del embrión que será el origen de estructuras como el cerebro o los cordones laterales y ventrales. Además, también hemos determinado la dinámica temporal y espacial de desarrollo de los ojos durante las etapas más tardías de la embriogénesis: estos órganos se forman en la parte más anterior del embrión y a partir de unas células precursoras comunes que se separarán en los primordios de los ojos derecho e izquierdo. Por último, hemos aislado y caracterizado genes ortólogos del grupo soxB y un conjunto de miembros de los bHLH proneurales, que son familias génicas con un papel bien establecido en la determinación del ectodermo neurogénico y la especificación neuronal, y también de genes asociados con la diferenciación de los ojos, como por ejemplo los miembros de red génica controlada por pax6 y también otros factores de transcripción como rx, otx o atonal. Su análisis molecular muestra que un ortólogo del grupo soxB1 se detecta en el putativo neuroectodermo del embrión y en células progenitoras neuronales de S. polychroa, mientras que los genes de los grupos soxB2, achaete-scute, neuroD y beta3, así como algunos genes relacionados con el desarrollo de los ojos, están asociados con la especificación de diferentes poblaciones neuronales. En conjunto, nuestros datos sugieren que, a pesar de que los tríclados muestran un patrón de desarrollo del zigoto que difiere claramente del patrón típico de la segmentación espiral, los principales mecanismos moleculares de control de la neurogénesis se encuentran conservados en su grupo. En resumen, nuestra tesis doctoral expande la comprensión sobre el desarrollo del sistema nerviosos de los bilaterales a la vez que proporciona un marco básico para futuros estudios con embriones de planarias.

El dogma central de la biología molecular establece que la información génica contenida en el DNA se transcribe a RNA y de este se traduce en forma de proteína. En nuestro caso recorreremos el camino en sentido inverso: de las proteínas a los genes. Un sistema biológico debe explicarse en términos de actividad, regulación y modificación de sus proteínas, los principales efectores en último término de cualquier fenotipo observado. El conjunto de las proteínas expresadas en cada momento dependiendo del tipo celular y de los estímulos recibidos se conoce como proteoma y constituye el objeto de estudio de la proteómica. El primero de los dos grandes proyectos que se tratarán en esta tesis aborda la caracterización del proteoma de los neoblastos, las células madre de la planaria, un invertebrado del filo de los platelmintos (literalmente “gusanos planos”) con unas particularidades que lo hacen un modelo de gran valor para el estudio in vivo de las células madre. Sin embargo, las técnicas que brinda la proteómica en la actualidad, si bien han demostrado su utilidad y su potencial, no son aún lo bastante resolutivas como para dar respuesta a muchas de las preguntas que nos plantea la compleja biología del neoblasto. Este término engloba a una población de células que se está revelando mucho más heterogénea de lo que se había presumido hasta hace pocos años. Por ello, ha sido necesario descender al nivel inmediatamente anterior a la traducción en la cadena de eventos moleculares y sacar partido de la ventaja tecnológica que proporciona actualmente el estudio del RNA con la nueva generación de plataformas secuenciadoras para intentar dilucidar los misterios de la biología de estas células madre. El estudio de cualquier población celular requiere identificarla no solo a través de una descripción morfológica y funcional de las células que la componen sino que es imprescindible encontrar marcadores que permitan aislarla y, llegado el caso, subdividirla en grupos de células con características aún más concretas. Este es el caso de la población de neoblastos, dada la heterogeneidad celular por la que necesariamente está compuesta. Para poder llevar a cabo estos análisis high-throughput ha sido necesario desarrollar técnicas experimentales y computacionales. A nivel experimental cabe destacar la puesta a punto del protocolo de cell sorting para el aislamiento de los neoblastos. En el campo computacional, se han desarrollado pipelines de ensamblado transcriptómico y mapeado sobre las secuencias de referencia, y se han implementado los métodos estadísticos necesarios