La pregunta por el origen, sentido y finalidad del Derecho nos conduce ineludiblemente hacia la búsqueda de los fundamentos naturales y neurobiológicos de la conducta humana. Las normas jurídicas (y morales) existen sólo porque el hombre, como el paradigma de las especies culturales, establece relaciones sociales. El ser humano como presupuesto, fundamento y sujeto de todo ordenamiento jurídico, político y moral está orientado hacia el reconocimiento, respeto y protección de sus derechos. La relación entre Derecho, Moral, Modelos evolucionistas y Neurociencia forma parte de una de las problemáticas más controvertidas, complejas y sugerentes de la Filosofía Política y Jurídica contemporánea. Sin lugar a dudas, la importancia de los modelos evolucionistas y neurobiológicos desborda otros conocimientos y disciplinas porque manifiesta la pregunta por el ser del hombre, hacia su esencia y su status en el reino de la naturaleza, es decir, del ser humano considerado simultáneamente como un ser biológico, cultural, psicológico y social. Una filosofía o ciencia jurídica desarrollada a partir de un enfoque naturalista permite enfrentarse, de forma real y factible, a la evidencia de que la naturaleza humana no sólo genera y limita las condiciones de posibilidad de nuestras sociedades sino que guía y pone límites al conjunto institucional y normativo que regula las relaciones sociales. Comprender mejor nuestro pasado evolutivo podría sentar las bases para un sistema viable con sentido, para un Derecho que proporcione orden y propósito a nuestras vidas en el futuro.

El cerdo es la especie doméstica más importante económicamente, no solo por ser la principal fuente de carne en la dieta humana, sino también por su papel como modelo animal para la investigación biomédica. La buena compresión de los mecanismos moleculares que afectan a la calidad de la carne en cerdos es esencial para la obtención de carnes con un patrón saludable de ácidos grasos sin afectar el rendimiento productivo. La composición de ácidos grasos es un carácter muy importante para la calidad de la carne; no obstante, nuestro conocimiento sobre la compleja red de procesos y vías metabólicas que forman el metabolismo de los ácidos grasos sigue siendo limitado. Esta tesis tiene como objetivo general mejorar el entendimiento de estos procesos moleculares, con el fin de comprender mejor la arquitectura genética de la calidad de la carne en el cerdo. Se ha evaluado la implicación funcional de la variante DQ144454:c.2645GT presentó una alta asociación con la expresión del propio gen y el contenido de los ácidos palmítico y palmitoleico en músculo y tejido adiposo. Estudios funcionales del promotor del gen validaron la unión de SREBF1 y ERα, sugiriendo un papel importante de ambos factores de transcripción en la regulación del gen ELOVL6. Curiosamente, el SNP ELOVL6:c.-394G>A se encuentra en desequilibrio de ligamiento con el SNP ELOVL6:c.-533C>T y también se encuentra localizado en el único lugar de unión de ERα en el promotor. Además, los estudios realizados permitieron observar una unión diferencial de ERα en función del genotipo del ELOVL6:c.-394G>A, mostrando su unión solo en los animales portadores del alelo G. La unión de ERα ha sido asociada al reclutamiento de metilasas y, consecuentemente, al aumento de los niveles de metilación de los motivos CpG adyacentes. Por lo tanto, las diferencias en la unión de ERα y en el grado de metilación del promotor pueden ser los factores causales de la menor expresión del gen en animales con el alelo G. Por este motivo proponemos el SNP ELOVL6:c.-394G>A como el principal SNP causal de las variaciones fenotípicas del QTL. Finalmente, el transcriptoma del tejido adiposo de cerdos fenotípicamente extremos para la composición de ácidos grasos en músculo fue secuenciado mediante RNA-Seq. Se realizó un análisis de expresión diferencial que permitió identificar 396 genes diferencialmente expresados que modulaban principalmente la lipogénesis, probablemente debido a las diferencias en el contenido de ácidos grasos poliinsaturados entre grupos. Este efecto de la composición de ácidos grasos sobre la expresión de genes lipídicos sugiere que los genes diferencialmente expresados pueden desempeñar un papel importante en el metabolismo de los lípidos y de los ácidos grasos. / Pig is one of the most economically important domestic species, since they have been extensively used not only as the major human meat source, but also for biomedical research. A good understanding of the molecular mechanisms affecting meat quality traits in pigs is essential for obtaining meat with a fatty acids profile more in line with public health recommendations without affecting the production yield. Food fatty acid composition is highly relevant for determining meat quality traits, but its metabolism is composed by a complex network of processes and pathways that are not fully understood. Elucidating these molecular processes is the general objective of this thesis, in order to better understand the genetic architecture of meat quality traits in pigs. We evaluated the functional implication of the genetic variant DQ144454:c.2645GT SNP, identified in the promoter region, was highly associated with its own gene expression and the percentages of palmitic and palmitoleic fatty acids in muscle and adipose tissue. Functional analyses of ELOVL6 promoter showed the occupancy of SREBF1 and ERα, suggesting an important role of both transcription factors on the regulation of ELOVL6 gene expression. Interestingly, the ELOVL6:c.-394G>A SNP is in linkage disequilibrium with ELOVL6:c.-533C>T SNP and also is located within the only predicted ERE on ELOVL6 promoter. In addition, ChIP assays showed that ERα binding depends on ELOVL6:c.-394G>A genotype, showing union only in animals carrying the G allele. It has been described that ERα binding causes the recruitment of Dnmts and, consequently, an increase on the methylation levels of the surrounding CpG motifs. Therefore, differences on ERα binding and the methylation pattern may be the causal factors of the lower ELOVL6 expression in animals with the ELOVL6:c.-394G allele. Hence, we proposed ELOVL6:c.-394G>A SNP as the major putative causal mutation for explaining the phenotypic variation of the QTL analyzed. Finally, the adipose tissue transcriptomes of two groups of phenotypically extreme pigs for intramuscular fatty acid composition were sequenced using RNA-Seq. Differential expression analysis identified 396 genes differentially expressed between groups. The major metabolic pathway differentially modulated between groups was lipogenesis, probably caused by the differences on PUFA content between the two groups. Therefore, the linked effect of fatty acid composition on lipid-related gene expression suggested that differentially-expressed genes may play an important role in lipid and fatty acid metabolism.