para determinar aquellos genes diferencialmente expresados en neoblastos. Estos genes han sido validados en el laboratorio para corroborar su expresión en neoblastos y observar el fenotipo tras su inhibición. Algunos, además, han sido caracterizados con mayor detalle (Smed-SmB, Smed-meis-like, Smed-nf-YA/YB-2/YC), lo que ha servido para profundizar en el conocimiento de la biología de los neoblastos. / A biological system can be explained in terms of activity, regulation and modification of its proteins, the main effectors at last of any observed phenotype. The set of proteins being expressed on each cellular type under distinct given inputs has been defined as the proteome and is the focus of the Proteomics field. First of the main two projects described in this thesis has approached the proteome characterization of neoblasts. Those are the stem cells of planarian, an invertebrate species from platyhelmintes phylum that has some relevant features to consider as a model organism for the stem cells research in vivo. Despite their usefulness and potential, proteomic approaches have not enough resolution to bring answers to many of the questions posed by the complex biology of the neoblast. This term comprises a cell population that became more heterogeneous than expected until nowadays. Therefore, it was necessary to deep into the previous step to the translation, taking advantage of the technological developments achieved with the new generation of sequencing platforms for the analysis of RNA sequences, in an attempt to shed light over the biology of the planarian stem cells. Beyond morphological and functional characterization, given the heterogeneity of the neoblasts populations, it is a must to identify specific markers that will assist in their isolation and even subdivide them into cell sets with specific traits. In order to perform those high-throughput analyses both experimental and computational techniques had to be deployed; among the first ones, it is worth to mention the set up for cell sorting to isolate neoblasts, while on the bioinformatics side there was the need to develop pipelines to process, assemble, and map the transcripts found over the reference sequences. Statistical methods were then applied to determine differentially expressed genes in neoblasts. Those genes have been experimentally validated to confirm their expression in neoblasts and to observe the resulting phenotype after their knock-down. Few genes have been analyzed with greater detail (Smed-SmB, Smed-meis-like, Smed-nf-YA/YB-2/YC), to deep into the neoblast biology.

La gran mayoría de planarias son capaces de regenerar, y cuando lo hacen, invariablemente mantienen la polaridad de regeneración; es decir, siempre regeneran una cabeza en las heridas anteriores y una cola en las posteriores al ser amputadas transversalmente. Entender los mecanismos que subyacen dicho fenómeno ha sido objeto de investigación desde finales del siglo XIX. Asimismo, muchos investigadores se han interesado en comprender como una planaria mantiene las proporciones corporales durante la homeostasis, ya que estos organismos experimentan cambios continuos de tamaño. Con la ayuda del genoma secuenciado de la planaria de agua dulce Schmidtea mediterranea y de varios métodos de análisis genéticos (ARN de interferencia, inmunohistoquímica, etc), en esta tesis doctoral he abordado estas cuestiones desde una perspectiva molecular. En concreto, he caracterizado el papel de la vía Wnt/βcatenina en la regeneración y homeostasis del eje antero-posterior (AP) de la planaria S. mediterranea; puesto que durante el desarrollo embrionario de la mayoría de animales estudiados, así como durante la regeneración de cnidarios, esta vía establece el eje primario del cuerpo. Con el fin de analizar las consecuencias de una perdida de función de la vía Wnt/βcatenina en planarias, durante el primer tramo de la tesis doctoral he caracterizado dos parálogos de la βcatenina (Smed-βcatenina-1 y Smed-βcatenina-2). La βcatenina es una proteína típicamente bifuncional implicada en transducir la señal Wnt al núcleo y en mediar las uniones adherentes a la membrana celular. Sin embargo, el análisis de las secuencias aminoacídicas de Smed-βcatenina-1 y Smed-βcatenina-2, junto con los experimentos de ARNi en planarias y de sobreexpresión heteróloga en embriones de Xenopus, sugieren que los dos parálogos de S. mediterránea se han subfuncionalizado en dos proteínas monofuncionales que retienen solo una de estas dos funciones características. Notablemente, Smed- βcatenina-1, pero no la Smed- βcatenina-2, tiene conservada la función de transducir la señal Wnt y su pérdida de función en planarias resulta en la regeneración de una cabeza en vez de una cola (fenotipo two-headed) y en una anteriorización progresiva durante la homeostasis. En el segundo tramo de la tesis doctoral he analizado las consecuencias de una activación ectópica de la vía Wnt/βcatenina en planarias. A tal fin, he caracterizado dos parálogos de la Axina (Smed-axinA y Smed-axinB), puesto que este componente de la vía Wnt es un regulador negativo intracelular muy conservado a lo largo de la filogenia animal. Los experimentos de ARNi simple o conjunta sugieren que Smed-axinA y Smed-axinB actúan de manera sinérgica en planarias regulando negativamente la Smed-βcatenina-1. Así, la pérdida de función de ambas axinas resulta en un fenotipo two-tailed y el triple ARNi contra las axinas y Smed-βcatenina-1 resulta en un fenotipo two-headed. De manera interesante, la formación de una cola ectópica en heridas anteriores no inhibe la regeneración inicial del cerebro en la interfase blastema-postblastema; es más, muchos de los heteromorfos two-tailed con el transcurso del tiempo diferencian otro primordio de cerebro justo al lado de la faringe normal. En conjunto, los datos obtenidos en esta tesis demuestran que la vía Wnt/βcatenina es esencial para restablecer y mantener todas las estructuras del eje AP durante el desarrollo post-embrionario de la planaria S. mediterranea. Además, ponen de manifiesto que en un contexto posteriorizado, existen mecanismos que siguen instruyendo la diferenciación de un primordio de cerebro en el tejido preexistente de manera auto-reguladora. Estos resultados han sido publicados en dos revistas de impacto internacional (Iglesias et al., Development 2008; Iglesias et al., Developmental Biology 2011) contribuyendo significativamente al campo de la regeneración y al de la biología del desarrollo en general. / The main objective of my thesis has been to characterize the role of Wnt/βcatenin pathway in anterior-posterior (AP) axis re-establishment and maintenance during planarian regeneration and tissue homeostasis. To address this issue, I characterized two βcatenin homologs in the planarian Schmidtea mediterranea, Smed-βcatenin-1 and Smed-βcatenin-2. Loss of function of Smed-βcatenin-1, but not Smed-βcatenin-2, in both regenerating and intact planarians, generates two-headed planarians that evolve to a radial-like hypercephalized phenotype in which the AP axis disappears but the DV axis remains unaffected. This anteriorized phenotype supports a conserved role for canonical Wnt signalling in AP axis specification, whereas the role of βcatenin in DV axis establishment would be a vertebrate innovation. When considered alongside the protein domains present in each Smed-βcatenin and the results of functional assays in Xenopus embryos demonstrating nuclear accumulation and axis induction with Smed-βcatenin-1, but not Smed-βcatenin-2, these data suggest that Smed-βcatenins could be functionally specialized and that only Smed-βcatenin-1 is involved in Wnt signalling (Iglesias et al. 2008). In a second set of experiments, I showed that 2-tailed planarians formed after loss-of-function of Smed-axinA/B (well known negative regulators of the Wnt/βcatenin signalling) but form a brain anlage at their anterior wound site. This shows that mechanisms underlying early brain regeneration can be uncoupled from the re-establishment of AP identity mediated by Wnt/βcatenin pathway in planarians. Interestingly, these brain primordia do not grow and develop into a well-elaborated brain illustrating a specific role of the Wnt/βcatenin pathway in later brain morphogenesis. The two-tailed phenotype eventually differentiate another brain primordia next to the normal pharynx and forms two opposed body axes composed of tail, pharynx and brain primordium tissues as a remodelling response (Iglesias et al. 2011). Taken together, these data shows that Wnt/βcatenin pathway is essential to re-establish and maintain the AP axis during planarian post-embryonic development.