La presente tesis es una aportación al conocimiento de las bases genéticas de la criptorquidia no sindrómica y de las formas idiopáticas de espermatogénesis anómala. RXFP2 y ESR1 son dos genes candidatos en la etiología de la criptorquidia no sindrómica debido al rol del receptor RXFP2 en el control hormonal del descenso testicular y al posible papel del receptor ESR1 como mediador de los efectos de substancias capaces de interferir con el desarrollo del tracto urogenital masculino. La primera parte de la tesis está enfocada en el estudio del papel de dos variantes de estos genes en la etiología de la criptorquidia: la variante de secuencia p.T222P del gen RXFP2 (previamente descrita como una mutación patogénica causante de criptorquidia) y el microsatélite (TA)n del promotor del gen ESR1 estudiado por primera vez en relación con la criptorquidia. Para cada una de las variantes hemos analizado 550 sujetos de origen italiana y 570 de origen española (entre pacientes y controles). En la población española la variante p.T222P se ha encontrado en una proporción parecida de casos (1.6%) y controles (1.8%). Estos resultados indican que dicha variante genética es un polimorfismo común sin significado clínico en esta población. En cambio en la población italiana la frecuencia de la p.T222P ha resultado ser significativamente más alta en pacientes que en controles, lo que sugiere un posible papel para dicha variante como factor de riesgo para la criptorquidia. No hemos observado diferencias significativas en la distribución de los alelos (TA)n entre casos y controles. La frecuencia del genotipo A (supuestamente asociado a mayor actividad del promotor de ESR1) ha resultado ser parecida en casos y controles en ambas poblaciones de estudio. Estos resultados indican que el polimorfismo (TA)n no está asociado con la criptorquidia no sindrómica ni en población española ni en población italiana. La segunda parte de la tesis investiga el papel de variantes de número de copias (CNVs) en los cromosomas Y y X en la etiología de la espermatogenésis anómala. El estudio de las CNVs del cromosoma Y incluye: i) el análisis de más de 800 pacientes infértiles (mayoritariamente españoles) para las microdeleciones del cromosoma Y; ii) el estudio de deleciones y duplicaciones parciales de la región AZFc (estas últimas estudiadas por primera vez en población española) en 330 infértiles idiopáticos y 385 controles normozoospermicos de origen española. Nuestros datos basados en 27 portadores de microdeleciones clasicas del Y (3.3%) junto con una amplia revisión de la literatura indican que el diagnóstico genético de rutina para las microdeleciones del Y se podría limitar a varones con concentración espermática ≤2x106 /ml; ii) la técnica de recuperación espermática testicular más adecuada para los pacientes azoospérmicos portadores de deleciones AZFc es la microTESE; iii) el background del Y podría explicar en parte que las microedeleciones del Y si encuentren en diferente frecuencia en distintas poblaciones. Con respecto al estudio de los reordenamientos parciales en AZFc, hemos corroborado que las deleciones gr/gr (deleciones parciales AZFc) representan un factor de riesgo para la espermatogénesis alterada en población caucásica y hemos descartado que las duplicaciones AZFc contribuyan a esta anomalía. Para estudiar el papel de las CNVs del cromosoma X en la etiología de la espermatogenésis anómala, hemos analizado 199 sujetos con diferente concentración espermática utilizando un array de CGH de alta resolución específico para el cromosoma X. Hemos identificado 73 CNVs entre las cuales 29 perdidas (mayoritariamente raras) y 44 ganancias. El número de deleciones por sujeto y la cantidad media de DNA delecionado han resultado ser significativamente mayores en pacientes que en controles, lo que sugiere que un aumento de la “carga de deleción” podría estar implicado en la etiología de la espermatogenésis anómala. Tres deleciones recurrentes localizadas en Xq27.3 (CNV64) y en Xq28 (CNV67 y CNV69) han sido consideradas de mayor interés por su presencia exclusiva (CNV67) o prevalente (CNV64, CNV69) en el grupo de los pacientes. Dichas deleciones han sido objeto de un estudio profundizado que incluye: i) el screening de 627 infértiles idiopáticos y 628 controles normozoospérmicos de dos poblaciones mediterráneas (española e italiana); ii) la caracterización molecular de las deleciones; iii) la identificación de elementos funcionales afectados por las deleciones. Las CNV64 y CNV69 se han encontrado más frecuentemente en pacientes que en controles. La CNV69 presenta al menos dos patrones de deleción (tipo A y tipo B) de los cuales solo el tipo B ha resultado ser significativamente más representado en pacientes, indicando que este tipo de deleción podría ser responsable del efecto deletéreo de la CNV69 en la espermatogenésis. Las CNV64 y CNV69 no contienen genes en su interior pero podrían afectar una serie de elementos reguladores localizados <0.5 Mb. La CNV67, identificada únicamente en un 1.1% de los pacientes (p<0.01), podría directamente afectar el gen MAGEA9 y/o sus elementos reguladores. El análisis del pedigrí de dos portadores de CNV67 ha evidenciado que esta deleción es trasmitida por la madre. La condición de normozoospermico del hermano no portador de uno de los pacientes portador de CNV67 suporta el posible efecto patogénico de esta deleción en la espermatogenésis. Los resultados presentados en esta tesis suportan la visión que la etiología de la criptorquidia es probablemente poligénica y en la mayoría de los casos multifactorial. Es plausible que la aplicación de nuevas tecnologías de secuenciación masiva, garantizando un análisis más a gran escala del background genético del individuo, contribuyan a desenredar la complejidad de la etiología de esta enfermedad. Futuros estudios serán necesarios para corroborar el significado clínico de la CNV67 y confirmar, en otras poblaciones, la significativa asociación entre CNV64, CNV69 tipo B y espermatogenésis anómala. / The present thesis explores the role of specific genetic variants in the etiology of two forms of disturbed male reproductive fitness: non-syndromic cryptorchidism and idiopathic spermatogenic failure. The etiology of non-syndromic cryptorchidism, still largely unknown, is likely to be multifactorial reflecting the involvement of environmental and genetic factors. RXFP2 and ESR1 are interesting candidate genes due to the involvement of RXFP2 receptor in testis descent and the potential role of ESR1 receptor as mediator of substances able to interfere with the development of the male urogenital tract. The first part of the thesis presents the study