Títol addicional: Anàlisi de variants en els gens APC i UNC5C associats a càncer colorectal / PREMISSES: Aquesta tesi s'ha centrat en la caracterització de variants missense en 2 gens associats amb càncer colorectal, el gen APC i gen UNC5C. L'al•lel 11307K del gen APC és considerat un al•lel de risc de moderada penetrància que incrementa el risc de desenvolupar adenomes i carcinomes. Però es desconeix si aquest risc està associat a una activació basal de la via Wnt o a un increment de la taxa de mutació lligat a l'existència d'una regió de vuit adenines consecutives. S'han identificat altres mutacions missense en el gen APC que podrien ser responsables de la predisposició a poliposi com ara l'al•lel APC E1317Q considerat de baixa penetrància o polimorfisme i l'al•lel APC 51028R no descrit fins el moment. Disposem de tècniques, no estandarditzades, que permeten estudiar el seu impacte funcional. El CCRf-X és una síndrome hereditària no poliposa amb un patró d'herència autosòmica dominant, de la qual la seva etiologia genètica segueix sent desconeguda. Per altra banda, hem analitzat l'estat mutacional del gen UNC5C en diferents pacients amb càncer colorectal tipus X (CCRf-X). En aquest gen s'hi ha reportat diferents mutacions que poden causar la pèrdua de funció, i per tant estar implicades en la carcinogènesi colorectal en aquest tipus de càncer familiar. OBJECTIUS: Els objectius d'aquesta tesi són: (i) l'avaluació de la contribució de les variants missense en el gen APC 11307K, 51028R i E1317Q al risc de desenvolupar càncer colorectal; (ii) la identificació de mutacions en el gen UNC5C com a causa de predisposició a càncer colorectal. MÈTODES: Els mètodes utilitzats per estudiar les variants del gen APC inclouen assajos funcionals per valorar in vitro de l'activitat transcripcional mitjançada pel complex 13-catenina/TCF-4 així com l'estudi d'expressió dels gen c-myc i Axina2 . També es va estudiar si el canvi d'aminoàcid tenia un efecte directe en la interacció de la proteïna APC amb 13¬catenina. Finalment vam realitzar estudis in vivo amb línies transfectades valorant l'impacte sobre el potencial tumorigènic així com l'espectre mutacional al gen APC dels tumors induïts. Per l'estudi del gen UNC5C s'han analitzat 562 casos de càncer colorectal familiar. Per les variants identificades s'han realitzat estudis de co-segregació, estudi de presència de mutacions en cohorts de controls i pacients així com prediccions in silico del seu impacte funcional. CONCLUSIONS: (1.) La variant APC 11307K activa la via Wnt, sent aquest increment mediat per una disminució de l'afinitat per 13-catenina, pel que pot incrementar el risc de desenvolupar càncer colorectal. No hem trobat evidencia que recolzi la hipermutabilitat associada a la formació d'una regió de 8 adenines consecutives com a rellevant. (2.) La mutació APC 51028R és molt probable que sigui la responsable de la Poliposi Adenomatosa Familiar Atenuada en el pacient on es va identificar la mutació. Els resultats obtinguts per la variant APC E1317Q no són concloents. (3.) Tot i haver identificat 8 mutacions missense en el gen UNC5C no hem pogut aportar evidencia addicional que ens ajudi a confirmar o descartar que el gen UNC5C jugui un paper rellevant al desenvolupament del càncer colorectal hereditari. / PREMISES: The present dissertation addresses the characterization of missense variants of two genes (APC and UNC5C) associated with colorectal cancer (CRC). 11307K APC gene allele is a moderate risk allele that increases the risk of colorectal adenomas and carcinomas. It is unknown whether the risk associates with an increased activation of wnt pathway or creating a hypermutable tract within the gene. Other missense variants may have a role in CRC predisposition. Familial colorectal cancer type X is an autosomic dominant hereditary condition predisposing to non-polyposis. UNC5C gene mutations have been linked to this syndrome. AIMS: (i) To evaluate the contribution of APC gene variants 11307K, 51028R and E1317Q to the risk of developing CRC; (ii) To identify mutations in the UNC5C gene as cause of hereditary CRC. METHODS: Regarding APC mutations in vitro functional assays for 13-catenin/TCF4 mediated transcription, analysis of c-myc and axin genes expression as well as the interaction between APC protein and 13-catenin was assessed. In vivo assessment of tumorigenic potential as well mutational analysis of the APC gene was performed. Regarding the UNC5C gene 544 familial colorectal cancer cases were assessed. For the variants identified co-segregation studies, analysis in cohorts as well as in silico predictions were determined. CONCLUSIONS: 1. 11307K APC variant activates the wnt pathway being this activation mediated by a diminished affinity for 13-catenin. This increase may account for the increased risk for colorectal cancer. No evidence for hypermutability of the (A)8 tract has been found. 2. APC 51028R variant is likely responsible of the attenuated polyposis in the patient identified. Unconclusive results were obtained for the E1317Q APC variant. 3. In spite of having identified 8 missense mutations in the UNC5C gene no additional evidence supporting or ruling out a role for this gene in CRC risk has been obtained.