of two genetic variants of RXFP2 and ESR1, aimed to explore their contribution to non syndromic cryptorchidism. These are the missense substitution T222P in exon 8 of RXFP2, previously proposed as a pathogenic mutation for cryptorchidism, and the VNTR polymorphism (TA)n within the ESR1 promoter, previously reported as a potential functional polymorphism in relation to bone mineralization and spermatogenesis and never studied so far in relation to cryptorchidism. Complessively 550 subjects from Italy and 570 from Spain (with and without history of cryptorchidism) were screened for each variant. The T222P was found at a similar frequency in both patients (1.6%) and controls (1.8%) in the Spanish population thus indicating that in this population it is a common polymorphism with no pathogenic effect. In the Italian study population the frequency of T222P was significantly higher in patients (p = 0.031) supporting a role for this variant as mild risk factor for cryptorchidism (OR= 3.17, 95% CI: 1.07–9.34). Nevertheless, the screening for this variant for diagnostic purposes is not advised because of the relatively high frequency of control carriers (1.4%). Two (TA)n genotypes (A and B) were defined based on the possible allelic combinations of high, medium or low number of repeats and their frequency was compared between cases and controls from the two study populations. Allelic distribution of (TA)n did not show significant differences between cases and controls. The frequency of genotype A, considered the functionally most active one, was also similar in cases and controls both in the Italian and Spanish study populations. These results indicate that the (TA)n within the ESR1 promoter is not associated with non syndromic cryptorchidism neither in the Spanish nor in the Italian population. The second part of the thesis explores the role of Y and X-linked Copy Number Variations (CNVs) in the etiology of spermatogenic impairment. The study of Y-linked CNVs includes: i) the retrospective analysis of 806 mainly Spanish infertile patients screened for Y microdeletions and ii) the study of partial AZFc deletions and duplications (the latter studied here for the first time in the Spanish population) including 330 idiopathic infertile patients and 385 controls from Spain. A total of 27/806 (3.3%) patients carried complete AZF deletions. All were azoo/cryptozoospermic, except for one whose sperm concentration was 1- 2x106/ml. This finding integrated with the literature suggests that routine AZF microdeletion testing could eventually include only men with ≤2x106/ml. In AZFc deleted men a lower sperm recovery rate was observed upon conventional TESE (9.1%) compared to the literature (60%-80% with microTESE) indicating that microTESE ensuring better outcomes, should be regarded as the best option. Haplogroup (hgr) E was the most represented among non- Spanish whereas hgr P among Spanish AZF deletion carriers supporting a potential contribution of Y background to the inter-population variability in deletion frequency. The gr/gr deletion was significantly associated with spermatogenic impairment, further supporting the inclusion of this genetic test in the work-up of infertile men, while partial AZFc duplications do not represent a risk for spermatogenic failure in the Spanish population. The present thesis addresses the topic of X-linked CNVs in spermatogenic defects by presenting the X-chromosome array-CGH (a-CGH) analysis of 199 men with different sperm count. A total of 73 CNVs were identified including 29 mostly rare losses and 44 gains. A significantly higher burden of deletions was found in patients compared to controls due to an excessive rate of deletions/person (0.57 versus 0.21, respectively; p =8.78x10-6) and to a higher mean sequence loss/person (11.79 Kb and 8.13 Kb, respectively; p = 3.43 x10-6). This finding suggests that an increased X chromosome deletion burden may be involved in the etiology of spermatogenic impairment. X-linked Cancer Testis Antigen (CTA) genes resulted to be frequently affected, indicating that their dosage variation may play a role in X-linked CNV-related spermatogenic failure. Three recurrent deletions, mapping to the Xq27.3 (CNV64) and Xq28 (CNV67 and CNV69), were considered of interest for their exclusive (CNV67) or prevalent (CNV64 and CNV69) presence in patients. These deletions were object of an in-depth analysis including: i) the screening of 627 idiopathic patients and 628 normozoospermic controls from two Mediterranean populations (Spanish and Italian); ii) the molecular characterization of deletions; iii) the exploration for functional elements. CNV64 and CNV69 were significantly more frequent in patients than controls (OR=1.9 and 2.2, for CNV64 and CNV69 respectively). CNV69 displayed at least two deletion patterns (type A and type B), of which type B, being significantly more represented in patients than controls, may account for the potential deleterious effect of CNV69 on sperm production. No genes have been identified inside CNV64 and CNV69, nevertheless a number of regulatory elements, have been found to be potentially affected. CNV67 deletion was exclusively found in patients at a frequency of 1,1% (p<0.01) thus resembling the AZF region of the Y chromosome. This deletion may involve the CTA gene MAGEA9 and/or of its regulatory elements. It may also affect regulatory elements of HSFX1/2 showing testis-specific expression. Pedigree analyses of two CNV67 carriers indicated that CNV67 deletion is maternally inherited. One of these families was especially informative since the pathological semen phenotype of the carrier versus his normozoospermic non-carrier brother was a strong indicator for a pathogenic effect of the deletion on spermatogenesis. The results of the present thesis are in line with the prevalent view that the etiology of nonsyndromic cryptorchidism is likely to be polygenic and in most of cases multifactorial. We are confident that high throughput technologies, especially next generation sequencing, will help to unravel the complexity of the etiology of this disease. We provide evidence for a significant association between recurrent X-linked deletions and impaired sperm production. Further studies in other ethnic-geographic groups are needed to confirm the association of CNV64 and CNV69 type B with spermatogenic failure. Due to the specific association of CNV67 with spermatogenic impairment a parallelism with AZF deletions of the Y chromosome is tempting. This CNV merits further investigation in order to provide a feasible substrate for fine molecular characterization, and to further evaluate its putative diagnostic value.

Aquesta tesi es centra en l’anàlisi genètica dels següents trastorns neurològics paroxístics pediàtrics: el torticoli paroxístic benigne del lactant (TPBL), l’hemiplegia alternant de la infància (HAI), la discinèsia paroxística cinesigènica (DPC) i el síndrome de la deficiència del transportador de glucosa GLUT1 (GLUT1DS); i en l’anàlisi genètica i epigenètica de la migranya, un trastorn neurològic paroxístic majoritàriament de l’adult. Els trastorns neurològics paroxístics pediàtrics analitzats són trastorns rars, poc estudiats, en els quals la simptomatologia i el patró d’herència han portat a sospitar-ne una base monogènica i un vincle amb el grup de les canalopaties neuronals. La dificultat en el seu estudi deriva, majoritàriament, de la manca de sèries importants de pacients de les quals se’n puguin obtenir conclusions extrapolables. L’interès d’aprofundir en el seu coneixement, a banda del propi interès científic, rau en trobar les causes que els originen i, així, poder trobar un tractament contra aquests trastorns, millorar la qualitat de vida dels pacients que els sofreixen i/o poder oferir consell genètic als familiars dels individus afectes. - El cribratge mutacional en 2 pacients afectes de TPBL ha identificat la mutació p.Glu533Lys en el gen CACNA1A com a causant de la malaltia, junt amb els estudis funcionals que indiquen que aquesta mutació provoca una pèrdua de funció de la proteïna codificada. - El cribratge mutacional en una cohort de 10 pacients d’HAI ha identificat 3 mutacions en el gen ATP1A3 (p.Asp801Asn, p.Glu815Lys i p.Gly947Arg) en 5 dels pacients, remarcant l’existència d’una heterogeneïtat genètica major de l’esperada en aquest trastorn. - El cribratge mutacional en la DPC ha identificat 3 mutacions diferents en el gen PRRT2 en 8 dels 10 pacients (c.649dupC, c.649delC i c.219_220delGA) descrivint per primera vegada tant la mutació c.219_220delGA com la presència de la c.649dupC i la c.649delC en un mateix pacient. - El cribratge mutacional en la GLUT1DS va permetre trobar mutacions de novo en el gen SLC2A1 en 3 dels 5 pacients analitzats: la c.667C>T, la c.710_711delGA i una deleció de tot l’exó 1; remarcant l’interès en cercar delecions GLUT1DS. La migranya és un trastorn neurològic primari molt prevalent que es manifesta amb crisis episòdiques i recurrents de mal de cap incapacitant. Els criteris de la International Headache Society subclassifiquen la malaltia en diferents subtipus, incloent la migranya sense aura (MO), la migranya amb aura (MA) i la migranya hemiplègica (MH). - El cribratge mutacional de la MH va permetre identificar 4 mutacions en el gen CACNA1A (p.Ser218Leu, p.Thr501Met, p.Arg583Gln i p.Thr666Met), 2 mutacions en el gen ATP1A2 (p.Ala606Thr i p.Glu825Lys) i la mutació p.Phe1661Leu en el gen SCN1A. - L’estudi d’associació genètica a nivell genòmic (GWAS) de la MO va permetre la identificació de 2 SNPs associats a MO, un localitzat en el gen MEF2D i l’altre proper al gen TGFBR2. També es van trobar SNPs que suggerien una tendència a la replicació en el gens PHACTR1 i ASTN2. A més a més, es van replicar els resultats obtinguts en un GWAS anterior, trobant novament associats a migranya els gens TRPM8 i LRP1. Aquest estudi va permetre identificar el primer loci d’associació a susceptibilitat a patir MO. - L’estudi epigenètic en un model de MA va permetre trobar diferències de metilació de l’ADN degudes al tractament amb àcid valproic o topiramat o a l’efecte de la depressió cortical propagant (DCP), el fenomen subjacent de l’aura, en gens que podrien estar relacionats amb la susceptibilitat a patir migranya. Els resultats podrien indicar que ambdós tractaments protegeixen davant les DCPs degut al seu efecte sobre la metilació de l’ADN, emfatitzant la importància dels mecanismes epigenètics en la susceptibilitat de la migranya. / This thesis is focused on the genetic analysis of the following neurological paediatric paroxysmal disorders: benign paroxysmal torticollis of infancy (BPTI), alternating hemiplegia of childhood (AHC), paroxysmal kinesigenic dyskinesia (PKD) and GLUT1 deficiency syndrome (GLUT1DS); and on the genetic and epigenetic analysis of migraine, a neurological paroxysmal disorder mainly found in adults. The neurological paediatric paroxysmal disorders analyzed are rare and present a simptomatology and an inheritance that suggest a monogenic origin and a link with the neuronal channelopathies. The lack of significant cohorts of patients from which obtain transferable conclusions makes it difficult to study them. The main interest of their study, besides the own scientific interest, is based on finding the underlying causes of the disorder which would be the first step to find the appropriate treatment, improve the quality of life of the patients and/or be able to offer genetic counselling to the patients relatives. The results of this study are resumed below: - The mutational screening in 2 patients of BPTI identified the p.Glu533Lys mutation in the CACNA1A gene as the genetic cause of this disorder, in line with the functional studies that indicate that this mutation induces a loss-of-function of the coding protein. - The mutational screening in a cohort of 10 patients of AHC identified 3 mutations in the ATP1A3 gene (p.Asp801Asn, p.Glu815Lys and p.Gly947Arg) in 5 patients, highlighting the existence of a greater genetic heterogeneity than expected in this disorder. - The mutational screening in PKD identified 3 different mutations in the PRRT2 gene in 8 out of 10 patients (c.649dupC, c.649delC and c.219_220delGA), describing for the first time the mutation c.219_220delGA and also the presence of both the duplication and the deletion in the c.649 position in the same patient. - The mutational screening in 5 patients of GLUT1DS identified de novo mutations in the SLC2A1 gene in 3 patients, specifically c.667C>T, c.710_711delGA and a deletion affecting the whole first exon, highlighting the interest in looking for deletions in GLUT1DS. Migraine is a common primary neurological disorder that presents with episodic and recurrent attacks of disabling headache. The criteria of the International Headache Society divide the disorder into different subclasses, including migraine without aura (MO), migraine with aura (MA) and hemiplegic migraine (HM). The results of the genetic and epigenetic studies of migraine are resumed below: - The mutational screening of HM identified 4 mutations in the CACNA1A gene (p.Ser218Leu, p.Thr501Met, p.Arg583Gln and p.Thr666Met), 2 mutations in the ATP1A2 gene (p.Ala606Thr i p.Glu825Lys) and the mutation p.Thr501Met in the SCN1A gene. - The genome wide association study (GWAS) of MO identified 2 SNPs associated with MO, one in the MEF2D gene and the other close to the TGFBR2 gene. There were SNPs that showed suggestive evidence of replication at PHACTR1 and ASTN2 genes. Moreover, previous GWAS findings were replicated, finding the genes TRPM8 and LRP1 associated with migraine. This study allowed the identification of the first loci associated with MO. - The epigenetic study in a MA rat model identified DNA methylation differences due to the administration of valproate and topiramate drugs and/or due to the cortical spreading depression (CSD) effects in genes that could be related to the migraine susceptibility. These results could indicate that both treatments protect against CSD due to their effects on DNA methylation, highlighting the importance of the epigenetic mechanisms in the migraine susceptibility.