Development of the posterior spinal cord involves secondary neurulation, a process poorly understood in which neural tube is formed by cavitation of the tail bud. Comprehension of secondary neurulation is required to understand the morphogenetic origin of high prevalence neural tube defects such as spina bifida. In zebrafish embryos neurulation goes through a stage of neural rod; a neural primordium that hollows a lumen in the middle. To form a single continuous lumen, cells converge to the tissue center, divide in stereotyped orientations perpendicular to it (the so-called C-Divisions), and form a tissue midline composed by apical polarity components that will later originate the central lumen. Polarizing events start with the centrosomes positioning in the midline under the control of unknown cues. Sonic Hedgehog has been widely described as a midline signaling protein in other systems, and its components are located in the apical cilium and the underlying basal body, formed by a centrosome. Shh expression onset occurs during gastrulation in embryonic midline structures —notochord and floor plate- and maintained along neurulation, suggesting a role of Shh in neural tube morphogenesis. Treatment with the Shh inhibitor cyclopamine disrupts the lumina! surface, while Shh pathway activation (Shh-GOF) produces partial to total lumen duplication. Shh-LOF/Shh-GOF display defects in neural lumen positioning and/or formation, confirming a role of Shh in lumen formation. Shh-LOF and Shh-GOF preserve their apicobasal polarity and tissue architecture. Analysis of the dynamics of tissue convergence in ShhGOF embryos shows that compared to the same WT stages the neural plate is wider and the neural plate borders stop converging later in development, suggesting delayed cell convergence movements. However comparison between Shh-GOF and WT cell trajectories to the midline reveals no differences in motion. We found that trajectories of cells committing C-Divisions had indistinguishable motion properties compared to their neighbouring cells, and that Shh-GOF cellular motion properties —velocity and persistency- are resistant to Shh activity. We next analyzed the behaviour of dividing cells and observed that mitosis progressively lengthened along neurulation. Detailed analysis of the mitotic phases shows that Shh-GOF cells show shortened mitoses from condensation to anaphase, but spend the same time –or slightly longer- in metaphase. C-Divisions need orient their metaphase plate so they divide perpendicularly to the midline, giving rise to daughter cells that lie at the sides of the prospective lumen. In C-Divisions, metaphase plate rotations are decreased and slower. We next assessed if division orientation was compromised along neural tube formation. Analysis of division orientation shows higher variability in ShhGOF embryos especially at early stages, a fact that would have morphogenetic consequences in the C-Divisions and lumen formation. With similar cell motion properties and similar metaphase duration between WT and ShhGOF mitotic cells, the latter have quicker mitoses, less metaphase rotations and the stereotyped orientation of polarizing C-Divisions is altered, thereby affecting lumen formation. / Los vertebrados amniotas forman el tubo neural posterior por neurulación secundaria, un proceso apenas estudiado en el que el tubo abre un lumen en el centro. Proponemos el pez cebra (Danio rerio) como modelo para entender el origen embrionario de defectos derivados de fallos en la neurulación secundaria, como es la espina bífida. Durante la neurulación del pez cebra los progenitores neurales compaginan proliferación y convergencia hacia el centro del tejido. Tras la formación de un primordio neural condensado,las células orientan su eje de división perpendicular al eje central (C-Divisions), originando una linea media de polaridad apical que formará el lumen. La polarización empieza con la localización medial del centrosoma, que en interfase constituye la base del cilio. Los componentes de la vía Sonic Hedgehog (Shh) se hallan en el cilio, empezando shh a expresarse en estructuras mediales de la gástrula y néurula -futuras notocorda y placa del suelo-. La inhibición de Shh perturba la continuidad del lumen, y