El complexos SWI/SNF són remodeladors de cromatina dependents d’ATP que es troben altament conservats al llarg de l’evolució. Aquests complexos poden regular l’accessibilitat a una zona genòmica alterant l’estat de la cromatina i actuant com a reguladors transcripcionals. A més d’una subunitat enzimàtica central i diverses proteïnes que conformen el nucli, els complexos SWI/SNF incorporen subunitats accessòries que confereixen especificitat i varien segons el tipus cellular i el context del desenvolupament. Les poteïnes accessòries humanes BAF60a, BAF60b i BAF60c representen proteïnes paràlogues amb funcions especialitzades, de manera que mutacions en elles s’han relacionat amb diverses malalties (p. ex. càncer). Per tal de tenir una millor visió de les funcions de les unitats accessòries del complex SWI/SNF hem estudiat els paràlegs de les proteïnes BAF, codificades pels gens ham-3 i swsn-2.2. Hem investigat les funcions de ham-3 i swsn-2.2 en diversos teixits i processos del desenvolupament i hem observat que els dos gens són redundants en diversos contextos. Tot i així, i com ocorre amb els gens humans, HAM-3 i SWSN-2.2 també han adquirit funcions específiques. / SWI/SNF complexes are ATP-dependent chromatin remodelers highly conserved through evolution. By altering the chromatin state, these complexes can regulate the accessibility of a given genomic region and thereby perform transcriptional regulation. Besides a central enzymatic subunit and various core proteins, SWI/SNF complexes incorporate accessory subunits that confer specificity to a given complex and vary depending on the cell type and developmental context. The human accessory proteins BAF60a, BAF60b and BAF60c represent paralog proteins with specialized functions, and mutations in the BAF60 genes are involved in human disease (e.g. cancer). To get closer insight in the functions of SWI/SNF accessory subunits, we studied C. elegans homologs of the BAF60 proteins, encoded by the paralog gene pair ham-3 and swsn-2.2. We investigated ham-3 and swsn-2.2 functions in various tissues and developmental processes and observed that the two genes act redundantly in many contexts. However, as their human counterparts, HAM-3 and SWSN-2.2 have also acquired specialized functions.

Durante las últimas décadas ha crecido el interés en cuestiones como qué nos hace humanos o cómo difiere a nivel molecular el cerebro humano del de nuestros parientes más cercanos. Se han podido identificar cientos de genes con diferencias de expresión entre el ser humano y otros primates no humanos. Sin embargo, es importante estudiar más en detalle estos genes para comprobar si realmente están involucrados en las características específicas de nuestro cerebro. Las trombospondinas son glicoproteínas extracelulares multiméricas que modulan las interacciones entre células y con la matriz extracelular y que se han implicado en la sinaptogénesis. Dentro de la familia de las trombospondinas, los genes de la trombospondina-2 (THBS2) y trombospondina-4 (THBS4) se expresan, respectivamente, alrededor de 2 y 6 veces más en la corteza cerebral humana en comparación con la de chimpancés o macacos. Para conocer las causas de estas diferencias de expresión, hemos llevado a cabo un análisis comparativo y funcional de la región promotora de THBS4 en humanos y en chimpancés. Hemos identificado y validado un sitio de inicio de transcripción (TSS) alternativo para THBS4 que se encuentra 44 kb aguas arriba del TSS de referencia y que genera una nueva isoforma de ARNm que podría haber aparecido más tarde durante la evolución. Para comparar los niveles de expresión de ambos transcritos se realizó RT-PCR cuantitativa en diferentes tejidos humanos y en muestras de corteza cerebral de 11 humanos, 11 chimpancés y 8 macacos. Curiosamente, la nueva isoforma de THBS4 se expresa principalmente en los tejidos cerebrales. Por otra parte, la diferencia de expresión entre humanos y primates no humanos para la isoforma alternativa son consistentes con la encontrada al analizar la expresión total de THBS4. Por tanto, el aumento de la expresión de THBS4 en el cerebro humano parece estar relacionado con una mayor transcripción a partir del promotor alternativo. Para evaluar la actividad de ambas secuencias promotoras en humanos y en chimpancés, hemos llevado a cabo ensayos con un gen indicador en diferentes líneas celulares humanas. Se han encontrado diferencias significativas entre los dos promotores, aunque en las líneas de neuroblastoma que utilizamos no existen diferencias significativas entre especies. Este resultado es consistente con la búsqueda de sitios de unión de factores de transcripción en la región del promotor alternativo, ya que sólo se detectaron tres posibles sitios de unión diferentes entre ambas especies. Se ha comparado también la metilación del ADN en una isla CpG situada aguas arriba de la nueva isoforma de THBS4 en 5 humanos y en 5 chimpancés, detectando niveles bajos de metilación en ambas especies. Basándonos en las predicciones informáticas disponibles y en experimentos piloto de ChIP-Seq, hemos buscado posibles enhancers que estén controlando el promotor alternativo de THBS4, pero no hemos encontrado ningún candidato fiable. Por último, en humanos, se ha visto que hay dos haplotipos de THBS4 diferentes que se encuentran mantenidos mediante selección equilibradora. Sin embargo, la comparación experimental de ambos no muestra ningún efecto del genotipo sobre la expresión de THBS4. Aunque no se ha conseguido identificar la causa concreta del incremento en los niveles de THBS4 en humanos, en base a nuestros resultados sugerimos que la expresión diferencial del gen podría estar relacionada con una secuencia potenciadora específica del cerebro que no hemos conseguido localizar. Comprender como se encuentra regulada esta posible secuencia potenciadora podría ser relevante para entender cuales son las consecuencias funcionales de las diferencias de expresión de THBS4 sobre la evolución del cerebro y, en última instancia, darnos pistas sobre como nos convertimos en humanos. / The last decades have seen a growing interest in what makes us humans and how the human brain differs from that of our closest relatives at the molecular level. Hundreds of genes with expression differences between human and non-human primates have been identified. However, it is important to study these genes in more detail to see if they are really involved in human brain characteristics. Thrombospondins are multimeric extracellular glycoproteins that modulate cell-cell and extracellular matrix interactions and have been implicated in synaptogenesis. Within the thrombospondin family, thrombospondin-2 (THBS2) and thrombospondin-4 (THBS4) show, respectively, a ~2-fold and ~6-fold upregulation in human cerebral cortex compared to chimpanzees and macaques. To analyze the causes of these expression differences, we have carried out a comparative and functional analysis of the THBS4 promoter region in humans and chimpanzees. We have identified and validated an alternative transcription start site (TSS) for THBS4 that is located ~44 kb upstream from the known TSS and generates a new mRNA isoform that might have appeared later that the reference one during evolution. To compare expression levels of both mRNAs, we performed quantitative RT-PCR in different human tissues and cortical regions of 11 humans, 11 chimpanzees and 8 macaques. Interestingly, the new isoform of THBS4 is expressed mainly in brain tissues. Moreover, expression differences between human and non-human primate cortex for this alternative isoform are consistent with those shown for total THBS4 expression. Increased THBS4 expression in the human brain therefore appears to be related to higher transcription from the alternative promoter. To evaluate the activity of both THBS4 promoter sequences we performed reporter assays from humans and chimpanzees in different human cell lines. We have found significant differences between both promoters, but not between species, in the neuroblastoma cell lines assayed. This result is consistent with the search for transcription factor binding sites (TFBS) in the alternative promoter region, which only detected three putative TFBS differentially predicted between both species. We also compared the DNA methylation in a CpG island upstream the new isoform in 5 humans and 5 chimpanzees detecting similar low methylation levels in all of them. Based in the computational predictions available online and ChIP-Seq pilot experiments, we searched for a putative enhancer region controlling the THBS4 alternative promoter without finding any reliable candidate. Finally, in humans, THBS4 has been associated to two different haplotypes that are maintained by balancing selection, but experimental analysis did not show any effect of the genotype over THBS4 gene expression. Although we have not been able to identify the ultimate cause of the increased THBS4 levels in humans, based on all our results we suggest that the differential gene expression might be related to a brain-specific enhancer sequence that has so far escaped our scrutiny. Understanding its regulation could be relevant to the functional consequences of THBS4 expression differences during human brain evolution and ultimately could give us clues of how we became humans.

The DNA Damage response is a crucial signaling network that preserves genome integrity. This network is an ensemble of distinct but often overlapping sub-networks, where participating components exert different functions according to precise spatiotemporal frameworks. To understand how these sub-networks have been assembled and emerged along evolution, we have screened DDR components in 47 selected species covering the tree of life and analyzed their evolutionary and functional properties according to different gene ages and following a variety of classifications. This is the first time a systematic analysis covers the DDR network’s evolution as a whole. Our results indicate that most of the DDR components are ancestral genes, that all the subnetworks contain at least one representative protein traceable to Prokaryota, and that the ancestral core of the DDR machinery is mainly related to repair and is mostly built upon sensor and effector activities. Along evolution the enlargement of the network has occurred through the addition of new components that have evolved to interact and work together with the ancient ones, which may have increased the complexity of the DDR network in terms of fine-tuning and cross-talk to other pathways. / La respuesta al daño en el ADN (DDR) es una red de señalización esencial que mantiene la integridad genética. Esta red es un conjunto de sub-redes distintas, pero a menudo solapantes, donde los componentes que participan desempeñan diversas funciones según marcos espacio-temporales precisos. Para comprender cómo estas sub-redes han surgido a lo largo de la evolución y cómo se han ido ensamblando, hemos buscado componentes de DDR en 47 especies que cubren el árbol de la vida, y hemos analizado sus propiedades evolutivas y funcionales según distintas edades de genes y siguiendo varias clasificaciones. Esta es la primera vez que un análisis sistemático cubre la evolución global de la red de DDR. Nuestros resultados indican que la mayoría de los componentes de la DDR son genes antiguos, que todas las sub-redes contienen al menos un representante trazable hasta procariotas, y que el núcleo ancestral de la maquinaria de DDR está principalmente relacionado con reparación y se construyó sobre actividades de detección y efectores. A lo largo de la evolución, la ampliación de la red ha ocurrido a través de la adición de nuevos componentes que han evolucionado para interaccionar y funcionar junto a los antiguos, lo que puede haber incrementado la complejidad de la red de DDR en términos de precisión y de comunicación con otras redes.