la activación de Shh (Shh-GOF)produce fenotipos de duplicación luminal, sugiriendo que Shh regula la localización/formación del lumen. La polaridad apicobasal de las células permanece intacta, pero el primordio neural es más ancho durante la neurulación. Sin embargo la motilidad de los núcleos y los cilios hacia la línea media es resistente a la actividad de Shh. La duración de las mitosis incrementa a lo largo de la neurulación, y las células Shh-GOF presentan mitosis más rápidas, sin acortamiento de la metafase. Lo mismo sucede en las C-Divisions, en las que la metafase presenta menor rotación y mayor variabilidad en el plano final de división, originando líneas medias ectópicas y duplicación del lumen. Los cambios en los niveles de activación de Shh conllevan consecuencias en la morfogénesis del lumen a través de la regulación de las divisiones durante la formación del tubo neural.

Lysosomal storage disorders (LSDs) are a group of more than 50 different genetic disorders due to the lack of degradation of substrates within lysosomes. Most of them are caused by mutations in genes coding for lysosomal hydrolases. LSDs are mainly inherited in an autosomal recessive manner. Although in the last 25 years there has been much effort and progress to develop therapies aiming the correction of metabolic defects for these diseases, yet there is no effective therapy for many of them, and patients are exclusively treated with supportive care. For several non-neurological LSDs, enzyme replacement therapy may be an option. However, this approach is not efficient, at the moment, for neurological patients. Thus, new therapeutic approaches need to be developed. One of these approaches is the use of drugs that are able to produce a read-through of premature stop codons. One advantage of this strategy is that, if successful, it can be applied to any disease, provided that the molecular cause is a nonsense mutation. The most extensively studied approach involves read-through by drugs affecting the ribosome-decoding site. Niemann-Pick A/B (NPA/B) and Niemann-Pick C (NPC) are two rare inherited monogenic diseases. Although initially were defined as types of the same disease, subsequently they have been considered independent diseases due to the fact that they have different biochemical and molecular features. NPA/B disease is caused by mutations in the SMPD1 gene, localized in chromosome 11, which codes for the enzyme acid sphingomyelinase, a soluble lysosome hydrolase. NPC disease is caused by mutations in the NPC1 gene, localized in chromosome 18, which codes for a lysosomal membrane protein, involved in cholesterol transport. NPC disease also may be caused by mutations in the NPC2 gene, localized in chromosome 14, which codes for a lysosomal soluble protein, involved in cholesterol transport too. The abnormal action of these proteins in patients promotes the accumulation of lipids, which differ in each disease, inside the lysosomes, causing their dysfunction. This thesis makes contributions to the field of LSDs study. Various aspects have been addressed: therapeutic approaches have been tested as a first step in the achievement of a successful therapy for those LSDs bearing nonsense mutations. Important steps in the generation of a new cellular model for NPA/B have been achieved. This model would be helpful to understand the molecular processes that contribute to the development of this pathology and would be a valuable tool for the search of successful treatments. Finally, two new mouse models for NPC have been generated and characterized while one dies few days after birth, the other mimics the main characteristics of the disease and will be useful to probe specific treatments. / Las enfermedades de acúmulo lisosómico (LSDs) son un grupo de más de 50 trastornos genéticos diferentes, debido a la falta de degradación de sustratos dentro de los lisosomas. La mayoría de ellas están causadas por mutaciones en los genes que codifican para las hidrolasas lisosomales. Las LSDs se heredan principalmente de forma autosómica recesiva. Aunque en los últimos 25 años ha habido un gran esfuerzo y progreso para desarrollar terapias dirigidas a la corrección de los defectos metabólicos de estas enfermedades, sin embargo, no hay un tratamiento eficaz para muchas de ellas, y los pacientes son tratados exclusivamente con terapias de soporte. Para muchas LSDs sin afectación neurológica, la terapia de reemplazo enzimático puede ser una opción. Sin embargo, este enfoque no es eficiente por el momento para los pacientes con afectación neurológica. Por lo tanto, nuevos aproximaciones terapéuticas han de ser desarrolladas. Una de estas aproximaciones es el uso de fármacos que son capaces de proseguir la lectura a través de los codones de parada prematuros. La ventaja de esta estrategia es que, si tiene éxito, se puede aplicar a cualquier enfermedad cuya causa molecular sea una mutación sin sentido. Niemann-Pick A/B (NPA/B) y Niemann-Pick C (NPC) son dos enfermedades raras, monogénicas y hereditarias. Aunque inicialmente se definieron como tipos de la misma enfermedad, posteriormente se han considerado enfermedades independientes debido al hecho de que tienen diferentes características bioquímicas y moleculares. La enfermedad de NPA/B está causada por mutaciones en el gen SMPD1, localizado en el cromosoma 11, que codifica para la enzima esfingomielinasa ácida, una hidrolasa soluble lisosomal. La enfermedad de NPC está causada por mutaciones en el gen NPC1, localizado en el cromosoma 18, que codifica para una proteína de membrana lisosomal, dicha proteína participa en el transporte del colesterol. La enfermedad de NPC también puede estar causada por mutaciones en el gen NPC2, localizado en el cromosoma 14, que codifica para una proteína soluble lisosomal, que también participa en el transporte del colesterol. La acción anormal de estas proteínas en los pacientes promueve la acumulación de lípidos, diferentes en cada enfermedad, el interior de los lisosomas, provocando su disfunción. Esta tesis realiza contribuciones en el campo de estudio de las LSDs. Se han abordado diversos aspectos. Varias aproximaciones terapéuticas han sido probadas como un primer paso en el logro de una terapia satisfactoria para aquellas LSDs causadas por mutaciones sin sentido. Se han alcanzado importantes avances en la generación de un nuevo modelo celular para NPA/B. Este modelo podría ser útil para entender los procesos moleculares que contribuyen al desarrollo de dicha patología y podría ser una valiosa herramienta para la búsqueda de tratamientos. Por último, se han generado dos nuevos modelos de ratón de NPC y se han caracterizado. Uno de ellos muere pocos días después de su nacimiento, el otro imita las principales características de la enfermedad y podría ser útil para la investigación de tratamientos específicos.

Tesi realitzada a l'Institut de Química Avançada de Catalunya (IQAC-CSIC) / To direct post-transcriptionally gene silencing, RNAi machinery exploits the formation of base pairs between the loaded guide strand and the complementary mRNA. The Ago2 protein is the “slicer” effector of the RISC and drives the endonucleolytic cleavage only when the siRNA guide strand is full paired with its RNA counterpart. Ago2 is able to incorporate a duplex siRNA molecule, unwinds the double helix and holds one strand while discarding the other. Ago2 bearing only the guide strand is defined “active” and can guide multiple cleavage reactions against the complementary mRNAs. Structural insights into Ago2 assembly process have speculated that early interactions between the siRNA and the Ago2 relies on specific recognition by the PAZ domain. Thus, proper PAZ domain recognition contributes to the specific and productive incorporation of siRNAs into the Ago2. Interactions between PAZ domain and siRNA molecule are essentially asymmetric. The guide strand with its 2-nt 3’overhang is involved in the majority of the contacts between the PAZ pocket and the siRNA, whereas the passenger strand interacts only with its 5’ end residue. In principle, overhang modifications (i.e. 2’-deoxy units) were just introduced to protect the RNA duplex integrity. Only after the understanding of the Ago2 architecture, overhang modifications were also harnessed to improve the siRNA potency and specificity. The comprehension of the PAZ lodging/dislodging motion during the formation of binary (Ago2 + guide) and ternary complex (Ago2 + guide + mRNA) pointed out the importance of adequate