Phototransduction is the biochemical process by which a light stimulus is converted to a neuronal signal. The process functions through complex interactions between many proteins, which work in concert to tightly control the dynamics of the photoresponse. The primary aim of this thesis is to describe how the topology and kinetics of these interactions have given rise to detectable patterns of molecular evolution. To this end, a secondary aim is to develop a comprehensive mathematical model of mammalian phototransduction, first through the improvement of an existing model of the amphibian system and then through the re-tuning of that model to fit mammalian data. The results show a striking importance of the signal recovery-related proteins in shaping the photoresponse. This is reflected in relaxed evolutionary constraint on those proteins that exert the greatest dynamic influence. Meanwhile, the proteins most central to the process, while less important dynamically, are strongly constrained due to their essentiality in proper signal transduction. / La fototransducció és el procés bioquímic pel qual un estímul de llum es converteix en un senyal neuronal. El procés funciona a través d'interaccions complexes entre moltes proteïnes, que funcionen en conjunt per controlar estretament la dinàmica de la fotoresposta. L'objectiu principal d'aquesta tesi és descriure com la topologia i la cinètica d'aquestes interaccions han donat lloc a patrons detectables d'evolució molecular. Amb aquesta finalitat, un objectiu secundari és el desenvolupament d'un model matemàtic integral de la fototransducció en mamífers, primer a través de la millora d'un model existent del sistema d'amfibis i després a través de la refinament d'aquest model per ajustar-lo a les dades de mamífers. Els resultats mostren una importància notable de les proteïnes relacionades amb la recuperació del senyal en la fotoresposta. Això es reflecteix en una relaxació de les constriccions evolutives en les proteïnes que exerceixen la major influència dinàmica. Alhora, les proteïnes més centrals per al procés, tot i essent menys importants dinàmicament, es troben fortament limitades degut a la seva essencialitat en la correcta transducció de senyal.

El carcinoma de pulmó de cèl·lula no petita (CPCNP) és un dels tumors més freqüents en la població caucàsica en què la histologia més comuna és l’adenocarcinoma. En diversos estudis clínics es va observar que un subgrup de pacients amb CPCNP avançat, amb unes característiques molt concretes (sexe femení, d’histologia adenocarcinoma i no fumador), es beneficiaven del tractament amb uns inhibidors de l’activitat tirosina quinasa (ITQ) d’EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor). Les mutacions en aquest domini del gen EGFR, descobertes l’any 2004, van ser descrites com les responsables de les respostes als ITQ. El 90% d’aquestes mutacions són delecions en l’exó 19 i una mutació puntual en la posició L858R de l’exó 21. Tot i així, més de la meitat dels pacients amb les mutacions de sensibilitat tractats amb ITQ recauen. Una de causes més comunes és l’aparició de la mutació de resistència T790M en l’exó 20. El mètode estàndard per estudiar alteracions genètiques és la seqüenciació Sanger. Com que la seva sensibilitat de detecció es situa al voltant del 20%, en aquest treball s’han optimitzat altres tècniques més sensibles, com l’anàlisi de fragments per detectar les delecions de l’exó 19 (GeneScan) i la discriminació al·lèlica per TaqMan per a les mutacions L858R i T790M en mostres de teixit tumoral inclòs en parafina i per a mostres amb poca cel·lularitat tumoral. A continuació, s’ha realitzat tant la validació analítica (límit de detecció; quantitat mínima d’ADN mutat necessària per detectar la mutació; sensibilitat, especificitat i repetibilitat de les tècniques, i estudi de l’heterogeneïtat de les mutacions dins el tumor) com la validació clínica (respostes al tractament, supervivència i PFS dels pacients amb mutació de l’Spanish Lung Adenocarcinoma Data Base (SLADB)). Aquesta validació ha permès l’aplicació d’aquestes tècniques en l’estudi de les mutacions dels pacients inclosos en l’assaig EURTAC (primer estudi realitzat amb pacients caucàsics mutats) i la seva relació amb la resposta, supervivència i PFS dels pacients tractats amb erlotinib respecte als tractats amb quimioteràpia convencional. Per una altra banda, l’obtenció de mostra de teixit inclòs en parafina no és viable en molts pacients avançats. Es va pensar en l’ADN circulant de la sang perifèrica com a font d’informació de l’estat mutacional del tumor ja que es pot obtenir d’una manera no agressiva del pacient i permet la seva monitorització al llarg del temps. Malgrat que els processos tumorals alliberen ADN al torrent sanguini, hi ha molts altres processos biològics que incrementen la concentració d’al·lels wild type (wt). Per tal de detectar aquesta baixa concentració d’al·lels mutats en sang perifèrica, s’han optimitzat les tècniques de GeneScan i TaqMan afegint la sonda PNA en les reaccions per inhibir l’amplificació dels al·lels wt. S’ha realitzat tant la validació analítica (límit de detecció; quantitat mínima d’ADN mutat necessària per detectar la mutació; sensibilitat, especificitat i repetibilitat de les tècniques) com la validació clínica (respostes al tractament, supervivència i PFS dels pacients mutats en sang perifèrica, de l’SLADB i l’EURTAC). S’ha comprovat que aquestes tècniques són adequades, no només en l’estudi de les mutacions en teixit inclòs en parafina sinó també en mostres de sang perifèrica, en obtenir-se resultats molt semblants als descrits en la bibliografia. / Non-small-cell lung cancer (NSCLC) is a major cause of death from cancer in the Caucasian population. Some clinical studies of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) that target the epidermal growth factor receptor (EGFR) gene in patients with advanced NSCLC showed that some patients with clinical and pathological factors -such as female sex, adenocarcinoma histology (the most frequent histology in NSCLC) and never smoker status- experienced rapid responses. In 2004, it was reported that the presence of somatic mutations in the kinase domain of EGFR strongly correlates with increased responsiveness to EGFR TKIs. Two types of mutation, short in-frame deletions in exon 19 and the exon 21 point mutation L858R, have been reported to comprise up to 90% of all activating EGFR mutations. However, about half of patients with these activating mutations who present dramatic initial responses will eventually develop resistance to TKI treatment. Such resistance is associated with the secondary T790M resistance mutation in exon 20. Thus far, Sanger sequencing is the conventional