affinity between the guide overhang and the PAZ cleft during the Ago2 multi-turnover cleavage process. Affinity analysis on PAZ/siRNA overhang complex has proved the influence of the overhang presence for efficient binding. SiRNA duplexes with shorter overhang (1-nt) or blunt end have respectively highlighted 85-fold and >5000-fold reduced affinity. Hence, taking advantage of more efficient interactions between the PAZ pocket and the strand bearing the unpaired di-nucleotides structure, structural asymmetric siRNA molecules bearing only the antisense overhang were successful employed to bias the RISC strand selection. Moreover, competition between siRNAs, resulting in preferential incorporation of one siRNA type into the RISC machinery, is influenced by the distinct loading kinetics of siRNA molecules. Thus, the knockdown ability of siRNA mixtures is often compromised due to competition between siRNAs. It also has been reported that the simultaneous transfection of two or more siRNAs causes reduced silencing activity of one siRNA species whereas the potency of the other siRNAs were not affected. Even if siRNA competition effects are essentially produced by the interactions with the Ago2 protein, up to now, no available data about a specific Ago2 domain involvement into the siRNA competition have been described. We have been hypothesized that the PAZ domain, playing an important role in the first steps of the strand loading could be specifically involved in the siRNA competition. Given this background we are questioning how the di-nucleotide unpaired structure can influence the siRNA silencing efficiency and specificity. To explore the structural hallmarks critical for the PAZ pocket interaction, we modified the siRNA overhangs with several modifications. In detail, 2 units of β-L-nucleosides (mirror image L-Thymidine), 2’-deoxyribitol, GNA (glycerol nucleic acids)-Thymine and acyclic L-threoninol were introduced at overhang level and the silencing potency (IC50) was measured. Such modifications may provide fundamental clues on structural prerequisite needed for the PAZ recognition and strand loading into the Ago2. / Para dirigir el silenciamiento génico post-transcripcional, la maquinaria de RNAi explota la formación de pares de bases entre la hebra guía cargado y el ARNm complementario. La proteína Ago2 (Argonauta 2) es la "máquina de cortar" del complejo RISC y dirige la rotura endonucleolítica sólo cuando la hebra guía del siRNA está completamente apareada con su homóloga de ARN. Ago2 es capaz de incorporar una molécula de dúplex de siRNA, desenrolla la doble hélice y mantiene una hebra mientras se descarta la otra cadena. Ago2 cargada con la hebra guía se define "activa" y puede guiar múltiples reacciones de escisión contra los ARNm complementarios. El análisis estructural del proceso de ensamblaje de Ago2 ha llevado a la conclusión de que las primeras interacciones entre el siRNA y la proteina Ago2 se basa en el reconocimiento específico por el dominio PAZ. Por lo tanto, el correcto reconocimiento de dominio PAZ contribuye a la incorporación específica y productiva de los siRNAs en el Ago2. La hebra guía con su extremo 3' protuberante que tiene 2-nt está implicada en la mayoría de los contactos entre la cavidad presente en el dominio PAZ. En principio, las modificaciones en los extremos protuberantes se introdujeron para proteger la integridad del dúplex de ARN. Sólo después de la comprensión de la arquitectura de Ago2, se pensó en la utilización de las modificaciones en los extremos protuberantes para mejorar la potencia y especificidad de los siRNAs. Para explorar las características estructurales críticas para la interacción entre la cavidad PAZ, modificamos los extremos protuberantes de los siRNA con varias modificaciones. Específicamente, 2 unidades de un beta-L-nucleósido como la L-timidina (imagen especular de la timidina), de 2'-desoxiribitol, de GNA (glycerol nucleic acids)- timina y del derivado acíclico L-treoninol se introdujeron a los extremos protuberantes y se midió la potencia de silenciamiento (IC50). Tales modificaciones pueden proporcionar pistas fundamentales sobre el requisito estructural necesario para el reconocimiento y carga de la cadena del dominio PAZ de Ago2.