method used for detection of mutations in tumor cells but its sensitivity is suboptimal for clinical tumor samples because it fails to detect mutations in samples with less than 20% mutated alleles. In this study, other methods have been tested such as fragment analysis to detect exon 19 in-frame deletions (GeneScan) and allelic discrimination by TaqMan assay to detect both exon 21 L858R and T90M exon 20 point mutations from formalin fixed paraffin embedded tissue and also from samples with few tumor cells. We performed analytical validation (detection limit, minimum amount of mutated DNA necessary for detection, sensitivity, specificity and repeatability of techniques, and tumor heterogeneity) and clinical validation (treatment response, survival and progression-free survival [PFS] of EGFR mutated patients from the Spanish Lung Adenocarcinoma Data Base [SLADB]. After a successful validation process, EGFR mutations were analyzed from patients in the EURTAC trial, which was the first randomized trial comparing erlotinib with platinum-based chemotherapy as first-line treatment in non-Asian patients with EGFR mutations; treatment response, survival and PFS were assessed. However, the difficulty to obtain tumor tissue, particularly from patients with advanced NSCLC, stimulated interest in analyses using surrogate samples, such as peripheral blood, which frequently contain circulating free DNA derived from tumor tissue. This circulating free DNA could be obtained by non-invasive procedures that allow for serial tumor sampling during lung cancer screening. Although tumor processes release DNA to the bloodstream, other biological and physiological mechanisms increase the concentration of wild-type (wt) alleles. There are several drawbacks that interfere with circulating free DNA mutation detection assays like the low frequency of the mutations that occur in the tumor, their poor release to the bloodstream and the dilution effect of DNA fragments and wt DNA. Genescan and TaqMan assay were optimized to detect EGFR mutations in peripheral blood samples using PNA probe to inhibit the amplification of wt alleles. We performed analytical validation (detection limit, minimum amount of mutated DNA necessary for detection, sensitivity, specificity and repeatability of techniques) and clinical validation (treatment response, survival and PFS of EGFR mutated patients in peripheral blood samples from the SLADB and EURTAC trials). The findings suggest that GeneScan and TaqMan assay are feasible means of determining EGFR mutational status in formalin fixed paraffin embedded tissue and peripheral blood samples of advanced NSCLC patients. The results obtained agree closely with those described in the literature.

Las bases genéticas de la adaptación ecológica han sido investigadas durante muchos años mediante la exploración de regiones particulares del genoma tales como las reordenaciones cromosómicas, los polimorfismos morfológicos o las aloenzimas. El poder cada vez más apreciado de la genómica comparativa y el creciente número de genomas secuenciados ofrecen la oportunidad de comprender como se relacionan la evolución molecular, la adaptación y la variación fenotípica. Los cambios adaptativos han sido atribuidos a diferentes factores genómicos incluyendo (i) cambios en las regiones codificadoras de los genes; (ii) ganancia o pérdida de genes funcionales; (iii) alteraciones en la regulación de la expresión génica; (iv) actividad asociada a los elementos transponibles; y (v) reordenaciones cromosómics. En este trabajo nos hemos centrado en el valor adaptativo de dos factores genómicos: las inversiones cromosómicas y los genes sometidos a selección positiva. En primer lugar se investigaron siete inversiones fijadas en el cromosoma 2 de D. mojavensis, una especie cactófila que vive bajo condiciones ecológicas extremas. Diferentes mecanismos son responsables de la generación de estas inversiones, incluyendo la recombinación ectópica entre elementos transponibles y la rotura y reparación por unión de extremos no homólogos (NHEJ). Asimismo se identificaron importantes alteraciones génicas en algunas regiones asociadas a los puntos de rotura. En segundo lugar se compararon los genomas de dos especies cactófilas, D. buzzatii y D. mojavensis, con tal de caracterizar los patrones de divergencia de los genes codificantes entre dos especies con una ecología bien definida. Para cumplir con estos objetivos, el genoma de D. buzzatii fue secuenciado y anotado. Además se analizó el perfil de expresión génica a lo largo del desarrollo de D. buzzatii usando experimentos basados en la tecnología del RNAseq. Finalmente, mediante el uso de modelos de sustitución de codones se detectaron más de 1000 genes codificantes bajo selección positiva, probablemente indicativos de evolución adaptativa. / The genetic basis of ecological adaptation has been long investigated by exploring particular regions of the genomes, like chromosomal rearrangements, morphological polymorphisms or allozymes. The increasingly appreciated power of comparative genomics and the explosive number of sequenced genomes have offered the opportunity to better understand how molecular evolution relates to adaptation and phenotypic variation at the organismic level. Adaptive changes have been attributed to different genomic features including (i) changes in the coding sequences of the genes; (ii) gain or loss of functional genes; (iii) alterations of gene expression regulation; (iv) TE activity; and (v) chromosomal rearrangements. In this work we have focused on the adaptive value of two genomic features: chromosomal inversions and genes evolving under positive selection. We first investigated seven inversions fixed in chromosome 2 of D. mojavensis, a cactophilic species that lives under extreme ecological conditions. Different mechanisms were found responsible for their generation, including TE-mediated ectopic recombination and breakage and repair by NHEJ. In addition important gene alterations were identified at some of the breakpoint regions, suggesting that natural selection was the main force driving the fixation of these inversions. Secondly we compared the genomes of two cactophilic flies, D. buzzatii and D. mojavensis, in order to characterize the patterns of protein-coding gene divergence between two species with a well-defined ecology. To accomplish this objective the genome of D. buzzatii was sequenced and annotated. Furthermore, we provided an overview of the transcriptional profile along the D. buzzatii development using RNAseq-based experiments. By using codon substitution models we have detected more than 1000 protein-coding genes evolving under positive selection, likely indicative of adaptive evolution.